CN113311161B - 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于蛋白检测领域，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：S1.制备线性聚丙烯酰胺‑DNA聚合物；S2.金纳米颗粒的合成和修饰；S3.微流控芯片的设计和组装；S4.DNA水凝胶的合成；S5.检测。本发明利用DNA水凝胶对目标物进行检测，稳定性好，反应特异性强，可以实现可视化检测。利用微流控芯片进行检测，实现了便携性定量检测的目的。
Description
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体地，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒。
背景技术
急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是全球范围内引起死亡的常见原因。根据世卫组织统计，在2015年1790万死于心血管疾病的病例中，约有890万人死于缺血性心脏病，而急性心肌梗死是其主要病因，且呈年轻化趋势。因此对急性心肌梗死进行快速有效的诊断具有重要的临床意义。由于心肌梗死发病的突发性和不可预知性，迫切需要开发出可以在任何场合快速有效诊断的便携式检测手段。
检测体液中生物标志物的浓度是诊断急性心肌梗死的有效方法，具有较高的准确性和精密度。肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB，CKMB)作为心脏生物标志物的一种，具有较高的特异性和敏感性，其值的连续监测还可用于判断再梗死的发生。急性心肌梗死发生时，血液中CKMB浓度上升至正常值上限(20ng/mL，44kDa)的两倍以上。在心梗发生的第4-6小时，血液中CKMB的含量开始上升，第24小时到达峰值，此时，其浓度可达正常值的10倍，在48-72小时恢复至正常水平。目前，有多种免疫测定方法已经用于生物标志物的检测，包括表面等离子体共振、荧光、电化学。但是它们都需要高成本的设备和专业的技术人员，往往受限于实验室等特定的操作环境，使其临床应用受到一定的限制。因此对便携式CKMB检测方法的需要十分迫切。ELISA试剂盒可以满足便携的要求，已经广泛应用于CKMB的筛查，但该方法存在孵育时间长、洗涤步骤多、灵敏度低等缺点。因此，本领域对准确、便携且低成本的CKMB检测方法的需求仍然十分迫切。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种便携、定量可拓展的基于DNA水凝胶的微流控芯片检测方法，以实现对心肌梗死标志物肌酸激酶同工酶的即时检测(POCT)。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法，包括以下步骤：
(1)制备线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物：分别将丙烯酰胺与S1和S2混合，真空干燥后，加入过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，然后进行聚合反应，得到PS1和PS2；
S1的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAAGGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；
S2的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAACCCTAAAAGCATC-3’(SEQ ID NO：2)；
(2)金纳米颗粒的合成和修饰：将HAuCl4水溶液在搅拌条件下加热煮沸，然后迅速加入新鲜制备的柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸，得到金纳米颗粒AuNPs；将BSA与AuNPs混合，震荡孵育，然后通过离心再悬浮，得到BSA-AuNPs；
(3)微流控芯片的设计和组装：使用Auto CAD软件绘制芯片图形，并据此制备微流控芯片，该芯片是使用软光刻技术由聚二甲基硅氧烷制成的，具有液体进样口，水凝胶加样区，检测区和液体通道；本发明微流控芯片可委托商购获得；
(4)DNA水凝胶的合成：将PS1和AuNPs混合，将所得混合物在60-70℃和800-1200rpm条件下孵育，然后加入PS2，再孵育震荡，以确保均匀混合；将体系冷却至20-30℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶；
(5)检测：
将DNA水凝胶用PBS溶液冲洗后，用移液枪吸取放置在微流控芯片通道处，阻塞液体流动；取待测样品加在DNA水凝胶上方，反应后将芯片斜置，利用重力驱动反应后的液体流入检测区；将芯片放置在曝光板上拍照之后，利用软件进行平均灰度值的分析，计算待测样品中CKMB的浓度。
本发明的检测过程原理图如图1所示。基于DNA水凝胶的比色方法，实现对肌酸激酶同工酶的快速可视化便携式检测。首先将两条DNA链(S1和S2)分别与丙烯酰胺共聚，形成线性DNA-聚丙烯稀酰胺聚合物PS1和PS2。S1包含CKMB适配体序列，并与短S2部分互补。当PS1、PS2混合时，S1与S2通过碱基配对交联最终形成DNA水凝胶。在没有CKMB的情况下，S1和S2可以顺利互补杂交，形成水凝胶。相反，在存在CKMB的情况下，适配体识别目标物而优先与之结合，S1构象改变从而与S2解离，导致DNA水凝胶崩解，包封的AuNPs释放，上清液从无色变为红色。因此，可以通过上清液颜色的变化来指示CKMB的浓度。进一步将该水凝胶与微流控芯片结合，固定在微流控通道处进行便携式检测，根据解离出的AuNPs含量产生的颜色变化分析灰度值来指示目标物的浓度。
根据本发明一种具体实施方式，步骤(1)包括以下步骤：分别用含2-3％丙烯酰胺的离心管配制链PS1和PS2，在37℃真空干燥4-8分钟后，加入0.04-0.06％(v/v)过硫酸铵和0.04-0.06％(v/v)四甲基乙二胺，然后在37℃下真空干燥4-8分钟以进行聚合反应。
根据本发明一种具体实施方式，步骤(2)包括以下步骤：将超纯水和0.8-1.2mL0.8-1.2％HAuCl4水溶液混合，在300-500rpm转速下加热煮沸，然后迅速加入0.8-1.2mL新鲜制备的2-4％柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸20-40分钟，溶液避光冷却至室温后，储存在4℃备用；将BSA与AuNPs混合后，在室温下震荡孵育过夜，然后通过离心再悬浮在水中2-4次，得到BSA-AuNPs。
根据本发明一种具体实施方式，步骤(4)包括以下步骤：在离心管中加入PS1和AuNPs，将混合物在60-70℃和800-1200rpm条件下孵育8-12分钟，然后加入PS2，再孵育震荡8-12分钟，以确保均匀混合；将水凝胶冷却至20-30℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶。
根据本发明一种具体实施方式，步骤(5)还包括制备标准曲线的步骤：检测一系列浓度已知的肌酸激酶同工酶标准溶液，分别以浓度和平均灰度值为横纵坐标作图，制得肌酸激酶同工酶的标准曲线。
根据本发明一种具体实施方式，本发明的方法包括以下步骤：
(1)线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物的制备：分别用含2.25％丙烯酰胺的离心管配制链PS1和PS2。在37℃真空干燥5分钟后，加入0.05％(v/v)过硫酸铵(0.05g过硫酸铵溶于0.5mL水)和0.05％(v/v)四甲基乙二胺(100微升TEMED溶于900微升水)，然后在37℃下真空干燥5分钟以进行聚合反应；
(2)金纳米颗粒的合成和修饰：在250mL三口圆底烧瓶中加入99mL超纯水和1mL1％HAuCl4水溶液，在400rpm转速下加热煮沸。然后迅速加入1mL新鲜制备的3％柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸30分钟。溶液避光冷却至室温后，储存在4℃备用。并将BSA与AuNPs混合后，在室温下震荡孵育过夜，然后通过离心再悬浮在水中3次，得到BSA-AuNPs；
(3)微流控芯片的设计和组装：使用Auto CAD软件绘制芯片图形，并将其发送到苏州田硕自动化科技公司生产微流控芯片，该芯片是使用软光刻技术由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的，具有液体进样口，水凝胶加样区，检测区和液体通道；
(4)DNA水凝胶的合成：在离心管中加入PS1和AuNPs。然后将混合物在65℃和1000rpm条件下孵育10分钟。然后加入PS2，再孵育震荡10分钟，以确保均匀混合；将水凝胶冷却至25℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶；
(5)比色检测：将不同浓度的CKMB溶液分别加入DNA水凝胶中，在30℃下，150rpm反应2.5小时。在水凝胶上清液中肉眼观察到颜色变化，表明CKMB导致水凝胶崩解和内部AuNPs的释放；
(6)读数：为了获得更准确的结果，还在520nm处用紫外-可见分光光度法测定上清液的吸光度，并拍照分析体系的灰度值。
根据本发明，更具体地，步骤(1)包括：首先，在含链S1和链S2的离心管中分别加入26.7μL和72μL无酶水，震荡混匀。称取12.7gMgCl2，加入离心管中，并将50×TAE缓冲液吸取1mL，稀释至10mL，形成5×TAE缓冲液后，加入到含有MgCl2离心管中，充分溶解备用。在离心管中加入10μL S1、1.5μL 30％丙烯酰胺(AA)、6.5μL 5×TAE/Mg2+，在37℃下抽真空5分钟。立即分别加入新鲜制备的0.05％(v/v)过硫酸铵(0.05g过硫酸铵溶于0.5mL水)和0.05％(v/v)四甲基乙二胺(100μL TEMED溶于900μL水)，然后继续在37℃下抽真空5分钟以进行聚合反应。分别得到线性链PS1和PS2。
根据本发明，更具体地，步骤(2)包括：所有用于合成的玻璃器皿都用新鲜制备的王水(HNO3：HCl＝1:3)浸泡过夜，然后用超纯水彻底清洗并干燥。在250mL三口圆底烧瓶中加入99mL超纯水和1mL1％HAuCl4水溶液，在400rpm转速下加热。在此过程中，准确称取30mg柠檬酸钠溶于1ml超纯水，待温度升至140℃后，迅速加入。维持该温度，继续煮沸30min。停止加热，将溶液避光保存冷却至室温。按照30mg/mL的浓度称取BSA，与合成的溶液混合后，在室温下600rpm下震荡孵育过夜，然后在12000rpm下离心20min，除去上清液，重复三次，最终重悬于水中，即得到所需的纳米金。
根据本发明，优选地，步骤(3)包括：按照预期形式绘制芯片图形，与苏州田硕自动化科技公司沟通后生产微流控芯片。
根据本发明，优选地，步骤(4)包括：在离心管中加入20μL PS1和20μL 120μM BSA-AuNPs。在65℃和1000rpm条件下反应10分钟。然后加入20μL PS2，再孵育震荡10分钟，以确保均匀混合。将水凝胶冷却至25℃，恒温过夜。用PBS缓冲液冲洗3次，以除去未结合的AuNPs，得到DNA水凝胶。
根据本发明，优选地，步骤(5)包括：将80μL不同浓度的CKMB溶液分别加入DNA水凝胶中，在30℃下，150rpm反应2.5小时。在曝光板上拍照记录反应结果。
根据本发明，步骤(5)还可以包括：取50μL上清液，在紫外-可见分光光度计中进行测定，得到上清液在520nm出的吸光度值，处理数据，得到标准曲线。进一步，将其运用到微流控芯片上，反应后在曝光板上对检测区液体进行拍照，形成png格式的文件。通过image J软件检测灰度值，实现对检测结果快速及时的读数。
本发明还提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测试剂盒，包括以下组分：
(1)上述线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物；
(2)上述金纳米颗粒；
(3)上述微流控芯片；
(4)上述DNA水凝胶。
本发明在检测过程中优化了反应时间，反应体系pH值，以及包覆金的浓度，在最优的实验条件下可以对肌酸激酶同工酶进行快速目视检测。本发明利用DNA水凝胶对目标物进行检测，稳定性好，反应特异性强，可以实现可视化检测。利用微流控芯片进行检测，实现了便携性定量检测的目的。该芯片制造成本低，检测后可重复使用，结果可靠，通过简单的加载操作即可实现智能化读数，利用手机软件可以达到0.027nM的检测限，满足心肌梗死发生时血清检测临界值，适用于现场的筛查与快速检测过程。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明检测方法原理图。
图2为本发明实施例中所用的微流控芯片示意图。
图3为本发明实施例中用BSA修饰前后的金纳米颗粒的透射电镜图、粒径统计分析图和Zeta电位图。
图4为本发明实施例中目标物的检测标准曲线。
图5本发明实施例中特异性检测的结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本实施例用于说明人体血清中肌酸激酶同工酶检测的基于DNA水凝胶的微流控芯片检测方法，具体包括以下步骤：
实施例中，氯金酸(HAuCl4·H2O)(＞99.5％)，柠檬酸钠，过硫酸铵(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)，氯化镁购自大茂化学试剂厂(中国天津)。牛血清白蛋白(BSA)，10,000×SYBRGreen(SG)，30％丙烯酰胺(AA)购自索莱宝(中国北京)。10×DNA上样缓冲液，20bp DNAladder购自TaKaRa生物技术有限公司(中国大连)。肌酸激酶同工酶(CKMB)购自Prospec(锡安那尼斯，以色列)。肌钙蛋白I购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)，心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)，C反应蛋白(CRP)，降钙素购自Abcam(中国上海)。其他试剂购自国药化学试剂公司(中国上海)。本实验所用寡核苷酸均由上海生工生物科技有限公司合成、修饰，高效液相色谱(HPLC)纯化。这些寡核苷酸的序列如下：
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
1)线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物的制备：分别用含2.25％丙烯酰胺的离心管配制链PS1和PS2。在37℃真空干燥5分钟后，加入0.05％(v/v)过硫酸铵(0.05g过硫酸铵溶于0.5mL水)和0.05％(v/v)四甲基乙二胺(100微升TEMED溶于900微升水)，然后在37℃下真空干燥5分钟以进行聚合反应。
2)金纳米颗粒的合成和修饰：在250mL三口圆底烧瓶中加入99mL超纯水和1mL1％HAuCl4水溶液，在400rpm转速下加热煮沸。然后迅速加入1mL新鲜制备的3％柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸30分钟。溶液避光冷却至室温后，储存在4℃备用。并将BSA与AuNPs混合后，在室温下震荡孵育过夜，然后通过离心再悬浮在水中3次，得到BSA-AuNPs。图3为用BSA修饰前后的金纳米颗粒的透射电镜图、粒径统计分析图和Zeta电位图。
3)DNA水凝胶的合成：在离心管中加入20μL PS1和20μL 120μMAuNPs。然后将混合物在65℃和1000rpm条件下孵育10分钟。然后加入20μL PS2，再孵育震荡10分钟，以确保均匀混合。将水凝胶冷却至25℃，恒温过夜。用PBS缓冲液冲洗3次，以除去未结合的AuNPs，得到DNA水凝胶。
4)微流控芯片的设计和组装：使用Auto CAD软件绘制芯片图形，并将其发送到苏州田硕自动化科技公司生产微流控芯片。该芯片是使用软光刻技术由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的，具有液体进样口，水凝胶加样区，检测区和液体通道。如图2所示。将微流控芯片使用PBS缓冲液清洗，氮气吹干备用。
5)微流控芯片检测：将DNA水凝胶用PBS溶液冲洗后，用移液枪吸取放置在微流控芯片通道处，阻塞液体流动。取50μL不同浓度梯度的肌酸激酶同工酶溶液，加在DNA水凝胶上方，在30℃下反应1h，然后将芯片斜置，利用重力驱动反应后的液体流入检测区。
6)制作标曲：将芯片放置在曝光板上拍照之后，利用软件进行平均灰度值的分析，制作标准曲线，如图4所示。
7)特异性检测：采用与CKMB相同的实验方法，对心血管疾病发生时升高的其他物质(心脏型脂肪酸结合蛋白、心肌肌钙蛋白I和C反应蛋白)以及血清中常见的酶(降钙素)进行了研究。特异性检测的结果如图5所示。
8)人血清样本前处理：取人血清样本，使用TM缓冲液将其稀释30倍，作为样品检测基质。向稀释后的血清样本中加入不同浓度的肌酸激酶同工酶，作为待检测的目标溶液。
9)实际样品检测：将含有不同浓度肌酸激酶同工酶的血清按照上述步骤进行反应，分析得出的吸光度值代入标准曲线中，计算肌酸激酶同工酶的含量。
结果如表1所示。
表1
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法和试剂盒
<130> BJI2100571WY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaggggg gtgggtgggg gatctcggag gatgctttta gggggttggg 50
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaacccta aaagcatc 18
Claims (3)
1.一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测方法，包括以下步骤：
(1)制备线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物：分别将丙烯酰胺与S1和S2混合，真空干燥后，加入过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液，然后进行聚合反应，得到PS1和PS2；
S1的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAAGGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；
S2的核苷酸序列为：5’-Acrydite-AAAAACCCTAAAAGCATC-3’(SEQ ID NO：2)；
(2)金纳米颗粒的合成和修饰：将HAuCl4水溶液在搅拌条件下加热煮沸，然后迅速加入新鲜制备的柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸，得到金纳米颗粒AuNPs；将BSA与AuNPs混合，震荡孵育，然后通过离心再悬浮，得到BSA-AuNPs；
(3)微流控芯片的设计和组装：使用Auto CAD软件绘制芯片图形，并据此制备微流控芯片，该芯片是使用软光刻技术由聚二甲基硅氧烷制成的，具有液体进样口，水凝胶加样区，检测区和液体通道；
(4)DNA水凝胶的合成：将PS1和AuNPs混合，将所得混合物在60-70℃和800-1200rpm条件下孵育，然后加入PS2，再孵育震荡，以确保均匀混合；将体系冷却至20-30℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶；
(5)检测：
将DNA水凝胶用PBS溶液冲洗后，用移液枪吸取放置在微流控芯片通道处，阻塞液体流动；取待测样品加在DNA水凝胶上方，反应后将芯片斜置，利用重力驱动反应后的液体流入检测区；将芯片放置在曝光板上拍照之后，利用软件进行平均灰度值的分析，计算待测样品中CKMB的浓度；
步骤(1)包括以下步骤：分别用含2-3％丙烯酰胺的离心管配制链PS1和PS2，在37℃真空干燥4-8分钟后，加入0.04-0.06％(v/v)过硫酸铵和0.04-0.06％(v/v)四甲基乙二胺，然后在37℃下真空干燥4-8分钟以进行聚合反应；
步骤(2)包括以下步骤：将超纯水和0.8-1.2mL 0.8-1.2％HAuCl4水溶液混合，在300-500rpm转速下加热煮沸，然后迅速加入0.8-1.2mL新鲜制备的2-4％柠檬酸钠溶液，混合物继续煮沸20-40分钟，溶液避光冷却至室温后，储存在4℃备用；将BSA与AuNPs混合后，在室温下震荡孵育过夜，然后通过离心再悬浮在水中2-4次，得到BSA-AuNPs；
步骤(4)包括以下步骤：在离心管中加入PS1和AuNPs，将混合物在60-70℃和800-1200rpm条件下孵育8-12分钟，然后加入PS2，再孵育震荡8-12分钟，以确保均匀混合；将水凝胶冷却至20-30℃，恒温过夜，得到DNA水凝胶。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片比色检测方法，其中，步骤(5)还包括制备标准曲线的步骤：检测一系列浓度已知的肌酸激酶同工酶标准溶液，分别以浓度和平均灰度值为横纵坐标作图，制得肌酸激酶同工酶的标准曲线。
3.一种用于检测肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色检测试剂盒，包括以下组分：
(1)权利要求1所述的线性聚丙烯酰胺-DNA聚合物；
(2)权利要求1所述的金纳米颗粒；
(3)权利要求1所述的微流控芯片；
(4)权利要求1所述的DNA水凝胶。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Design and synthesis of target-responsive aptamer-cross-linked hydrogel for visual quantitative detection of ochratoxin A;Liu R 等;ACS Appl Mater Interfaces;第7卷(第12期);第6982-6990页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113311161A (zh) | 2021-08-27 |
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