CN111781362A - 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111781362A
CN111781362A CN202010649241.4A CN202010649241A CN111781362A CN 111781362 A CN111781362 A CN 111781362A CN 202010649241 A CN202010649241 A CN 202010649241A CN 111781362 A CN111781362 A CN 111781362A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
creatine kinase
buffer solution
magnetic particle
kinase isoenzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010649241.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张雪芹
谢清华
甘宜梧
赵凤
郭宣城
包兴艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Biobase Diagnosis Technology Co ltd
Original Assignee
Shandong Biobase Diagnosis Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Biobase Diagnosis Technology Co ltd filed Critical Shandong Biobase Diagnosis Technology Co ltd
Priority to CN202010649241.4A priority Critical patent/CN111781362A/zh
Publication of CN111781362A publication Critical patent/CN111781362A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9123—Phosphotransferases in general with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3), e.g. histidine kinases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；所述抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和由碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1混合而成的溶液。本发明结果准确、特异性强、灵敏度高、检测时间短、使用方便。

Description

肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
肌酸激酶(CK)是与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP的再生有关的能量代谢的关键酶，肌酸激酶同工酶是由M亚基和B亚基以不同方式组合成的二聚体，在细胞质内共有3种同工酶：CK-MM、CK-MB、CK-BB；MM型主要来自骨骼肌；MB型主要来自心肌；BB型主要存在于脑、神经组织的胶质细胞和神经元中。肌酸激酶同工酶作为诊断疾病的指标之一，近年来越来越受到广泛的重视，尤其是在心血管疾病中，肌酸激酶同工酶(CK-MB)更是有着非比寻常的地位。实验证明，CK-MB质量和活性在心脏类疾病的诊断中都很敏感。
血清CK-MB测定的最重要意义在于诊断急性心肌梗塞。急性心肌梗塞胸痛发作后4～6小时，病人血清CK-MB先于总活性开始升高，12～36小时达峰值；多在72小时内恢复正常，其最高值达对照组4.9～22倍以上。如果梗塞后3～4天，CK-MB仍持续不降，表明心肌梗塞仍在继续进行，如果已下降的CK-MB再次升高则提示原梗塞部位病变扩展或有新的梗塞病灶；如果胸痛患者在48小时内尚未出现CK-MB升高，或小于总活性的2倍，即可排除急性心肌梗塞的诊断。
流行病学调查发现，约有25％的心肌梗死(AMI)患者早期可以没有典型的临床症状，约有30％的心肌梗死(AMI)患者缺乏心电图的特异改变，在这种情况下，心肌损伤标志物的准确检测在诊断AMI时尤为重要。
磁微粒化学发光法是酶标记免疫分析技术的新发展，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于胶体金法及ELISA方法，具有准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；相比于板式化学发光法，具有重复性好、灵敏度高，检测速度快，检测时间短等优势。目前磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。
目前肌酸激酶同工酶的检测方法主要有酶联免疫法、生化法、板式化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更快速、灵敏度更高的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明提供一种结果准确、特异性强、灵敏度高、检测时间短、使用方便的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一种肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，
所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；
所述抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和由碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1混合而成的溶液。
进一步的，所述磁微粒试剂的制备步骤为：
步骤1：对粒径为0.5～3μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30～40min后在磁场中静置1～3min，之后吸出上清液，使用缓冲液清洗三次，并进行悬浮，获得浓度为20～60mg/mL的第一溶液；
步骤2：向所述第一溶液内加入羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌2～5h后在磁场中静置2～6min，吸出上清液，之后加入缓冲液并在37℃下搅拌封闭2～6小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3～5次，并用含有缓冲液配制成8～12mg/mL的磁性微球初溶液；
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为0.8～2.0mg/ml。
进一步的，所述磁微粒试剂的制备步骤1中使用的缓冲液为PH＝5.5～6.5的柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或多种；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤2中的缓冲液为含有质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白、PH＝7～8的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤3中的缓冲液为体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、含质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤4中的缓冲液为含体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、质量体积分数0.5-1.0％牛血清白蛋白、1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液。
进一步的，所述异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备步骤为：
使用缓冲液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
使用缓冲溶液对异硫氰酸荧光素进行溶解，制成异硫氰酸荧光素溶液，使异硫氰酸荧光素溶液的浓度为2-5mg/ml；
将质量比为100ug:1mg～200ug:1mg的肌酸激酶同工酶抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液混合均匀，并避光反应过夜，之后加NH4Cl终止反应，制成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离，之后使用抗试剂缓冲液进行稀释，得到浓度为1.5～3.0μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体。
进一步的，所述碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备步骤为：
使用缓冲液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
使用缓冲溶液对碱性磷酸酶进行溶解，制成碱性磷酸酶溶液，使碱性磷酸酶溶液的浓度为2-4mg/ml；
将摩尔比为1:1～2:1的肌酸激酶同工酶抗体溶液和碱性磷酸酶溶液混合均匀，并加入赖氨酸溶液，反应过夜，制成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离，之后使用抗试剂缓冲液进行稀释，得到浓度为1.0～2.0μg/ml的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。
进一步的，所述抗试剂缓冲液的组分及含量为：
Figure BDA0002574285060000041
进一步的，所述校准品和质控品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解肌酸激酶同工酶，得到0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL和1000ng/mL的校准品以及25ng/mL、250ng/mL的质控品，其中，所述校准品缓冲液的成分及浓度如下：
Figure BDA0002574285060000042
进一步的，所述发光底物为含有(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物的缓冲溶液。
进一步的，所述检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的组分及含量为：
Figure BDA0002574285060000051
一种如上述任一所述的试剂盒作为体外诊断试剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明是将双抗体夹心法免疫测定原理与磁性微球标记技术和酶催化化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，同时将异硫氰酸荧光素体系与磁微粒体系相结合，为反应提供了一种近乎于均相的反应，使试剂盒具有简便、快速、灵敏、线性范围宽等优点，且各项指标均达到同类试剂盒的分析法水平，为临床诊断提供一种非常有价值的检测手段；
2、由于本发明试剂盒中所采用的肌酸激酶同工酶抗体为单克隆抗体，比多克隆抗体相比，特异性更强；
3、本发明试剂盒的准确程度优于目前市场上其它类型的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，检测时间短，可以在15min内完成对肌酸激酶同工酶的检测。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
需要说明的是，实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各仪器设备也是所属领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1
本实施例的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒包括磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品和发光底物。
1、磁微粒试剂的配置如下：
步骤1：采用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺对粒径为0.5μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30min后在磁场中静置1min，之后吸出上清液，使用PH＝5.5、浓度为0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液清洗三次，并进行悬浮，获得浓度为20mg/mL的第一溶液；
步骤2：向每mL的第一溶液内加入100ug羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌2h后在磁场中静置2min，吸出上清液，之后加入含有质量体积分数为1.0％酪蛋白的PH值为7.4，浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液并在37℃下搅拌封闭2小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3次，并用缓冲液配制成8mg/mL的磁性微球初溶液；
本步骤中的缓冲液为pH值为7.4、含体积分数为0.01％的吐温-20、质量体积分数为1.0％酪蛋白和0.01％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为0.8mg/ml。
本步骤中的缓冲液为pH值为7.4、含体积分数为0.01％的吐温-20、质量体积分数0.5％的牛血清白蛋白、1.0％酪蛋白和0.01％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
2、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
将需偶联的肌酸激酶同工酶抗体用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为兔源的单克隆抗体。
使用含有DMSO的缓冲溶液将异硫氰酸荧光素溶解为2mg/ml的溶液，现用现配，避光，制成异硫氰酸荧光素溶液；
将肌酸激酶同工酶抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液按照100ug:1mg的比例混合均匀，并避光反应过夜，加NH4Cl终止反应，制成混合溶液；
使用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为1.5μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体。
2)所述的碱性磷酸酶(AP)标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
使用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为兔源的单克隆抗体。
使用含有戊二醛的PBS缓冲溶液将碱性磷酸酶溶解为2mg/ml，现用现配，避光；
将肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶溶液按照摩尔比1:1的比例混合均匀并加入赖氨酸溶液，反应过夜，制成混合溶液；
采用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为1.0μg/ml的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。
3)将步骤1)中所得异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与步骤2)中所得碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体分别使用抗试剂缓冲液进行稀释，其中异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1的比例进行混匀，并用0.22μm滤膜进行过滤即制得肌酸激酶同工酶抗体的抗试剂；
4)所述抗试剂缓冲液的成分及浓度为：
Figure BDA0002574285060000071
3、校准品和质控品的制备
使用校准品缓冲液溶解肌酸激酶同工酶，配置成如表1所示的目标浓度的校准品和质控品。
表1校准品和质控品的浓度
Figure BDA0002574285060000072
Figure BDA0002574285060000081
其中，校准品缓冲液的成分及浓度如下：
Figure BDA0002574285060000082
4、清洗液的组分及含量如下：
Figure BDA0002574285060000083
5、发光底物为含有(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物的缓冲液。
6、将上述磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒。
实施例2：
本实施例的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒包括磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品和发光底物。
1、磁微粒试剂的配置如下：
步骤1：采用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺对粒径为1.5μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30min后在磁场中静置3min，之后吸出上清液，使用PH＝6.0、浓度为0.3mol/L的柠檬酸钠缓冲液清洗三次，并进行悬浮，获得浓度为40mg/mL的第一溶液；
步骤2：向每mL的第一溶液内加入150ug羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌4h后在磁场中静置3min，吸出上清液，之后加入含有质量体积分数为1.5％酪蛋白的PH值为7.9，浓度为0.3mol/L的磷酸缓冲液并在37℃下搅拌封闭4小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3次，并用缓冲液配制成10mg/mL的磁性微球初溶液；
本步骤中的缓冲液为pH值为7.9、含体积分数为0.05％的吐温-20、质量体积分数为1.5％酪蛋白和0.03％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为1.25mg/ml。
本步骤中的缓冲液为pH值为7.9、含体积分数为0.05％的吐温-20、质量体积分数0.8％的牛血清白蛋白、1.5％酪蛋白和0.03％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
2、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
将需偶联的肌酸激酶同工酶抗体用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为兔源的单克隆抗体。
使用含有DMSO的缓冲溶液将异硫氰酸荧光素溶解为3mg/ml的溶液，现用现配，避光，制成异硫氰酸荧光素溶液；
将肌酸激酶同工酶抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液按照150ug:1mg的比例混合均匀，并避光反应过夜，加NH4Cl终止反应，制成混合溶液；
使用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为2.0μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体。
2)所述的碱性磷酸酶(AP)标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
使用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为兔源的单克隆抗体。
使用含有戊二醛的PBS缓冲溶液将碱性磷酸酶溶解为3mg/ml，现用现配，避光；
将肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶溶液按照摩尔比1.5:1的比例混合均匀并加入赖氨酸溶液，反应过夜，制成混合溶液；
采用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为1.5μg/ml的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。
3)将步骤1)中所得异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与步骤2)中所得碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体分别使用抗试剂缓冲液进行稀释，其中异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1的比例进行混匀，并用0.22μm滤膜进行过滤即制得肌酸激酶同工酶抗体的抗试剂；
4)所述抗试剂缓冲液的成分及浓度为：
Figure BDA0002574285060000101
3、校准品和质控品的制备
使用校准品缓冲液溶解肌酸激酶同工酶，配置成如表2所示的目标浓度的校准品和质控品。
表2校准品和质控品的浓度
Figure BDA0002574285060000102
其中，校准品缓冲液的成分及浓度如下：
Figure BDA0002574285060000103
Figure BDA0002574285060000111
4、清洗液的组分及含量同实施例1。
5、发光底物同实施例1。
6、将上述磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒。
实施例3
本实施例的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒包括磁微粒试剂、抗试剂、校准品、质控品和发光底物。
1、磁微粒试剂的配置如下：
步骤1：采用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺对粒径为3μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30min后在磁场中静置3min，之后吸出上清液，使用PH＝6.5、浓度为0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液清洗三次，并进行悬浮，获得浓度为60mg/mL的第一溶液；
步骤2：向每mL的第一溶液内加入200ug羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌5h后在磁场中静置6min，吸出上清液，之后加入含有质量体积分数为2.0％酪蛋白的PH值为7.9，浓度为0.5mol/L的磷酸缓冲液并在37℃下搅拌封闭6小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3次，并用缓冲液配制成12mg/mL的磁性微球初溶液；
本步骤中的缓冲液为pH值为7.9、含体积分数为0.1％的吐温-20、质量体积分数为2.0％酪蛋白和0.05％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为2.0mg/ml。
本步骤中的缓冲液为pH值为7.9、含体积分数为0.1％的吐温-20、质量体积分数1.0％的牛血清白蛋白、2.0％酪蛋白和0.05％叠氮钠的磷酸盐缓冲液。
2、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
将需偶联的肌酸激酶同工酶抗体用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为鼠源的单克隆抗体。
使用含有DMSO的缓冲溶液将异硫氰酸荧光素溶解为5mg/ml的溶液，现用现配，避光，制成异硫氰酸荧光素溶液；
将肌酸激酶同工酶抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液按照200ug:1mg的比例混合均匀，并避光反应过夜，加NH4Cl终止反应，制成混合溶液；
使用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为2.6μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体。
2)所述的碱性磷酸酶(AP)标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备方法为：
使用PH＝9.6的碳酸氢钠缓冲溶液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
其中，肌酸激酶同工酶抗体为兔源的单克隆抗体。
使用含有戊二醛的MES缓冲溶液将碱性磷酸酶溶解为4mg/ml，现用现配，避光；
将肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶溶液按照摩尔比2:1的比例混合均匀并加入赖氨酸溶液，反应过夜，制成混合溶液；
采用凝胶层析分离柱分离即可得到浓度为2.0μg/ml的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。
3)将步骤1)中所得异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与步骤2)中所得碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体分别使用抗试剂缓冲液进行稀释，其中异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体与碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1的比例进行混匀，并用0.22μm滤膜进行过滤即制得肌酸激酶同工酶抗体的抗试剂；
4)所述抗试剂缓冲液的成分及浓度为：
Figure BDA0002574285060000131
3、校准品和质控品的制备
使用校准品缓冲液溶解肌酸激酶同工酶，配置成如表3所示的目标浓度的校准品和质控品。
表3校准品和质控品的浓度
Figure BDA0002574285060000132
其中，校准品缓冲液的成分及浓度如下：
Figure BDA0002574285060000133
4、清洗液的组分及含量同实施例1。
5、发光底物同实施例1。
6、将上述校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒。
上述实施例1-3的检测试剂盒的使用方法如下：
(1)使用方法
a、将在冷藏环境中贮存的试剂盒室温平衡(15分钟以上)；
b、将清洗液按1:15的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
c、将肌酸激酶同工酶校准品、质控品及待测样本置于相应反应孔内，并在全自动化学发光仪完成相关测定参数的设定。
Figure BDA0002574285060000141
(2)数据处理
根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线。最后根据标准曲线即可计算出样本中CK-MB的浓度。
(3)结果分析
正常人CK-MB含量：<7.0ng/mL
临床数据：
1、最低检测限(灵敏度)试验
对实施例1-3的试剂盒分别使用20孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为试剂盒的最低检测限。实施例1-3的试剂盒的最低检测限指标检测结果见表4-6。
表4实施例1的试剂盒最低检测限的测定结果
Figure BDA0002574285060000142
Figure BDA0002574285060000151
表5实施例2的试剂盒最低检测限的测定结果
Figure BDA0002574285060000152
表6实施例3的试剂盒最低检测限的测定结果
Figure BDA0002574285060000153
由表4-6可以看出，实施例1-3的试剂盒的灵敏度均<0.01ng/mL，符合国家标准要求。
2、线性相关性试验
复孔测定实施例1-3的试剂盒的校准品(A～F，浓度依次为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和1000ng/mL)，用四参数进行拟合，检测结果见表7-9。
表7实施例1的试剂盒剂量-反应曲线的线性相关性试验结果
Figure BDA0002574285060000154
Figure BDA0002574285060000161
表8实施例2的试剂盒剂量-反应曲线的线性相关性试验结果
Figure BDA0002574285060000162
表9实施例3的试剂盒剂量-反应曲线的线性相关性试验结果
Figure BDA0002574285060000163
由表7-9可以看出，实施例1-3的试剂盒测定的肌酸激酶同工酶剂量-反应曲线线性相关系数(r)均大于0.9900，符合国家标准要求。
3、准确度试验
使用实施例1-3的试剂盒分别检测浓度为10ng/mL和250ng/mL的校准品，每个浓度的校准品检测3次，计算测定结果的均值M，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)应不超过15.0％。本试剂盒的准确度检测结果见表10。
表10试剂盒的准确度试验结果
Figure BDA0002574285060000164
Figure BDA0002574285060000171
由表10可以看出，实施例1-3的试剂盒测定的浓度为10ng/mL和250ng/mL的校准品的实际浓度相对偏差均远远小于15％，符合国家标准。
4、试剂盒精密度试验
a、分析内精密度：使用实施例1-3的试剂盒分别对浓度为10ng/mL和250ng/mL的校准品进行重复检测，检测结果见表11。
表11试剂盒分析内精密度的测定
Figure BDA0002574285060000172
由表11可以看出，实施例1-3的试剂盒测定的10ng/mL和250ng/mL精密度校准品的分析内变异系数(CV)分均小于8.0％，符合国家标准要求。
b、批间精密度：对实施例1-3的试剂盒分别用3个批号的试剂盒检测浓度为10ng/mL和250ng/mL的校准品，各重复10次，检测结果见表12-14。
表12实施例1试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0002574285060000181
表13实施例2试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0002574285060000182
表14实施例3试剂盒批间精密度检测结果
Figure BDA0002574285060000191
由表12-14可以看出，实施例1-3的试剂盒测定的浓度为10ng/mL和250ng/mL精密度校准品的批间变异系数(CV)均小于15.0％，符合国家标准要求。
综上所述，本发明的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒在灵敏度、特异性等各项质量参数均处于领先地位。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，
所述磁微粒试剂为由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球；
所述抗试剂为由异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体和由碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体按照体积比1:1混合而成的溶液。
2.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备步骤为：
步骤1：对粒径为0.5～3μm的磁微粒进行活化，室温下搅拌30～40min后在磁场中静置1～3min，之后吸出上清液，使用缓冲液清洗，并进行悬浮，获得浓度为20～60mg/mL的第一溶液；
步骤2：向所述第一溶液内加入羊抗异硫氰酸荧光素抗体，在37℃下搅拌2～5h后在磁场中静置2～6min，吸出上清液，之后加入缓冲液并在37℃下搅拌封闭2～6小时，获得第二溶液；
步骤3：使用缓冲液对所述第二溶液进行清洗3～5次，并用含有缓冲液配制成8～12mg/mL的磁性微球初溶液；
步骤4：使用缓冲液对所述磁性微球初溶液进行稀释，制成磁微粒试剂，所述磁微粒试剂的浓度为0.8～2.0mg/ml。
3.根据权利要求2所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备步骤1中使用的缓冲液为PH＝5.5～6.5的柠檬酸钠缓冲液、醋酸钠缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或多种；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤2中的缓冲液为含有质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白、PH＝7～8的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤3中的缓冲液为体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、含质量体积分数为1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液；和/或者：
所述磁微粒试剂的制备步骤4中的缓冲液为含体积分数为0.01-0.1％的表面活性剂、质量体积分数0.5-1.0％牛血清白蛋白、1.0-2.0％酪蛋白和0.01-0.05％防腐剂的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备步骤为：
使用缓冲液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
使用缓冲溶液对异硫氰酸荧光素进行溶解，制成异硫氰酸荧光素溶液，使异硫氰酸荧光素溶液的浓度为2-5mg/ml；
将质量比为100ug:1mg～200ug:1mg的肌酸激酶同工酶抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液混合均匀，并避光反应过夜，之后加NH4Cl终止反应，制成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离，之后使用抗试剂缓冲液进行稀释，得到浓度为1.5～3.0μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的肌酸激酶同工酶抗体。
5.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体的制备步骤为：
使用缓冲液对需偶联的肌酸激酶同工酶抗体进行透析，制成肌酸激酶同工酶抗体溶液；
使用缓冲溶液对碱性磷酸酶进行溶解，制成碱性磷酸酶溶液，使碱性磷酸酶溶液的浓度为2-4mg/ml；
将摩尔比为1:1～2:1的肌酸激酶同工酶抗体溶液和碱性磷酸酶溶液混合均匀，并加入赖氨酸溶液，反应过夜，制成混合溶液；
对所述混合溶液进行分离，之后使用抗试剂缓冲液进行稀释，得到浓度为1.0～2.0μg/ml的碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶抗体。
6.根据权利要求4或5所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂缓冲液的组分及含量为：
Figure FDA0002574285050000021
Figure FDA0002574285050000031
7.根据权利要求6所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述校准品和质控品的制备方法为：采用校准品缓冲液溶解肌酸激酶同工酶，得到0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL和1000ng/mL的校准品以及25ng/mL、250ng/mL的质控品，其中，所述校准品缓冲液的成分及浓度如下：
Figure FDA0002574285050000032
8.根据权利要求6所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物为含有(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物的缓冲溶液。
9.根据权利要求6所述的肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的组分及含量为：
Figure FDA0002574285050000033
10.一种如权利要求1至9中任一所述的试剂盒作为体外诊断试剂的应用。
CN202010649241.4A 2020-07-08 2020-07-08 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用 Withdrawn CN111781362A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010649241.4A CN111781362A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010649241.4A CN111781362A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111781362A true CN111781362A (zh) 2020-10-16

Family

ID=72759629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010649241.4A Withdrawn CN111781362A (zh) 2020-07-08 2020-07-08 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111781362A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112557660A (zh) * 2020-12-09 2021-03-26 江苏泽成生物技术有限公司 一种磁微粒化学发光法her2检测试剂盒及制备方法
CN113311161A (zh) * 2021-04-14 2021-08-27 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN113777326A (zh) * 2021-09-13 2021-12-10 北京森美希克玛生物科技有限公司 一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用
CN117420313A (zh) * 2023-10-18 2024-01-19 安徽千诚生物技术有限公司 一种用于检测抗原的化学发光试剂盒及其制备、检测方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112557660A (zh) * 2020-12-09 2021-03-26 江苏泽成生物技术有限公司 一种磁微粒化学发光法her2检测试剂盒及制备方法
CN113311161A (zh) * 2021-04-14 2021-08-27 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN113311161B (zh) * 2021-04-14 2023-12-22 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
CN113777326A (zh) * 2021-09-13 2021-12-10 北京森美希克玛生物科技有限公司 一种高特异检测肝素结合蛋白的试剂盒及其应用
CN117420313A (zh) * 2023-10-18 2024-01-19 安徽千诚生物技术有限公司 一种用于检测抗原的化学发光试剂盒及其制备、检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111781362A (zh) 肌酸激酶同工酶磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
US11959912B2 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
WO2016127318A1 (zh) 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及其超敏检测方法
CN111781374A (zh) 超敏肌钙蛋白i磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用
US6162645A (en) Determination of % glycated hemoglobin
CN110514848A (zh) 一种糖化血红蛋白抗体复合物和糖化血红蛋白检测试剂盒
CN108445230B (zh) 基于纳米抗体的降钙素原化学发光检测试剂及检测方法
CN112505334B (zh) 一种NT-proBNP均相化学发光检测试剂盒
CN111781385A (zh) 一种NT-proBNP检测试剂盒及其制备方法
CN114113637B (zh) 一种促甲状腺激素受体抗原试剂及促甲状腺激素受体抗体定量检测试剂盒
CN112540177A (zh) 一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法
US6316265B1 (en) Determination of % glycated hemoglobin
CN118777025A (zh) 一步法定量检测cd3/gprc5d双特异性抗体的方法
CN110596405A (zh) 胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白含量的试剂盒
CN108872595A (zh) 一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法
CN111308083A (zh) 稀释组合物及用于骨桥蛋白检测的试剂或试剂盒
EP2309265B1 (en) Method of assaying complex and kit to be used therefor
Kitajima et al. Production of antibodies to calmodulin in rabbits and enzyme immunoassays for calmodulin and anti-calmodulin
CN114200129B (zh) 组织金属蛋白酶抑制剂-2胶乳免疫比浊法血尿同检试剂盒
CN116519945A (zh) 快速测定可溶性st2含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN114112957B (zh) 一种脂联素测定试剂盒及其应用
CN114324865A (zh) 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法及应用
CN115267195A (zh) 一种胸苷激酶1磁微粒化学发光检测试剂
JPS6223823B2 (zh)
CN114965986A (zh) 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20201016