CN101672772B - 基于适配体的光化学生物传感器及其检测靶物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型基于适配体的光化学生物传感器及其用于检测靶分子的方法，具体涉及一种利用适配体识别靶分子，例如核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白质以及整个细胞等特定分子的聚丁二炔结构分子有序组合体光化学生物传感器，以及利用上述聚丁二炔结构分子有序组合体光化学生物传感器检测靶分子的方法。在本发明所述的光化学生物传感器中，所述特异性结合靶分子的适配体结合在聚丁二炔结构分子有序组合体的表面，以便于当所述特定靶分子暴露于相应适配体时，通过变化的聚丁二炔结构分子有序组合体的紫外-可见光吸光度或者荧光强度来检测/鉴定特定靶分子。

Description

基于适配体的光化学生物传感器及其检测靶物质的方法

技术领域

本发明属于生物传感器领域，涉及一种新型基于适配体的光化学生物传感器，以及这种光化学生物传感器用于检测靶物质的方法。

背景技术

含有丁二炔结构的类脂在形成高度有序而紧密的排列以后，在254nm的紫外光照射下可以聚合形成蓝色的聚丁二炔结构。这种聚丁二炔结构随着所处环境的温度、溶剂、pH及其受到的机械应力的改变，其颜色会发生相应的变化。基于这一特殊的光学性质，使得具有聚丁二炔结构的类脂成为制备生物传感器的信号传导元件的理想材料。

1993年D.H.Charych等人在Science上发表了一篇关于利用功能化聚丁二炔变色薄膜可以识别流感病毒的文章，引起了人们的普遍关注。他们利用10，12-二十五烷基二炔酸(PCDA)为基脂，唾液酸化的PCDA为受体分子，制备功能化LB膜(Langmuir-Blodgett film)，这种薄膜呈现蓝色。当唾液酸遇到信息源感冒病毒时，引起聚丁二炔结构的电子态和重量的改变，最终导致信息处理部分(聚丁二炔结构)的颜色由蓝变红，这种现象肉眼明显可见，从而开创了聚丁二炔制备生物传感器的先河。

适配体是一类具有高度亲和力和能够高度特异性识别结合目标分子的寡核苷酸序列，其靶分子范围广，从小分子药物和染料，到酶分子、多肽以及蛋白质等复杂的生物大分子。这种人工配体是通过一种新的体外筛选技术-SELEX(指数富集配体系统进化)，从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选得到的。由于适配体具有与抗体相同或优于抗体的选择性和亲和力，所以在检测系统中以适配体取代抗体进行蛋白质分子识别成为一种趋势。另外，与抗体相比，适配体还具有几个优点，如热稳定性增加、耐广泛的pH值和盐浓度以及合成、修饰和固化方法简便。更重要的是，适配体可以通过核苷酸变性而失去与靶物质结合的能力，利用这种特性可以制成可重复使用的生物传感器。

目前，人们已经发展各种方法将适配体固化在固体表面并将其应用于蛋白捕获分离和生物传感器的制备。然而，现在利用适配体作为分子识别元件进行制备适配体生物传感器，往往修饰过程过于复杂，检测靶分子方法繁琐，不适合快速检测靶分子的要求。

发明内容

本发明的目的是提供修饰过程简单的一种新型基于适配体的光化学生物传感器，以及利用所述生物传感器快速检测靶物质的方法。

这种新型光化学生物传感器的特征在于用化学、物理或生物学方法将适配体修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体，构建成具有特异性识别功能的光化学生物传感器。

含有丁二炔结构的两亲性单体分子，在水溶液中，其亲水基团十分稳定，而疏水基团极不稳定，整体上来说，是一个能量上不稳定体系。两亲性分子在热力学上要处于低能量，首先是使其疏水链浮到水面上指向空气，减少分子在水中的不相溶性。当水表面上铺满两亲性分子而水中分子无法进入表面时，则这些分子在水中抱成一团，使分子的亲水基指向水介质，以求得能量上的稳定。将空气-水界面平铺的两亲性分子通过LB技术，转移至固体支持物上，即制成聚丁二炔结构LB膜(Langmuir-Blodgett Films)。而对水中的两亲分子进行超声处理，即可制备成囊泡结构。聚丁二炔LB膜和聚丁二炔纳米囊泡具有相似的结构，只是两种不同形式的分子有序组合体。在实际应用中，由于聚丁二炔纳米囊泡具有空间三维结构，其表面的识别元件更容易与靶分子结合，灵敏度更高。另外，我们还可通过合适的功能键将聚丁二炔纳米囊泡修饰到固体支持物上，即制成固化囊泡。

本发明所述的化学方法是碳化二胺法，即通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)的作用活化PCDA游离的羧基形成活泼酯。活泼酯与适配体5’端氨基反应形成酰胺键，从而将适配体修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体，制备成具有特异性识别功能的光化学生物传感器。

本发明所述的物理方法是指通过疏水非共价键将胆固醇修饰的适配体分子引入聚丁二炔结构分子有序组合体基质脂网格中，实现聚丁二炔结构分子有序组合体的功能化修饰，进而制备成具有特异性识别功能的光化学生物传感器。

本发明所述的生物学方法即是生物素-亲和素法，因为亲和素具有四个生物素结合位点，可以通过亲和素将生物素化的适配体与含有生物素基团的聚丁二炔分子有序组合体偶联起来，实现功能化组装，制成制备成具有特异性识别功能的光化学生物传感器。

由上原理，本发明提供了一种基于适配体的光化学生物传感器，包括分子识别元件和信号传导装置，用于分子识别的适配体其修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面上。

上述的分子识别元件为能特异性识别结合靶物质的适配体。本发明中具有特异性识别功能的适配体分子并不局限于一种具体的适配体，而包括所有能够通过合适的方法修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体表面的适配体分子。

上述的信号传导装置是聚丁二炔结构分子有序组合体，包括囊泡、LB膜以及固化囊泡等各种可应用的形式。

上述的将适配体修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面的方式包括共价功能键修饰、生物素-亲和素修饰以及疏水相互作用修饰。

本发明还提供了基于适配体的光化学生物传感器检测靶物质的方法，包括：

①.制备聚丁二炔结构分子有序组合体，其中将用于检测的适配体修饰在上述的聚丁二炔结构分子有序组合体的表面，以提供上述适配体能够识别结合靶物质的结构；

②.在修饰适配体的聚丁二炔结构分子有序组合体暴露在靶物质环境的情况下，测量聚丁二炔结构分子有序组合体的紫外-可见光吸光度和荧光强度的变化；

③.基于吸光度和荧光强度的变化检测/鉴定上述靶物质。

上述方法中所述靶物质为从核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白质以及整个细胞组成的组中选择的至少一种材料。

本发明与以往组装的生物识别元件相比，可以根据需要合成出针对目标靶分子的适配体分子，而且修饰过程简单，可以进行快速检测，因此本发明的基于适配体的光化学生物传感器以及用其检测靶物质的方法，可以广泛应用于生物化学研究、生物反恐、流行病普查以及临床检验诊断等方面。

附图说明

图1是碳化二胺法介导氨基化适配体修饰到聚丁二炔纳米囊泡表面的示意图；

图2是修饰适配体的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；

图3是适配体I/II混合囊泡比色检测人凝血酶示意图；

图4是生物素-亲和素介导适配体修饰聚丁二炔纳米囊泡表面的示意图；

图5表示不同浓度凝血酶引起聚丁二炔纳米囊泡(化学法修饰)特征曲线的变化；

图6表示不同浓度凝血酶引起聚丁二炔纳米囊泡(化学法修饰)的CR％值变化；

图7表示不同浓度凝血酶引起聚丁二炔纳米囊泡(生物法修饰)特征曲线的变化；

图8表示不同浓度凝血酶引起聚丁二炔纳米囊泡(生物法修饰)的CR％值变化；

图9是修饰适配体的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；

图10表示不同浓度大肠杆菌菌液引起聚丁二炔纳米囊泡特征曲线的变化；

图11表示不同大肠杆菌菌液浓度引起聚丁二炔纳米囊泡的CR％值变化。

符号说明

X为适配体修饰后的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；Y为未用适配体进行修饰的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；Z为微孔板空白对照；A为亲和素；B为生物素；L为适配体修饰后的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；M为未用适配体进行修饰的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱；N为微孔板空白对照；a为加入凝血酶前；b为阴性对照；c为40nM凝血酶；d为80nM凝血酶；e为160nM凝血酶；f为320nM凝血酶；g为阴性对照；h为40nM凝血酶；i为80nM凝血酶；j为160nM凝血酶；k为320nM凝血酶；o为10⁴CFU/ml的大肠杆菌；p为10⁵CFU/ml的大肠杆菌；q为10⁶CFU/ml的大肠杆菌；r为10⁷CFU/ml的大肠杆菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1.人凝血酶特异性适配体的合成与氨基修饰

5’端氨基化修饰的人凝血酶特异性适配体I和人凝血酶特异性适配体II均由柏业贸易(上海)有限公司负责合成并完成氨基修饰。利用Maldi-Tof质谱分析进行质量控制。

适配体I：5’Amine-C6-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG

适配体II：5’Amine-C6-TTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT

上述适配体均用灭菌水溶解，分装，-20℃保存。使用之前，95℃变性5min。

2.人凝血酶光化学生物传感器的制备-聚丁二炔纳米囊泡的制备与修饰

将PCDA溶解于氯仿，配成1mmol/L终浓度。取适量该溶液在氮气氛下，真空干燥成薄脂质膜，加入去离子水使溶液终浓度至1mmol/L，使得类脂的总浓度为1mmol/L。避光，72℃超声乳化15min，直至溶液透明或半透明。将获得的溶液置于4℃过夜，以便于囊泡完全闭合。取出闭合囊泡溶液，待其恢复到室温，用手持式紫外灯(254nm)照射30min，直至出现深蓝色，得到聚丁二炔纳米囊泡，制备好的囊泡置于4℃保存。以上过程在紫外照射聚合前，均需在避光条件下进行。

取100μL的1mmol/LPCDA囊泡，向其中分别加入4mmol/LNHS水溶液50μL和4mmol/L EDC·HCl水溶液50μL，反应2h后，加入10nmol适配体I水溶液，补充双蒸水至1mL。继续室温反应8h。反应结束后，在D-Tube^TM Dialyzer(merck)中充分透析去除未反应的适配体等。采用Varioskan Flash多功能酶标仪(Thermo Scientific)进行200～800nm的全波长扫描，测试适配体修饰聚丁二炔纳米囊泡的紫外-可见光光谱。

适配体II修饰的聚丁二炔纳米囊泡的修饰方法与上述方法一致。

3.人凝血酶光化学生物传感器比色检测凝血酶

为了定量分析聚丁二炔纳米囊泡的蓝色-红色的颜色变化程度，我们定义：

比色响应(colorimetric response，简写CR)CR％＝[(PB₀-PB_f)/PB₀]×100％

其中，PB＝A_blue/(A_blue+A_red)，A是蓝色聚丁二炔组份在640nm左右的吸收强度或红色聚丁二炔组份在540nm左右的吸收强度，PB₀是加入融合蛋白质之前聚丁二炔对红波吸收所占的百分数，PB_f是加入融合蛋白质之后聚丁二炔红波吸收所占的百分数。CR％值越大，表明囊泡溶液的颜色越红。

将上述制备的修饰不同适配体的聚丁二炔纳米囊泡按1∶1的摩尔比进行混合，并将混合囊泡用移液器分装于96孔Microtiter-UV微孔板中，每孔各100μL。将人凝血酶干粉用PBS缓冲液稀释后配成一系列的摩尔浓度(分别为40nM、80nM、160nM、320nM)，加入上述含有混合囊泡的孔中充分混匀后，在30℃或室温孵育30min。采用Varioskan Flash多功能酶标仪(Thermo Scientific)进行400～700nm的全波长扫描，测试孵育前后的可见吸收光谱，同时检测孵育前后的A₆₄₀和A₅₄₀，并计算CR％值。

4.实验结果

碳化二胺法介导氨基化适配体修饰到聚丁二炔纳米囊泡表面的示意图见图1。

修饰适配体的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱见图2，其中X曲线为适配体修饰后的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，Y曲线为未用适配体进行修饰的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，Z曲线为空白对照的吸收光谱。

从结果中可以看出，修饰适配体的聚丁二炔纳米囊泡在260nm处出现了吸收峰，而这个吸收峰正是核苷酸的特征峰，同时我们可以看到未用适配体修饰的聚丁二炔纳米囊泡在相应位置却没有吸收峰，因此认为核酸配体已经成功修饰在聚丁二炔纳米囊泡表面。

适配体I/II混合囊泡比色检测人凝血酶示意图见图3。

在微量离心管中进行比色检测凝血酶的结果，加入凝血酶会引起聚丁二炔纳米囊泡的变色反应，且随着加入的凝血酶浓度增加，蓝色-红色变色增加。图5是聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，随着凝血酶的加入，最大吸收峰从640nm处蓝移至540nm处，且加入的凝血酶的量越大，640nm处的吸光度值下降越多，而540nm处吸光度值上升越大。图6用CR％定量地反映了颜色变化的程度，随着加入凝血酶的量增加，CR％值亦增加，在一定范围内成正相关性。

实施例2

1.人凝血酶特异性适配体的合成与生物素修饰

5’端生物素化修饰的人凝血酶特异性适配体III和人凝血酶特异性适配体IV均由柏业贸易(上海)有限公司负责合成并完成生物素修饰。利用Maldi-Tof质谱分析进行质量控制。

适配体III：5’Biotin-C6-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG

适配体IV：5’Biotin-C6-TTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT

上述适配体均用灭菌水溶解，分装，-20℃保存。使用之前，95℃变性5min。

2.基于生物素-亲和素系统的适配体修饰方法

将PCDA和PCDA-biotin分别溶解于氯仿，配成1mmol/L终浓度。按1∶1的摩尔比，取适量溶液在氮气氛下，真空干燥成薄脂质膜，加入去离子水使得类脂的总浓度为1mmol/L。避光，72℃超声乳化15min，直至溶液透明或半透明。将获得的溶液置于4℃过夜，以便于囊泡完全闭合。取出适量闭合囊泡溶液，待其恢复到室温。加入1mg/ml的亲和素蛋白50μL，充分孵育30min。透析除去过量的亲和素蛋白，加入10nmol的生物素化修饰的适配体III或IV，孵育30min，完成适配体的功能化修饰。最后，用手持式紫外灯(254nm)照射30s～30min，直至出现深蓝色，制备好的囊泡置于4℃保存。

3.人凝血酶光化学生物传感器比色检测凝血酶

除了将实施例1中的修饰适配体I或II的聚丁二炔纳米囊泡替换为修饰适配体III或IV的聚丁二炔纳米囊泡以外，其它按照实施例1的方法比色检测凝血酶。

4.实验结果

生物素-亲和素介导适配体修饰聚丁二炔纳米囊泡表面的示意图见图4。

各组吸光度值变化见图7，随着凝血酶的加入，最大吸收峰从640nm处蓝移至540nm处，且加入的凝血酶的量越大，640nm处的吸光度值下降越多，而540nm处吸光度值上升越大。图8用CR％定量地反映了颜色变化的程度，随着加入凝血酶的量增加，CR％值亦增加，在一定范围内成正相关性。

实施例3

1.大肠杆菌特异性适配体的合成与氨基修饰

5’端氨基化修饰的大肠杆菌特异性适配体V由柏业贸易(上海)有限公司负责合成并完成氨基修饰。利用Maldi-Tof质谱分析进行质量控制。

适配体V：

5’Amine-C6-GCCGGCTCAGCATGACTAAGAAGGAAGTTATGTGGTGTTGGC

上述适配体均用灭菌水溶解，分装，-20℃保存。使用之前，95℃变性5min。

2.大肠杆菌光化学生物传感器的制备-聚丁二炔纳米囊泡的制备与修饰

除了将实施例1中的适配体I或II替换为适配体V以外，其它按照实施例1的方法进行聚丁二炔纳米囊泡的制备与修饰。

3.细菌的培养与计数

在LB液体培养基于37℃条件下培养16～18h，然后用灭菌水将菌体溶液依次稀释成8个浓度梯度，分别装入8个小瓶，从10¹个/ml到10⁸/ml，每瓶1ml，分别标号1～8。细胞计数使用传统的平板计数方法，在分装好的含有活菌的溶液中取50μl平铺在普通琼脂的表面，于37℃培养24h后计数。培养物计数完成后与装有活菌的小瓶在121℃下30min灭活，于4℃冰箱保存。

4.大肠杆菌光化学生物传感器比色检测凝血酶

为了定量分析聚丁二炔纳米囊泡的蓝色-红色的颜色变化程度，我们定义：

比色响应(colorimetric response，简写CR)CR％＝[(PB₀-PB_f)/PB₀]×100％

其中，PB＝A_blue/(A_blue+A_red)，A是蓝色聚丁二炔组份在640nm左右的吸收强度或红色聚丁二炔组份在540nm左右的吸收强度，PB₀是加入大肠杆菌之前聚丁二炔对红波吸收所占的百分数，PB_f是加入大肠杆菌之后聚丁二炔红波吸收所占的百分数。CR％值越大，表明囊泡溶液的颜色越红。

将混合囊泡用移液器分装于96孔Microtiter-UV微孔板中，每孔各100μL。将大肠杆菌菌液稀释后配成一系列的菌液浓度(分别为10⁴CFU(colony-formingunits)/mL、10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL)，加入上述含有囊泡的孔中充分混匀后，30℃或室温孵育30min。采用Varioskan Flash多功能酶标仪(ThermoScientific)进行400～700nm的全波长扫描，测试孵育前后的可见吸收光谱，同时检测孵育前后的A₆₄₀和A₅₄₀，并计算CR％值。绘制曲线。

5.实验结果

修饰适配体的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱见图9，与图2类似，其中L曲线为适配体修饰后的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，M曲线为未用适配体进行修饰的聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，N曲线为空白对照的吸收光谱。

图10是聚丁二炔纳米囊泡的特征吸收光谱，随着大肠杆菌的加入，最大吸收峰从640nm处蓝移至540nm处，且加入的大肠杆菌菌液浓度越高，640nm处的吸光度值下降越多，而540nm处吸光度值上升越大。

从图11可以看出，随着大肠杆菌浓度的增加，CR％值逐渐增加，在10⁵～10⁷CFU/mL范围内，CR％值与菌液浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y＝10.89X-45.05，相关系数r＝0.9991，检测限为10⁵CFU/mL(S/N＝3)。对10⁶CFU/mL的菌液进行11次检测，相对标准偏差为6.08％。

Claims (3)

1.一种基于适配体的光化学生物传感器，包括分子识别元件和信号传导装置，其特征在于：用于分子识别的适配体修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面上；

所述的分子识别元件为能特异性识别结合靶物质的适配体；

所述的信号传导装置是聚丁二炔结构分子有序组合体；

所述的聚丁二炔结构分子有序组合体包括囊泡、LB膜以及固化囊泡；

将适配体修饰在聚丁二炔结构分子有序组合体表面的方式包括共价功能键修饰、生物素-亲和素修饰或疏水相互作用修饰；

其中，所述疏水相互作用修饰是碳化二胺法，即通过N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐的作用活化PCDA游离的羧基形成活泼酯，活泼酯与适配体5’端氨基反应形成酰胺键，从而将适配体修饰到聚丁二炔结构分子有序组合体，制备成具有特异性识别功能的光化学生物传感器；

所述的共价功能键修饰是指通过疏水非共价键将胆固醇修饰的适配体分子引入聚丁二炔结构分子有序组合体基质脂网格中，实现聚丁二炔结构分子有序组合体的功能化修饰，进而制备成具有特异性识别功能的光化学生物传感器；

生物素-亲和素修饰是指：亲和素具有四个生物素结合位点，通过亲和素将生物素化的适配体与含有生物素基团的聚丁二炔分子有序组合体偶联起来，实现功能化组装，制成具有特异性识别功能的光化学生物传感器。

2.一种利用权利要求1所述的基于适配体的光化学生物传感器检测靶物质的方法，包括：

①.制备聚丁二炔结构分子有序组合体，其中将用于检测的适配体修饰在所述的聚丁二炔结构分子有序组合体的表面，以提供所述适配体能够识别结合靶物质的结构；

②.在修饰适配体的聚丁二炔结构分子有序组合体暴露在靶物质环境的情况下，测量聚丁二炔结构分子有序组合体的紫外-可见光吸光度和荧光强度的变化；

③.基于吸光度和荧光强度的变化检测/鉴定所述靶物质。

3.根据权利要求2所述的利用基于适配体的光化学生物传感器检测靶物质的方法，其特征在于：所述靶物质为从核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白质以及整个细胞组成的组中选择的至少一种材料。

Images