CN105067585A - 一种纳米荧光微球，其制备方法及在多重pcr产物的液相蛋白芯片检测中的应用 - Google Patents

Abstract

<b>本发明涉及一种纳米荧光微球，其制备方法及在多重PCR产物的液相蛋白芯片检测中的应用，纳米荧光微球具有核壳结构，粒径为300~600nm，其内核为包含有不同梯度的荧光分子的聚合物微球，外壳具有修饰在所述聚合物微球外表面上的一种或多种官能团，聚合物微球为聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微球或者它们的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯单元的重量至少占所述纳米荧光微球总重量的50%，荧光分子的重量占所占纳米荧光微球总重量的0.05%~5%。该纳米荧光微球粒径稳定、光谱适用于可见发射光。根据其荧光不同表达，可通过和特异性抗体结合，用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测技术，诊断效率、准确性和通量高，市场潜力大。</b>

Description

一种纳米荧光微球，其制备方法及在多重PCR产物的液相蛋白芯片检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的纳米荧光微球及其制备方法和用途。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是无需使用活生物体而酶促复制DNA的分子生物学技术。PCR在医学和生物研究实验室中普遍用于多种任务，例如检测遗传疾病、鉴定基因指纹、诊断感染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和准确性能力，分子生物学家已将PCR作为核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点或平台期进行DNA检测，这使得难于定量起始模板。实时PCR或动态PCR通过随着反应进程而记录扩增子浓度而提高了终点PCR分析的性能。扩增子浓度最常通过与被扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。

液相芯片，也称为微球体悬浮芯片(suspensionarray，liquidchip)，是基于xMAP(flexibleMultiAnalyteProfiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是一种新的高通量分子检测技术平台。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种粒径稳定、光谱适用于可见发射光的纳米荧光微球，采用该纳米荧光微球和特异性抗体相结合，适用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测技术。

本发明同时还要提供一种纳米荧光微球的制备方法，该方法可获得粒径稳定、光谱适用于可见发射光的纳米荧光微球，并且该方法简单。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种纳米荧光微球，具有核壳结构，该纳米荧光微球的粒径为300～600nm，其内核为包含有荧光分子的聚合物微球，外壳具有修饰在所述聚合物微球外表面上的一种或多种官能团，该所述官能团能够直接与配体或生物大分子反应形成微球表面的共价键连接，或在激活后与配体或者生物大分子进行共价标记；所述的聚合物微球为聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微球或者它们的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯单元的重量至少占所述纳米荧光微球总重量的50％，所述的荧光分子的重量占所占纳米荧光微球总重量的0.05％～5％。

根据本发明，所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。所述的其它单体为包括但不限于氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸等。

根据本发明，所述的官能团可以为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐，及聚乙二醇基中的一种，其中优选为羧基。

根据本发明，所述荧光分子指在适当的激发波长下可发射荧光的物质。本发明中，荧光分子优选为荧光素及其衍生物、罗丹明、肾上腺素染料、氟硼莹等。其中，更优选采用罗丹明例如罗丹明Red-X和罗丹明6G等作为荧光分子。荧光分子的重量优选为所述纳米荧光微球总重量的0.2％～5％。

优选地，本发明的纳米荧光微球的粒径为350～400nm，更优选为370～390nm。

根据本发明，纳米荧光微球还可进一步包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述微球表面的生物活性物种，从而成为具有生物活性的荧光微球。选择的生物活性物种可以参与特异性识别反应，包括特异性结合、核酸杂交和酶反应。生物活性物种可通过一个具有明显亲水性的间隔区域来实现共价标记。这种间隔区域可以是诸如乙烯乙二醇低聚物的小分子间隔区域，也可以是诸如肽、蛋白质、聚乙二醇、和多糖的大分子实体。微球表面和生物活性种的结合包括氨基键结合，酯键结合，C-C键结合，C-N键结合和包含电荷相互作用的结合。生物活性的例子包括：包含在特定的识别和结合中的分子实体，诸如抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质等。该生物活性物种一般都可以采用多种众所周知的技术中的任何一种附着在在表面具有官能团的聚合物微球上。例如，可以使用羧基、氨基、醛基、硫醛基、环氧基和其它活性或者键和功能基、以及剩余的自由基和阳离子自由基将生物活性物种共价附着在微球上，同时也实现了蛋白的耦联反应。一个表面官能团可以作为官能共聚单体的一个组合，因为微球表面可以包含表面浓度相对较高的极性基。此外该发明制备的微球也可以直接共价键连接蛋白质，而不需要进一步的修改，例如用碳化二亚胺激活微球表面的羧基，而被激活的羧基与抗体的氨基反应形成酰胺键。激活和抗体耦联可以发生在诸如磷酸(盐)缓冲液，或者2-(N-吗啉)乙烷磺酸的缓冲液中，由此可以形成微球结合物。

本发明采取的又一技术方案是：一种上述的纳米荧光微球的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、以所述聚合物的微粒和含有所述官能团的烯烃单体为原料，通过微乳液聚合法制备得到外表面上具有所述官能团的聚合物微球；

(2)、向步骤(1)所得的外表面上具有所述官能团的聚合物微球中缓慢注入含有所述荧光分子的有机溶剂和水，聚合物微球发生溶胀，荧光分子进入聚合物微球内，然后离心，除去上清液，清洗，加水悬浮，即得所述纳米荧光微球，其中有机溶剂为丙酮或二氯甲烷。

根据本发明，步骤(1)可采用常规的微乳液聚合法来实现，最后获得的聚合物微球为聚合物、用于提供微球表面官能团的含有官能团的烯烃单体、表面活性剂、水以及有机溶剂的乳液，这些均为本领域所属技术人员所熟知。

根据本发明，优选的是表面具有羧基的纳米荧光微球。在该情况下，用于提供微球表面官能团的含有官能团的烯烃单体可以为例如甲基丙烯酸。

此外，本发明还特别涉及上述的纳米荧光微球在多重PCR产物的液相蛋白芯片检测中的应用。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的纳米荧光微球采用基于甲基丙烯酸甲酯的聚合物作为封装基体，其使用寿命长，易于制造，制备稳定且具有良好的单分散性，可以很容易地用各种官能团和生物物种对微球的表面进行改性，每个微球上都能够被连接上大量的荧光分子，是非常好的荧光信号放大的载体，应用于多重PCR的液相蛋白芯片检测中，可以大大提高检测灵敏度，且纳米荧光微球非常稳定，受外界影响小，荧光稳定，这为通过荧光进行定量检测提供了良好的条件，因此，本发明纳米荧光微球是荧光检测技术中高灵敏度分析检测和定量测试中的理想标记。此外，本发明纳米荧光微球可用可见光光源激发以及通过简单的方法获得，降低检测分析成本。

本发明的纳米荧光微球的方法简单，获得的纳米荧光微球中，荧光分子均匀地分布在聚合物微球中，微球粒径均匀、稳定，根据荧光表达的不同梯度，可制备出一个光编码微球，可用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测技术，适用于医疗诊断、生物检测、环境检测和食品安全监测以及不同物种的检测技术领域中，具有液相杂交特异性更高；操作时间短，可具体分型，检出结果直观，成本低，污染小，易于推广等优势。

附图说明

附图1为实施例1制备的纳米荧光微球的发射和激发光谱图；

附图2为本发明实施例1制备的纳米荧光微球的扫描电镜图；

附图3～附图6为本发明实施例3中在四种不同的波长下，多重PCR的检测情况图；

附图7为本发明纳米荧光微球多重PCR产物的液相蛋白芯片的检测与常见荧光物的对比检测波形示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1表面官能团为羧基的纳米荧光微球的制备

根据本实施例，纳米荧光微球的制备包括如下步骤：

(1)、制备表面具有羧基的聚甲基丙烯酸甲酯微球

取Polysciences公司生产的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2.7％，0.324μm)5ml，清洗离心后在10ml超纯水中悬浮超声，加入含3mg甲基丙烯酸单体(用于在微球表面形成羧基)的1ml水，混合2min，加入含15mg聚乙烯醇的0.5ml水，搅拌2min，然后加入含8mg十二烷基硫酸钠的0.5ml水，混合2min，然后加入5ml乙醇，搅拌5min，得到聚甲基丙烯酸甲酯微球。

(2)、制备纳米荧光微球

通过注射器向步骤(1)所得聚甲基丙烯酸甲酯微球中，缓慢注入含1mg罗丹明的750μl二氯甲烷，加入时间可以超过5min，继续搅拌5min。通过注射泵以0.5ml/min速度加入水25ml，然后空气气流去除一些溶剂定容到30ml。对微球进行离心去除上清液，用质量百分数为90％的乙醇清洗三遍，清洗后的微球用30ml水悬浮，即得纳米荧光微球。

实施例2纳米荧光微球的表征

取实施例1制备的10μl纳米荧光微球，悬浮在750μl水中进行检测，在610nm处收集微球的激光光谱，发射光谱在580nm处采集，谱图参见图1。

对微球进行扫描电镜测试，谱图参见图2，微球粒径在370～390nm之间，粒径均匀。

实施例3多重PCR检测步骤

混合50μl反应体系，内含各类引物均为15pmol,各探针15pmol,检测DNA50-100ng，1XPCR缓和液，TaqDNA聚合酶2μl，Mg++终浓度3pmol/L，然后在天隆PCR仪器上，96℃下预变性2min，然后94℃变性10sec，53℃复性30sec，60℃延伸40sec，共40循环。16个样本(四个梯度，其中一个为10个样本量)，在四种波长下检测，如图3～6。

由图3～6可知：同一种样本在不同激发波长下，测定的CT值差值为0.3内，荧光集团稳定，扩增效率高，斜率为-3.31。

另外，使用市面上较为常见的某荧光纳米颗粒与本发明在FAM激发波长480nm做比较，由图7可知：本发明荧光纳米微粒荧光强度高于市面上的荧光强度，结果稳定可靠，易于推广。

实施例4纳米荧光微球和靶向探针偶联并用于蛋白液相芯片检测

选用不同荧光编码的微球，充分震荡微球悬液，稀释荧光微球5×106个，离心速度14000g10min，去除上清液。加入0.0MpH4.8的硼酸盐缓冲液，加入EDC(终浓度2mM)和NHS(终浓度5mM)，室温反应15min。离心洗涤后，加入2-巯基乙醇(终浓度20mM)，离心去上清。加入抗体，室温反应6h，加入Tris(终浓度50mM)，离心去上清。沉淀用0.01MpH7.2的PBS溶液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，即为制备好的蛋白标记抗体的荧光微球。制备好的荧光微球和PCR产物混合，90℃变性10min,室温避光孵育30min，通过激发微球荧光对PCR产物进行分析。

对十个HPV样本进行检测，与市面上的PCR膜杂交法比较见表1。

表1

从表1中可知：结果表明本发明与PCR膜杂交法检出结果九例一致，有一例不同，经过测序确定本发明液相杂交特异性更高；操作时间短，可具体分型，检出结果直观，成本低，污染小易于推广。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米荧光微球，具有核壳结构，其特征在于：所述的纳米荧光微球的粒径为300~600nm，其内核为包含有荧光分子的聚合物微球，外壳具有修饰在所述聚合物微球外表面上的一种或多种官能团，该所述官能团能够直接与配体或生物大分子反应形成微球表面的共价键连接，或在激活后与配体或者生物大分子进行共价标记；所述的聚合物微球为聚甲基丙烯酸甲酯的微球或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微球或者它们的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯单元的重量至少占所述纳米荧光微球总重量的50%，所述的荧光分子的重量占所占纳米荧光微球总重量的0.05%~5%。

2.根据权利要求1所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。

3.根据权利要求2所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述的其它单体为选自氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述的官能团为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐及聚乙二醇基中的一种。

5.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述荧光分子为罗丹明、荧光素及其衍生物、肾上腺素染料及氟硼莹中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述的荧光分子的重量优选为所述纳米荧光微球总重量的0.05%~5%，可表达不同强度的荧光，适用于编码荧光微球。

7.根据权利要求1所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述纳米荧光微球的粒径为350~400nm。

8.根据权利要求1所述的纳米荧光微球，其特征在于：所述纳米荧光微球还包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述微球表面的生物活性物种，该所述的生物活性物种选自抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质以及多糖中的一种，所述的生物活性物种能够参与特异性识别和结合反应。

9.一种如权利要求1所述的纳米荧光微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）、以所述聚合物的微粒和含有所述官能团的烯烃单体为原料，通过微乳液聚合法制备得到外表面上具有所述官能团的聚合物微球；

（2）、向步骤（1）所得的外表面上具有所述官能团的聚合物微球中缓慢注入含有所述荧光分子的有机溶剂和水，聚合物微球发生溶胀，荧光分子进入聚合物微球内，然后离心，除去上清液，清洗，加水悬浮，即得所述纳米荧光微球，其中所述的有机溶剂为丙酮或二氯甲烷。

10.权利要求1至8中任一项权利要求所述的纳米荧光微球在多重PCR产物的液相蛋白芯片检测中的应用。