CN114324865A - 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用。本发明制备试剂盒中使用的肌酸激酶同工酶抗体为单克隆抗体，亲和力高、特异性好，检测准确度更优；本发明制备得到的试剂盒可以配套全自动化学发光仪使用，实现高通量，且检测时间短，可以在15min内完成对肌酸激酶同工酶的检测。采用本发明制备得到的试剂盒进行CK‑MM检测，检测准确度更高，检测时间更短。

Description

一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用。

背景技术

肌酸激酶(CK)是与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP的再生有关的能量代谢的关键酶，肌酸激酶同工酶是由M亚基和B亚基以不同方式组合成的二聚体，在细胞质内共有3种同工酶：CK-MM、CK-MB、CK-BB；其中CK-BB存在于脑组织中，CK-MM和CK-MB存在于各种肌肉组织中，不同肌肉组织同工酶的比例不同，骨骼肌中98％～99％是CK-MM，1％-2％是CK-MB；心肌内80％左右也是CK-MM，但CK-MB占心肌总CK的15％～25％。

进行性肌营养不良症是一组遗传性骨骼肌变性疾病，病理上以骨骼肌纤维变性、坏死为主要特点，临床上以缓慢进行性发展的肌肉萎缩、肌无力为主要表现。一般分类包含：假肥大型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、眼咽型肌营养不良、眼型肌营养不良、远端型肌营养不良和先天性肌营养不良。按照遗传方式可分为性连锁隐性遗传型、常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传型。又称抗肌萎缩蛋白缺陷型肌营养不良，分为Duchenne型(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和Becker型(Becker muscular dystrophy,BMD)，其他因抗肌萎缩蛋白缺陷引起的肌病包括X连锁扩张型心肌病、肌痛肌痉挛综合征、女性肌营养不良症等。

研究表明，进行性肌营养不良症(DMD或BMD)出现时，CK总酶活性显著增高，而以CK-MM为主。CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者，其特异性强。与CK总酶比较，CK-MM亚型是相对稳定的指标，且CK-MM亚型的改变不受CK总酶活性高低的影响。因此肌型肌酸激酶同工酶(CK-MM)可作为重要的诊断标志物，CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者。

磁微粒化学发光法是酶标记免疫分析技术，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，提高了反应体系中的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于免疫层系方法和ELISA方法，准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；相比于板式化学发光法，具有重复性好、检测速度快，检测时间短等优势。磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用。

第一方面，本发明提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，所述肌酸激酶同工酶检测试剂盒包括抗试剂和磁微粒试剂；所述抗试剂的制备中，以质量比计，肌酸激酶同工酶抗体：异硫氰酸荧光素为1:1～1:2；碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体为1:1～1:3。

在本发明提供的制备方法中，所述肌酸激酶同工酶抗体为CKMM鼠单克隆配对抗体，(克隆号：M2351、M2378)。经过实验筛选，兔多克隆抗体、羊多克隆抗体、兔单抗，试剂性能最好的是鼠单抗，灵敏度高、特异性好，批间差小。

在本发明提供的制备方法中，所述抗试剂中，以体积比计，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体的比例为1:1～1:2。

在本发明提供的制备方法，所述磁微粒试剂的制备包括：羧基磁珠浓缩液在磁场内放置，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，加入羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗；将反应容器置于磁场中吸去上清；重复清洗羧基磁珠，加入磁微粒缓冲液，调整羧基磁珠溶液的浓度为10～60mg/mL。

在本发明的制备方法中，校准品缓冲液为100mM PBS缓冲液、2-5mM氯化镁、155mM氯化钠、5-20％BSA和0.1％防腐剂proclin300；pH为7.40±0.05。

在本发明提供的制备方法中，在调整羧基磁珠溶液浓度为10～60mg/mL后，加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在16～28℃内保持混匀状态反应15～18小时；加入5～10％体积的封闭剂搅拌2～4小时，完全封闭。

在本发明提供的制备方法中，以质量比计，羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的比例为(90～110):1。

在本发明提供的制备方法中，所述磁微粒缓冲液的制备为，10～20mM的MES，5～9g的氯化钠，加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。

在本发明提供的制备方法中，所述封闭剂为1～2％酪蛋白溶液。

第二方面，本发明提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，采用上述的制备方法，制备得到。

具体地，本发明提供一种用磁微粒化学发光法检测肌酸激酶同工酶含量的试剂盒，所提供的试剂盒由抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、校准品和质控品组成。

其中，抗试剂为：异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体偶联，与碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体偶联的混合物。磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成。发光底物液是将AMPPD溶解于发光底物缓冲液中制成。

本发明提供的试剂盒还包括清洗液，清洗液由160g氯化钠、4g氯化钾、24.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mL吐温20溶于900mL纯化水中，用HCl调整至pH：7.4，用纯化水定容至1000mL配制而成。

具体地，本发明提供的试剂盒的制备方法为，分别配制的肌酸激酶同工酶校准品、肌酸激酶同工酶质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物液包装在试剂盒内，得到肌酸激酶同工酶的测定试剂盒。

校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂按照如下方法配制而成：

A、校准品、质控品的配制：

校准品、质控品缓冲液用于稀释CKMM抗原，包含：100mM PBS缓冲液、2-5mM氯化镁、155mM氯化钠、5-20％BSA、0.1％防腐剂proclin300，PH：7.40±0.05，用纯化水定容，充分搅拌混匀，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成。

按规定浓度配制成校准品，含有6个A、B、C、D、E、F浓度点，校准品A为零浓度，校准品B、C、D、E、F含有系列浓度梯度的肌酸磷酸激酶；校准品溯源至标准物质GBW09167。A、B、C、D、E、F浓度分别为0,20,100,500,2500,10000IU/mL。

质控品为其中的C、E浓度点：100、2500IU/mL。

B、抗试剂的配制：

(1)抗试剂缓冲液的制备：

所述缓冲溶液为PBS体系，pH值为6～8；容器中加入约50％纯化水，依次加入10～20g的Na₂HPO₃·12H₂O、1～2g的NaH₂PO₃·12H₂O搅拌完全溶解，再加入1～5g的绵羊血清、3～10g的新生牛血清，加入0.01～0.05％叠氮钠或proclin300作为防腐剂，充分搅拌至完全溶解，制得抗试剂缓冲液；

(2)异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体偶联，制备异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体溶液：

用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～6.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照质量比为肌酸激酶同工酶抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1～1:2在容器中搅拌，充分混匀；再用pH为8～9的碳酸盐缓冲液调节pH值。标记完成后，使用分子凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体；

(3)碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体：

用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，抗体和碱性磷酸酶按照比例混合，加入活化剂促使酶与抗体偶联反应：碱性磷酸酶与抗体比例1:1～1:3。充分反应后,使用pH为8～9的Tris缓冲液平衡凝胶柱，分子凝胶柱进行分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体；筛选出效果最优的分子片段进行测试；

将(2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体，和(3)中获得的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合按体积1:1～1:2之间的比例混合，加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、thesit中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01～0.2％。

C、磁微粒试剂的制备：

(1)取0.5～3μm混匀后的羧基磁珠浓缩液与反应容器中，将该反应容器在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应容器中加入相当于反应容器中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应容器置于磁场中5～10min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10～60mg/mL，混匀待用。所述磁微粒缓冲液的制备：10～20mM的MES，5～9g的氯化钠，加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得；

(2)偶联抗体：

步骤(1)复悬的磁微粒溶液，加入活化剂，充分搅拌混匀15～20min，在磁场中静置5～10min，吸出上清液。加入偶联缓冲液复悬磁性微粒，充分搅拌，按照质量比，羧基磁珠：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例，在羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在16～28℃内保持混匀状态反应15～18小时；加入5～10％体积的封闭剂搅拌2～4小时，完全封闭。偶联缓冲液为磷酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸的一种或几种；封闭剂为1～2％酪蛋白溶液。

(3)反应容器在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，使用缓冲液对磁性微球溶液进行稀释，浓度为0.8～1.2mg/ml。制得所需待用磁微粒试剂。

本步骤中的缓冲液为10～20mM磷酸盐缓冲液含0.01％的吐温-20、0.5％的牛血清白蛋白、1.0％酪蛋白和0.01％叠氮钠，pH值为7.4。

D、发光底物液的制备：

发光底物为含有:3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)及其衍生物的缓冲液。

E、清洗液的制备：

将160g氯化钠、4g氯化钾、24.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mL吐温20溶于900mL纯化水中，用HCl调整至pH：7.4，用纯化水定容至1000mL配制而成。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒在提高肌酸激酶同工酶检测灵敏度和检测速度中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明是用磁微粒酶促化学发光法检测血清样本中的肌酸激酶同工酶CK-MM,结合免疫学中双抗体夹心法与磁微粒标记技术，将双抗体夹心的免疫复合物结合在抗异硫氰酸荧光素抗体标记的磁珠上，加入发光底物液反应产生信号。该试剂盒具有准确度好、灵敏度高、线性范围宽、检测速度快等优点，为临床诊断提供一种非常有价值的检测方法。

(2)本发明试剂盒中使用的肌酸激酶同工酶抗体为鼠单克隆配对抗体，与多克隆抗体比较，亲和力高、特异性好，检测准确度更优。

(3)本发明试剂盒的配套全自动化学发光仪使用，可实现高通量，且检测时间短，可以在15min内完成对肌酸激酶同工酶的检测。

附图说明

图1为本发明中相关性实验结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用抗体为CKMM鼠单克隆配对抗体(克隆号：M2351、M2378)

本发明所用磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化镁等无机盐为西陇化工股份有限公司、抗体及碱性磷酸酶活化剂为ThermoFisher公司。

本发明所用磁微粒的生产厂家为：JSR公司。

实施例1

本实施例提供用磁微粒化学发光法检测肌酸激酶同工酶含量的试剂盒及其制备方法，步骤如下：

A、校准品、质控品的配制：

校准品、质控品稀释液用于稀释CKMM抗原，包含：100mM PBS缓冲液、2-5mM氯化镁、155mM氯化钠、5-20％BSA、0.1％防腐剂proclin300，pH：7.40±0.05，用纯化水定容，充分搅拌混匀，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成。

按规定浓度配制成校准品，含有6个A、B、C、D、E、F浓度点，校准品A为零浓度，校准品B、C、D、E、F为含有系列浓度梯度的肌酸磷酸激酶；校准品溯源至标准物质GBW09167。A、B、C、D、E、F浓度分别为0,20,100,500,2500,10000IU/mL。

质控品为其中的C、E浓度点：100、2500IU/mL。

B、抗试剂的配制：

(1)抗试剂缓冲液的制备：

所述缓冲溶液为PBS体系，pH值为6.5；容器中加入约50％纯化水，依次加入10g～20g的Na₂HPO₃·12H₂O、1～2g的NaH₂PO₃·12H₂O搅拌完全溶解，再加入1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、0.01g～0.05g的链霉素、0.01％叠氮，充分搅拌至完全溶解，制得抗试剂缓冲液；

(2)异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体(M2351)偶联，制备异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体：

用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为3.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照质量比为肌酸激酶同工酶抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.5在容器中搅拌，充分混匀；再用pH为8.5的碳酸盐缓冲液调节pH值至8.00。标记完成后，使用分子凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体；

(3)碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体(M2378)偶联，获得碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体：

用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，抗体和碱性磷酸酶按照摩尔比1:2混合，加入活化剂促使酶与抗体偶联反应。充分反应后,使用pH为8.6的Tris缓冲液平衡凝胶柱，分子凝胶柱进行分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体；筛选出效果最优的分子片段进行测试；

将(2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体，和(3)中获得的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合按体积1:1混合，加入20mM PBS缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂，缓冲液中表面活性剂含量为0.01％的Tween20。

C、磁微粒试剂的制备：

(1)取0.5～3μm混匀后的羧基磁珠浓缩液与反应容器中，将该反应容器在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应容器中加入相当于反应容器中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20min；再将反应容器置于磁场中5～10min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到30mg/mL，混匀待用。磁微粒缓冲液：10mM的PBS。

(2)偶联抗体：

将步骤(1)复悬的磁微粒溶液，加入活化剂N-羟基丁二酰亚胺，终浓度0.6mM，充分搅拌混匀15～20min，在磁场中静置5～10min，吸出上清液。加入偶联缓冲液复悬磁性微粒，充分搅拌混匀。按照质量比羧基磁珠：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例，在羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在16～28℃内保持混匀状态反应15～18小时；加入5％体积的封闭剂，搅拌2小时，至完全封闭。偶联缓冲液为20mM磷酸缓冲液、封闭剂为2％酪蛋白溶液。

(3)反应容器在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存。使用缓冲液对磁性微球溶液进行稀释，浓度为1.0mg/ml。制得所需待用磁微粒试剂。

本步骤中的缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液含0.01％的吐温-20、0.5％的牛血清白蛋白、1.0％酪蛋白和0.01％叠氮钠，pH值为7.4。

D、发光底物液的制备：

发光底物为含有:3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)及其衍生物的缓冲液。

E、清洗液的制备：

将160g氯化钠、4g氯化钾、24.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mL吐温20溶于900mL纯化水中，用HCl调整至pH：7.4，用纯化水定容至1000mL配制而成。

实施例2

用制备完成的试剂盒(包含组分：抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、校准品、质控品)，在全自动化学发光检测仪上进行性能测试。

(1)准确度：测定企业参考品，测值与理论值的偏倚在±10％范围内，符合要求，结果见表1。

表1准确度检测结果

(2)重复性

本实施例得到的试剂盒的重复性好，CV≤8％，结果见表2。

表2重复性结果

(3)测值相关性，本试剂盒与市售试剂同时检测临床样本100例，分析测值相关性，结果见图1，相关系数R≥0.990。

(4)最低检出限

测定样本稀释液20次，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为试剂盒的最低检测限。

计算得到本发明提供试剂盒的最低检出限为0.80IU/L。

(5)本发明提供试剂盒的线性检测范围：3～10000IU/L。

实施例3异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体比例及碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体的比例对试剂性能影响

本实施例提供在制备过程中，抗体溶液1中异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体(M2351)的比例、抗体溶液2中碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体(M2378)的比例，对试剂盒的检测准确度及检测限的影响，结果如下：

试验组1中，抗体溶液1中异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体(M2351)的比例为FITC:CKMM-mAb(M2351)＝1.5：1、抗体溶液2中碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体(M2378)的比例为：ALP:CKMM-mAb(M2378)＝2:1，检测准确度及检测限见表3。

试验组2中，抗体溶液1中异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体(M2351)的比例为FITC:CKMM-mAb(M2351)＝10：1、抗体溶液2中碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体(M2378)的比例为：ALP:CKMM-mAb(M2378)＝5:1，检测准确度及检测限见表4。

试验组3中，抗体溶液1中异硫氰酸荧光素与肌酸激酶同工酶抗体(M2351)的比例为FITC:CKMM-mAb(M2351)＝15：1、抗体溶液2中碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体(M2378)的比例为：ALP:CKMM-mAb(M2378)＝10:1，检测准确度及检测限见表5。

表3试验组1

表4试验组2

表5试验组3

从表3-5的数据可以看出结果最好的是试验组1中的比例。

实施例4异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合比例

本实施例提供，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体不同混合比例时，试剂盒的分析灵敏度结果：

试验组1中，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合比例为1:1，试剂分析灵敏度见表6。

试验组2中，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合比例为1:3，试剂分析灵敏度见表6。

试验组3中，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶标记抗体混合比例为3:1，试剂分析灵敏度见表6。

表6分析灵敏度结果

从表6的结果，可以看出试验组1的结果最优。

实施例6不同校准品缓冲液对试剂性能影响

本实施例提供在试剂盒制备中，校准品缓冲液对检测效果的影响。

试验组1中，缓冲液：PBS缓冲液100mM、2mM氯化镁、155mM氯化钠、20％BSA、0.1％防腐剂proclin300，pH：7.40±0.05。配制完成用0.22μm过滤膜过滤，放置于37度恒温箱72小时，稳定平衡。

试验组2中，缓冲液：Tris缓冲液100mM、5mM氯化镁、155mM氯化钠、15％BSA、0.2％封闭剂M1220、1％防腐剂proclin300。配制完成用0.22μm过滤膜过滤。

试验组3中，缓冲液：PBS缓冲液100mM、2mM氯化镁、155mM氯化钠、15％BSA、1％酪蛋白、0.1％防腐剂proclin30。配制完成用0.22μm过滤膜过滤。

三种缓冲液配制的校准品，试剂定标结果见表7：

表7定标结果

其中试验组1的A点发光值最低，即本底最低。试剂分别用3种定标结果，测试临床样本107例(含低中高值)，结果分布如表8：

表8测值结果

其中2、3组结果中＜0IU/L的值的样本占比分别为17.76％、19.63％，1组中没有出现＜0IU/L的值。校准品缓冲液的类型、组分及处理方式，对A点的发光值影响明显。如果A点发光值高，临床样本低值会出现大量负值，极大的影响试剂测试结果。本方案通过实验确定最适校准品缓冲液组分、pH值、并经过37度恒温放置，平衡稳定处理后，极大的改善了试剂本底偏高，测试临床低值样本出现大量负值的问题。

实施例7不同来源的肌酸激酶同工酶抗体

本实施例提供在试剂盒制备中，使用不同肌酸激酶同工酶抗体时的试剂盒的检测效果。分析灵敏度影响。

试验组1中，异硫氰酸荧光素和碱性磷酸酶分别标记的抗体为：肌酸激酶同工酶抗体鼠单克隆配对抗体(克隆号：M2351、M2378)。

试验组2中，异硫氰酸荧光素和碱性磷酸酶分别标记的抗体为：肌酸激酶同工酶抗体为兔单克隆抗体(克隆号：N121、M127)。分析灵敏度测试结果如表9。

表9分析灵敏度

从表9的结果可以看出，试验组1使用鼠单克隆配对抗体结果最好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶检测试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂和磁微粒试剂；所述抗试剂的制备中，以质量比计，肌酸激酶同工酶抗体：异硫氰酸荧光素为1:1～1:2；碱性磷酸酶与肌酸激酶同工酶抗体为1:1～1:3。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肌酸激酶同工酶抗体为CKMM鼠单克隆配对抗体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述抗试剂中，以体积比计，异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体的比例为1:1～1:2。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，校准品缓冲液为100mM PBS缓冲液、2-5mM氯化镁、155mM氯化钠、5-20％BSA和0.1％防腐剂proclin300；pH为7.40±0.05。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备包括：羧基磁珠浓缩液在磁场内放置，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，加入羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗；将反应容器置于磁场中吸去上清；重复清洗羧基磁珠，加入磁微粒缓冲液，调整羧基磁珠溶液的浓度为10～60mg/mL。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在调整羧基磁珠溶液浓度为10～60mg/mL后，加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在16～28℃内保持混匀状态反应15～18小时；加入5～10％体积的封闭剂搅拌2～4小时，完全封闭。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，以质量比计，羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体的比例为(90～110):1。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，封闭剂为1～2％酪蛋白溶液。

9.一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的制备方法，制备得到。

10.权利要求9所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒在提高肌酸激酶同工酶检测灵敏度和速度中的应用。

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