CN103038639B

CN103038639B - 用于检测分析物的装置

Info

Publication number: CN103038639B
Application number: CN201080061738.9A
Authority: CN
Inventors: 艾米丽·斯坦; 迈克尔·埃文斯
Original assignee: SEVIDENT
Current assignee: Enovic
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: WO2011066449A1; EP2504702A4; CN103038639A; CN107462707A; EP2504702A1; US20130052653A1

Abstract

本发明提供了可以用于诊断以及检测样品中的分析物的其他应用的“分子网”。分子网是包括两个大类的亚基的一种分支的假无规共聚物：捕获剂和连接剂。这些亚基自组装以形成能够结合到预定目标上的结构。然后可以检测该结合。

Description

用于检测分析物的装置

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请号61/281,991(2009年11月24日提交)、61/337,257(2010年2月1日提交)、61/340,287(2010年3月15日提交)、61/343,467(2010年4月29日提交)和61/410,837(2010年11月5日提交)的权益。出于所有目的,将这些申请中的每一个的全部内容以其全文通过引用进行结合。

技术领域

本申请涉及但不限于用于检测分析物的装置。

背景技术

尽管在医学研究中的进展，在当前应用中的诊断测试策略并不是有成本效益的，是时间密集的，在测试的抗原的范围内是有限的，和/或是劳动密集的。对于能够检测或评定健康、或者鉴定或指示在人或动物中存在疾病或致病因子的另外的诊断方法和装置存在着重大的需要。

发明的简要概述

本发明提供了一种“分子网”，它可以用来检测或定量样品中的一次或多次分析。在某些实施方案中，分子网被用于医学诊断和筛选。分子网可以被考虑为包括以下两大类的亚基的一种分支的假无规共聚物：捕获剂和连接剂。这些亚基或“单体”自组装以形成能够结合到样品中的预定目标、“或分析物”上的结构。

通过使样品(例如一滴全血)与分子网接触，并且检测被该分子网结合的多个目标(例如病原体蛋白、核酸、碳水化合物、脂质)的存在或缺乏，有可能确定在样品中是否存在一种、一些或所有的目标分子。在医学诊断、环境取样、和其他用途中发现了分子网的应用。

在一个方面，提供了一种制造物品，包括：具有捕获剂组合物的一个第一部分，该捕获剂组合物由一个或多个种类的第一捕获剂和一个或多个种类的第一连接剂组成，其中在该第一部分中的多数或基本上所有捕获剂通过一种或多种第一连接剂连接至在该第一部分中的至少一种其他捕获剂；具有捕获剂组合物的一个第二部分，其中该组合物由一个或多个种类的第二捕获剂组成，其中在该第二部分中的多数或基本上所有捕获剂通过一种连接剂连接至在该第二部分中的至少一种其他捕获剂；其中至少一个种类的第一捕获剂不同于至少一个种类的第二捕获剂；并且其中在该第一部分中的一些捕获剂通过连接剂连接至在该第二部分中的捕获剂(例如在这些部分的界面处)，使得该第一部分和该第二部分形成一个连续的分子网。

在一个方面，提供了一种制造物品，包括：具有捕获剂组合物和连接剂组合物的一个第一部分，该捕获剂组合物由第一多个异质性捕获剂组成，该连接剂组合物由第一多个异质性连接剂组成，其中在该第一部分中的多数或基本上所有捕获剂通过一种或多种连接剂连接至在该第一部分中的至少一种其他捕获剂；具有捕获剂组合物和连接剂组合物的一个第二部分，该捕获剂组合物由第二多个异质性捕获剂组成，该连接剂组合物由第二多个异质性连接剂组成，其中在该第二部分中的多数或基本上所有捕获剂通过连接剂连接至在该第二部分中的至少一种其他捕获剂；其中该第一部分的捕获剂组合物和连接剂组合物不同于该第二部分的捕获剂组合物和连接剂组合物；并且其中该第一部分中的至少一些捕获剂分子通过连接剂连接至该第二部分中的至少一些捕获剂分子，使得该第一部分和该第二部分形成一个连续的分子网。

在一个方面，提供了一种分支的假无规共聚物，包括是捕获剂和连接剂的单体，这些捕获剂包括多个种类的对不同的目标特异的捕获剂，并且这些连接剂包括多个种类的连接剂，其中共聚物是在捕获剂单体通过连接剂彼此交联的条件下形成的。在一些实施方案中，连接剂是同双功能或异双功能连接物，并且至少一些种类的连接剂包括一个或多个并未结合到共聚物中的一些种类的捕获剂的反应基团。

提供了一种制造分析试剂的方法，包括通过结合以下各项形成一个第一层：(a)第一多个种类的捕获剂，其中所述第一多个种类的捕获剂结合一个以上的生物靶，所述捕获剂具有捕获剂反应基团，以及(b)一种第一连接剂或多种第一连接剂，其中这一种或多种连接剂含有与捕获剂反应基团互补的反应基团，在其中捕获剂经由这一种或多种连接剂而相互连接的条件下，由此形成一个第一层，该第一层包括相互连接的捕获剂的第一网络；并且然后通过结合以下各项形成邻近该第一层的一个第二层：(c)第二多个种类的捕获剂，其中所述第二多个结合一个以上的生物靶，所述捕获剂具有捕获剂反应基团，以及(d)一种第二连接剂或多种第二连接剂，其中这一种或多种连接剂含有与捕获剂反应基团互补的反应基团，在其中第二多种捕获剂中的捕获剂可以经由第二连接剂而相互连接的条件下，并且其中第二多种中的一些捕获剂经由第二连接剂与第一多种中的一些捕获剂相互连接，以形成一个连续的分子网。该方法可以包括在步骤(c)之前，除去未结合的捕获剂和连接剂的步骤。在一些实施方案中，第一多个捕获剂的组成不同于第二多个捕获剂的组成。在一些实施方案中，在步骤(b)中的一种或多种连接剂不同于在步骤(d)中的连接剂。在一些实施方案中，该方法包括进行1-6个另外轮的结合捕获剂和连接剂，其中每一轮导致分子网的另外的部分。

在一个方面，本发明提供了通过在此描述的方法生产的一种制造物品。

提供了一种同时确定在样品中存在或缺乏多个预定分析物的方法，该方法包括使样品与如在此(例如以上)描述的具有对于所述分析物特异的捕获剂的制造物品接触，并且确定所述分析物是否被所述制造物品结合。在一些确定所述分析物是否被所述制造物品结合的实施方案中，包括使结合的分析物与结合所述一种或多种分析物的一种或多种检测试剂接触。在一些实施方案中，用比色的、荧光的、或发光的可检测标记来可检测地标记这些检测试剂。在一些实施方案中，检测试剂选自下组，该组由以下各项组成：抗体、核酸、凝集素和DNA结合多肽。在一些实施方案中，使用两种或更多种检测试剂，每一种检测试剂特异结合到不同种类的分析物上。在一些实施方案中，用相同的可检测标记来标记这两种或更多种检测试剂。在其他实施方案中，用不同的可检测标记来标记至少两种所述检测试剂。在一些方法中，用第一可检测标记所标记的第一检测试剂结合在第一层中的分析物，并且用第二可检测标记所标记的第二检测试剂结合在第二层中的分析物。在一些实施方案中，捕获的分析物被第一检测试剂的结合和不同的捕获的分析物被第二检测试剂的结合是可区别的，并且其中这两种分析物的结合可以区别于只有一种分析物的结合。

提供了一种装置，包括具有至少一个分子网支持表面的一个便携式壳体；以及结合到该至少一个分子网支持表面上的、在此描述的至少一个分子网。

附图简要说明

图1是多层分子网的示意图。

图2显示了层数对分析物结合的影响。

图3显示了分层网和非分层网的结合特性。

图4显示了ELISA和分子网的多分析物结合能力的比较。

图5显示了被分子网的结合用于诊断败血症。

图6显示了在对革兰氏阴性细菌感染的测定中的信噪比。

图7显示了革兰氏阴性菌和来自人血液中的革兰氏阴性菌的分析物的检测。

图8A显示了用于使用分子网捕获分析物的装置的示意图。

图8B显示了用于使用分子网捕获分析物的装置的近视图。

图8C显示了用于使用分子网捕获分析物的多室装置的侧视图。

图8D显示了用于使用分子网捕获分析物的多室装置的俯视图。

图8E显示了用于使用分子网捕获分析物的便携式多室枪装置的侧视图。

图9A和9B显示了对应的示例性传感器布置。

图9C显示了多个交联的检测分子的布置。

图9D显示了一个分子网配置。

图10A显示了用于检测不同的分析物的存在的示例性测试装置。

图10B显示了测试室的一个透视近视图。

图10C显示了图10B的测试室的详细视图。

图10D显示了一个分子网布置。

图11A显示了适配器的透视图。

图11B显示了过滤单元的侧视图。

图12显示了含尖头装置的透视图。

图13A显示了洗涤网的透视图。

图13B显示了多重网络的示意性描述。

图13C显示了测试体积的示意性描述。

图14A显示了被配置为海绵的分子网的简化描述。

图14B显示了在容纳有样品的容器中的网。

图15A-17显示了不同的多室装置的对应透视图。

本发明的详细说明

I.定义和术语

除非另外定义，在此使用的所有科学和技术术语具有如相关领域的那些技术人员通常理解的相同含义。提供了一般定义，例如在Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(微生物学与分子生物学词典)，第二版，(Singleton(辛格顿)等人，1994；John Wiley and Sons(约翰威立父子出版公司)，纽约，N.Y.)或Harper CollinsDictionary of Biology(哈珀柯林斯生物学词典)(Hale(黑尔)和Marham(马哈姆)，1991，Harper Perennial，纽约，N.Y.)中。除非另外提到，在此使用或考虑的技术是本领域熟知的标准方法。

用国际单位制(SI)接受的形式表示单位、前缀和符号。数字范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，按从左到右，以5'至3'方向书写核酸。在此提供的标题并不是本发明的不同方面或实施方案的限制，它可以是通过参考作为一个整体的说明书而具有的。因此，通过参考以其全文的说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。

对于“试剂”表示产生或能够诱发或用于获得特异性结果或反应的分子或细胞。试剂包括但并不局限于无机分子、有机分子、药物、生物制剂、细胞组分、多肽、核酸和环境样品。

对于“分析物”表示是分析主题的分子，例如被测量的，并且是环境或生物样品的组分。

对于“生物制剂”表示衍生自活的生物或由生物产生的有机产物或其他生物来源的并且可以用来治疗或预防疾病的任何物质。

对于“室”表示在任何两个通道之间的区室或封闭空间。

对于“通道”表示用于将样品、流体、以及分散在流体中的固体从一个区域转移至另一个区域的通路。

对于“竞争剂”表示具有与另一种分子或分析物类似的表面化学和/或形状的分子。竞争剂分子和分析物这二者都能够结合或特异结合具有几乎相等的能力的伴侣分子。伴侣分子可以具有用于所述竞争剂分子和分析物的有限数目的适合的结合位点。在伴侣分子与分析物之间的结合受制于竞争剂浓度、有效性、和缓冲条件。

对于“非竞争剂”表示并不具有与分析物类似的表面化学或类似的形状的、并且并不特异结合到伴侣分子上的分子。相反地，非竞争剂分子可以扰乱、减缓、隔离或抑制分析物接触和/或结合伴侣分子的能力。非竞争剂分子还可以结合其中分析物并不结合的伴侣分子的变构区域。非竞争剂到变构区域的结合可以封闭或改变伴侣分子的分析物结合区域。在伴侣分子与分析物之间的结合受制于非竞争剂浓度、有效性和缓冲条件。

对于“过滤器”表示一种物质，例如布、聚合物、纸、纤维材料或任何其他多孔材料，具有小于过滤器的孔径的直径的流体和分子可以通过它而穿过。

对于“适配器”表示连接或联结其他部件或装置的辅助部件。

对于“洗剂”表示含有缓冲剂和一种盐类、洗涤剂、蛋白质、多核苷酸、碳水化合物和/或脂质的混合物的流体，它可以被施用于进样以后的装置。它还可以用来除去在装置中非特异性固定的的分子，或可以用来除去在装置中特异性结合或固定的的分子。

对于“选择”表示一个过程，通过该过程，样品中的分析物的化学和/或物理特性胜过样品中的其他非分析物材料而被优先结合或固定。

对于“反向选择”(selected against)表示一个过程，通过这个过程，不想要的样品材料的化学和/或物理特性被优先结合或固定，并且因此可以允许间接选择所希望的样品材料。

对于“分子筛”表示由从不想要的样品材料分离想要的分析物的筛目或金属或聚合物组成的筛或筛子。

对于“传染性疾病”表示在哺乳动物中临床地或亚临床地表现并且由致病因子引起的疾病。

对于“病原体”表示任何产生疾病的因子，包括病毒、细菌或其他微生物。

对于“微生物”表示小的活的生物，包括细菌、病毒、真菌和原生动物。

对于“细菌”表示与一种或多种细菌有关，可以或可以不引起人类中的疾病的微观的原核生物。

对于“病毒”表示引起疾病的亚微观的微生物。病毒是专性寄生物并且需要活细胞来繁殖。病毒由基因组(DNA或RNA)、蛋白质组成，并且可以具有或可以不具有脂质包膜。

对于“寄生”表示在人体上或人体内生活、生长和进食的植物或动物。

对于“真菌”表示一类真核微生物的成员，包括可以引起或可以不引起人类中的疾病的蕈类、酵母、锈菌、霉菌和黑粉菌。

对于“诊断试验”表示为了有助于诊断或检测疾病而进行的任何种类的医学试验。在一个可接受的参数范围内进行诊断试验，以正确地鉴定要检验的因子。

对于“指示剂试验”或“指示”表示用于指出或标志存在一种因子或疾病的任何事物。

对于“附接”表示附着作用或被附接到一个平台或结合伴侣的状态。

对于“交联剂”表示诱导一种或多种同源和/或异源试剂之间的化学交联形成的化学物质或试剂。

对于“底物”表示酶在其上发挥作用的物质。

对于“生物样品”表示衍生自活人或死人的任何流体或组织或材料，它可以含有免疫球蛋白和/或一种或多种微生物衍生的核酸、碳水化合物、脂质和/或多肽。样品包括，例如：CSF、血清、血液、痰、胸腔积液、咽喉拭子和粪便、呼吸组织或渗出物、血浆、子宫颈拭子样品、活检组织、胃肠组织、尿液、排泄物、精液或其他体液、组织或材料。样品还包括细菌培养物(来自液体或固体培养基)和环境样品。可以处理生物样品来物理地破坏组织或细胞结构，由此释放细胞内组分到可以含有酶、缓冲剂、盐类、洗涤剂和类似物的一种溶液中，用于制备分析用样品。

对于“环境样品”表示存在于人体外的、可以被分离的任何外部衍生的有机的或无机的固体或流体或微粒或分子。例如：食物、水、花粉、农药、石油、胶乳、草、坚果、鱼、猫唾液或其他有机基或无机基材料。可以处理有机环境样品来物理地破坏组织或细胞结构，由此释放细胞内组分到可以含有酶、缓冲剂、盐类、洗涤剂和类似物的一种溶液中，用于制备分析用样品。

对于“分离”或“纯化”或“分级”表示从样品中的其他分子中除去一种或多种样品分子。固体样品可以悬浮在包括核酸和其他分子(例如蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸)的水溶液中。分离或纯化步骤除去至少约30％、优选至少约50％、优选至少约80％、并且更优选至少约95％的其他样品组分。

对于“核酸”或“多核苷酸”表示具有含氮杂环碱基的核苷或核苷类似物的聚合物，其中核苷经由主链结构共价连接以形成多核苷酸。常规的RNA、DNA、以及RNA和DNA的类似物都包括在该术语中。核酸骨架可以包括多种已知的键，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”；专利号WO 95/32305(Hydig(海蒂格)-Hielsen(黑尔森)等人))、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或已知键的组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代(例如2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规的碱基(A、G、C、T、U)、已知碱基类似物(例如肌苷；参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36(核酸的生物化学5-36)，Adams(亚当斯)等人编辑，第11版，1992)或嘌呤或嘧啶碱基的已知衍生物(PCT No.WO 93/13121(Cook(库克))和其中骨架不包括针对一个或多个残基的含氮碱基的“碱性”残基(美国专利号5,585,481(Arnold(阿诺德)等人))。核酸可以包括如在RNA和DNA中发现的常规的糖、碱基和键，或者可以包括常规的组合和取代(例如经由甲氧基骨架连接的常规碱基，或包括常规碱基和一种或多种类似物的核酸)。

对于“探针”表示在促进杂交的条件下，特异性地与在核酸或它的互补物中(优选是在扩增的核酸中)杂交的靶序列的核酸低聚物，由此允许检测靶核酸或扩增的核酸。检测可以是直接的(即，由直接与靶序列或扩增的核酸杂交的探针产生)或者是间接的(即，由与中间体分子结构杂交的探针，该中间体分子结构将探针连接到靶序列或扩增的核酸上)。探针的“靶”通常是指更大核酸序列中的序列(即一个子集)，该更大核酸通过标准氢键(碱基配对)特异性地与至少一部分探针序列杂交。“充分互补的”序列允许探针低聚物与靶序列稳定杂交，即使这两个序列并不是完全互补的。可以标记或不标记探针，这取决于所使用的检测方法，这些方法在本领域中是熟知的。

对于“多肽”表示由通过肽键而共价连接的氨基酸构成的有机化合物，它们是活细胞的组要成分。多肽可以是蛋白片段或可以构成完整的蛋白。可以通过酶切割、化学切割或机械切割来切割蛋白质，以产生多肽。

对于“变应原”表示引起人类中IgE介导的免疫反应的任何外来物质。

对于“非特异性结合”表示以非特异的和瞬时的方式与另一种分子相互作用的任何分子。这样的一个实例是具有总体正电荷的分子与具有总体负电荷的分子的相互作用，然而，缔合作用并不紧密，并且在温和的盐类存在下很可能解离。

对于“抗原”表示在引入体内时，被免疫系统识别的任何物质。抗原可以是，但并不局限于变应原和其他非自身分子。

对于“过敏症”表示免疫系统对于称为变应原的通常无害的物质的不适当的并且有害的应答。

对于“免疫球蛋白”表示响应于抗原的由B细胞，或者在实验室中由杂交瘤产生并分泌的可溶性蛋白分子的家族，它能够结合到特异性抗原上。免疫球蛋白的同种型是IgM、IgG、IgA、IgY、IgD和IgE。

对于“分子的类”表示由于共同的属性、特征、质量、性状、化学和/或活性而被分组在一起的分子。

对于“纳米通道”表示具有1-10,000埃的构造尺寸的通道。

对于“微通道”表示具有10,000-100,000,000,000埃的构造尺寸的通道。

对于“纳米袋”表示具有1-10,000埃的直径的袋。

对于“微米袋”表示具有10,000-100,000,000,000埃的直径的袋。

对于“脓毒症”表示一种严重的医学病症，其特征在于会导致多器官衰竭和死亡的全身炎症应答，并且特征在于响应于血液、尿液、肺、皮肤和其他组织中的微生物产物的细胞因子风暴。

对于“电晕”表示大气压介质阻挡放电、电晕放电、阻挡放电、大气压等离子体、大气压辉光放电、大气压非平衡等离子体、无声放电、大气压局部电离气体、丝状放电、直接或远程大气压放电、外持或自持大气压放电，以及类似过程，并且区别于亚大气压和真空压放电或过程。然而，电晕可以发生在具有特定组成的气态气氛中，即发生在控制气氛中。

对于“细胞外基质(extracellular matrix或extracellular matrices)”表示一种以上的以下分泌的细胞产物的组合：肽、蛋白质、糖蛋白、脂质、多糖、水和其他有机分子。胞外基质组分的实例是藻酸盐泥(alginate slime)、纤维蛋白原、软骨细胞周围基质、和软骨。

对于“底物”表示酶在其上发挥作用的物质。

对于“适体”表示包括长度在30和70个核苷酸之间的单或双链核酸(DNA或RNA)的一类分子，并且可以具有9-20kDa的分子量。适体还可以是肽以及核酸-肽杂交体。适体拥有对它们的目标分子的高度特异性和亲和力。

对于“过滤”表示用于通过固定所述分析物，从流体样品分离分析物的机械的、物理的或化学的操作，使得只有来自样品的非分析物和流体可以通过。

对于“海绵”表示多孔的分子框架，其特征在于容易吸附或固定来自流体样品的分子。

对于“光电池”表示可以将光能转化为直流电的一种材料或一系列材料，例如晶体硅、碲化镉、和硒化铜铟。

对于“抗压强度”表示材料抵抗轴向推力的能力。当达到抗压强度的极限时，材料被压碎，产生破碎光(fracto luminescence)(也称为摩擦发光)。

对于“变色”表示在颜色方面的变化可以是热的存在或缺乏的结果。

II.概述

本发明提供了可以用于诊断以及检测样品中的分析物的其他应用的“分子网”。可以将单层和多层分子网结合到用来协助诊断的医疗装置中以及用于样品分析的其他装置中。

分子网含有捕获剂。分子网可以含有一个异质性群体的有机和无机分子，这些分子可以通过静电作用和共价键合的一个组合，以非均匀方式连接在一起。分子网的分子组分的布置和间距可以产生一种非均匀多维稳定构造，在不同区域中的每单位体积中，具有不同密度的捕获剂和交联剂。非均匀性的一个效果是，不同层或区域可以具有不同孔隙率。

在分子网内的分子捕获组分的个性特征和布置可以对每单位体积分子网的赋予多种不同的表面化学。组成分子网的异质性捕获组分的多种结合亲和力、表面化学、活性、或其他特性可以赋予多路复用能力；并且其中在一个构造中可以安排捕获组分并使其结合在一起，该构造可以拥有每单位体积的高密度结合表面，并且可以使能够增强多路复用能力。

在分子网中，不同的捕获剂(或“捕获组分”)可以结合相同的分析物，例如在样品中的多个相同的分析物可以特异性结合在分子网中的一种以上的异质性捕获组分。相反地，样品中的异质性分析物可以特异性结合分子网中的多个相同的捕获组分。在一些情况下，样品中的异质性分析物可以特异性结合分子网中的一种以上的异质性捕获组分。

如以上所指出和在以下详细讨论的，分子网典型地具有多个层。因此可以按分层的或纹状的方式构建该网。例如，初始层可以是吸附到聚合物表面或玻璃表面的一种或多种类型的多肽和/或其他分子(例如多核苷酸)的一种均质或异质性混合物；随后添加一种或多种化学交联剂。在此之后可以添加一种或多种不同分子的均质或异质性混合物，随后是交联剂。

在一个装置中，可以吸附、堆叠、分层、悬浮、漂浮一个或多个分子网以形成一个测试体积。该网的总体表面拓扑学可以被描述为通过化学键连接的非均匀的、异质性质地的混杂物。例如，该网可以具有分层的格栅或多个交错晶格的结构。聚合物的化学和物理性质决定分子网的第一层的吸附或排斥。聚合物的不同化学或物理性质赋予第一层中的特定组分到聚合物的特定区域上的亚定位。该网的后续层优先连接到该网的以前的层上。

可以使用具有不同臂长(范围例如(并且未限制)从2至17埃)的交联剂来制作该分子网。在制作一个层中，按顺序的方式可以添加或可以施用交联剂，以随机或半定向的方向性的方式附接、固定、并稳定这些捕获组分。该网中的组分的布置或分布将收到捕获组分相对于该网的邻近化学的大小和表面化学的影响。不同大小和形状的捕获组分通过一种或一种以上的交联连接在一起；由此交联的捕获组分可以被暴露表面或被内置到该网的内部结构中。该网的总体结构可以被设计为包括被特异性地配制并定位以识别并分离测试样品的要素特性的区域。

在一些实施方案中，该分子网是含有五种或更多种不同的捕获组分的、异质性大聚合物网，这些捕获组分例如单并不局限于是固定或连接在三维空间中以促进分析物结合的蛋白质和/或多核苷酸和/或其他分子。

该分子网可以被附接或安装到一个聚合物装置上。例如，可以将一个或多个分子网形成；安置；吸附；粘附；胶粘；交联；和/或安装到一个聚合物的；和/或非多孔的；和/或电晕蚀刻的；和/或成型的；具有一种或多种表面化学的表面上。

分子网装置装置可以具有一个测试区，该测试区具有一个或系列分子网，这些分子网可以被定向到一个限定体积中并且可以被用来进行一个或多个分析物结合测试。该装置可以具有一个内腔。一些装置的一个特征是沿该装置的内腔表面的结合位点的非均匀分布，该装置包括可以存在于一个装置中的分子网、内腔涂层、过滤器和筛。该表面可以提供在该装置之内但是可以不在该装置的其他区内的跨截面的结合位点的均匀分布。

一个测试装置可以含有多个分子网，其中每个分子网含有可以检测来自一个种类以上的不同分析物的多个不同的捕获组分；其中一个单个样品可以含有来自一个种类以上的分析物，并且由此结合的分析物指示感染。一个装置可以含有多个测试体积，这些测试体积含有多个不同的分析网以捕获来自一个样品的多种不同的分析物。所述装置含有可以容纳有助于检测结合并固定到所述分子网上的特定分析物的缓冲剂、溶液、洗液、检测分子、催化剂、和其他分子的控制室(containment chamber)。所述装置可以含有结合到一个或多个种类的可检测分子的多个不同分析物检测分子，由此可以通过固定所述可检测分子检测分析物的存在。所述装置可以含有多种溶液，这些溶液可以含有酶或化学反应中涉及的催化剂、底物和其他分子；如果通过结合到一个或多个分子网的一种或多种不同分析物固定分析物检测分子，那么由此所述分析物检测分子上的可检测分子可以化学地与催化剂和底物相互作用以产生可检测的信号。所述装置可以含有串联或并联连接的一个或多个信号传感器或信号放大器以检测并传播信号。所述装置可以含有一个或多个相同的放大器和传感器，或者可以含有一个或多个不同的放大器和传感器。

III.分子网的制作和特性

A.分子网的组成与结构

在它的最基本形式中，分子网是包括以下两个大类的亚基的一种分支的假无规共聚物：捕获剂和连接剂。这些亚基或“单体”自组装以形成能够结合到样品中的预定目标、“或分析物”上的结构。通过使样品(例如一滴全血)与分子网接触，并且检测被分子网结合的多个目标(例如病原体蛋白)的存在或缺乏，有可能确定在样品中是否存在一个、一些或所有的目标分子。在医学诊断、环境取样、和其他用途中发现了分子网的应用。

如将变得明显，该分子网结构提供了许多胜过常规诊断装置的优点。

首先将描述一种简单的(“单层”)分子网，随后描述更复杂的(“多层”)分子网。对单层分子网的描述部分地有助于理解多层网。对于许多应用，多层网是优选的形式。本发明的装置(包括单样品装置)可以含有一个或若干个单或多层网。

正如所指出，分子网可以被描述为包括捕获剂和连接剂的一种分支聚合物。

1.捕获剂

捕获剂是特异性结合分析物或目标的大分子。为了说明而不是限制，捕获剂的实例包括抗体、抗原、配体、抗配体(antiligand)、受体、核酸、和凝集素，它们分别特异性结合到抗原、抗体、抗配体、配体、受体配体、互补核酸、和碳水化合物上。表1中提供了多个种类的捕获剂的实例。通常，分析物和捕获剂之间的相互作用是非共价的。

捕获剂含有至少两个、并且通常是若干个或许多个反应基团，通过它与连接物官能团(在以下描述)可以反应以形成共价键。示例性反应基团是多肽的氨基末端和赖氨酸ε-氨基和核酸中的3'-羟基。表1中提供了在捕获剂上发现的反应基团的另外的实例。在一些情况下，可以衍生一种生物捕获剂，如免疫球蛋白，以添加实际上不与因子缔合的反应基团。例如可以通过添加胺基来改性寡核苷酸。在本发明的一些实施方案中，并未如此衍生该生物捕获剂，但是只包括通常与该类生物分子缔合的反应基团。

捕获组分可以包括，但并不局限于：多肽；抗体；多核苷酸；碳水化合物；酶；脂质；小分子药物；生物治疗剂；疫苗组分；变应原；激素结合分子；脂质结合分子；胆固醇结合分子；酶底物；哺乳动物细胞组分；哺乳动物细胞产物；病毒组分；病毒产物；细菌细胞组分；细菌产物；寄生虫细胞组分；寄生虫产物；真菌细胞组分；真菌产物；朊病毒；类病毒；类病毒产物；细胞外基质组分；哺乳动物细胞因子；哺乳动物细胞因子受体；哺乳动物可溶性受体和孤儿受体；配体和其他分子。

在一些实施方案中，分子网由通过一种或一种以上的化学交联剂以保护所述捕获分子的三维结构和结合能力的方式连接在一起的多肽和/或核酸捕获分子组成。

在提及分子网时，可以使用以下术语来描述单独网中的捕获剂。一种可以是指一种单分子(例如一种单一的抗体分子)、一个单个种类(例如具有相同目标特异性的多种抗体分子)、多个种类(例如识别不同目标的抗体的种类)、或单个或多个分开种类的捕获剂种类(例如核酸、抗体、适体等，参见表1)。还可以通过参考目标特异性描述捕获剂(例如结合普通目标分子的多个不同的表位的多克隆抗体混合物可以被称为关于目标特异性的单个种类)。

表1

示例性捕获剂

DNA结合蛋白可以被用作捕获剂。为了说明而不是限制，实例包括：

含有富含亮氨酸重复序列和任选地以下基序的核酸结合多肽：LXZL(SEQ ID NO：1)和FXZL(SEQ ID NO：2)以及VXZL(SEQ ID NO：3)，其中L＝亮氨酸，F＝苯丙氨酸，V＝缬氨酸，X＝甘氨酸或丝氨酸或脯氨酸或苏氨酸，并且Z＝天冬酰胺或精氨酸或甘氨酸或苏氨酸。

包括序列VPTLEELNLSYNNIMTVPAL(SEQ ID NO：4)的核酸结合多肽。

包括序列LGNLTHLSLKYNNLTVVPRNLPSSLEYLLLSYNRIVKLAPED(SEQ ID NO：5)的核酸结合多肽。

包括序列LEGLVLKDSSLSWLNASWF GLGNL(SEQ ID NO：6)的核酸结合多肽。

或衍生自含有富含亮氨酸重复序列的toll样受体9的其他肽。

在一些实例中，单链DNA结合多肽可以含有以下基序：FGXZ(SEQ ID NO：7)，其中F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，X＝精氨酸或赖氨酸，Z＝亮氨酸或缬氨酸或丝氨酸或丙氨酸或甘氨酸或苯丙氨酸或色氨酸或天冬氨酸或组氨酸。

单链DNA结合多肽可以含有以下基序：FGXZ(SEQ ID NO：8)，其中F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，X＝精氨酸或赖氨酸，Z＝亮氨酸，缬氨酸，丝氨酸，丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，天冬酰胺或组氨酸。

在一些实例中，单链RNA结合多肽可以含有以下基序：FGKI(SEQ ID NO：9)和RGF，其中F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，K＝赖氨酸，I＝异亮氨酸并且R＝精氨酸。

来自单链DNA结合蛋白的DNA结合域，这些结合蛋白例如是大肠杆菌ETEC HI 0407[登录号CBJ04410.1]，肠道沙门菌[ADK62159.1，ZP 03346359.1]，肺炎克雷伯菌[YP_003517675.1，YP_003517470.1]，阴沟肠杆菌[YP_003610832.1]，铜绿假单胞菌[ZP_06876710.1，NP_252922.1]以及其他结合蛋白。

含有聚精氨酸、聚赖氨酸或长度为8-22个氨基酸的精氨酸和赖氨酸区域的组合的肽。

单链RNA结合多肽可以含有以下基序：FGKI和RGF，其中F＝苯丙氨酸，G＝甘氨酸，K＝赖氨酸，I＝异亮氨酸并且R＝精氨酸。

例如，该网可以含有1-50个异质性多核苷酸结合蛋白；所述多核苷酸结合蛋白具有处于氢键和/或与具体的多核苷酸序列的离子或静电相互作用形式的内在结合亲和力；或者可以能够与多个RNA或DNA片段或染色体或质粒非特异地相互作用。

抗体

例如，分子网可以含有1-50中不同的抗体；每一个针对分析物的1-50个不同的特征(表位)；或者可以结合在样品中的1-50种异质性分析物上的1-50个之间的不同的表位；并且其中该网的每一种抗体可以具有2种分析物的最大结合潜力。

抗体捕获剂的实例包括针对以下项的抗体：细胞色素P450家族成员；同种型；以及其他成员(例如但并不局限于：P450 1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4、3A5、3A7、和其他同种型)；和/或细胞色素P450底物(例如但不限于：咖啡因、氟派啶醇、雌二醇、萘普生、普萘洛尔、维拉帕米、塞来考昔、美沙酮、西立伐他汀、布洛芬、氯沙坦、它莫西芬、地西泮、兰索拉唑、奥美拉唑、普罗帕酮、氯米帕明、氟派啶醇、可待因、氟烷、阿奇毒素、地西泮、他克莫司、环孢霉素、维拉帕米、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、孕酮、阿瑞吡坦、地塞米松、紫杉酚和其他底物)；和/或细胞色素450抑制剂(例如但并不局限于：环丙沙星、西眯替丁、氟喹诺酮类、干扰素、甲氧苄啶、氟康唑、氟伐他汀、异烟肼、洛伐他汀、兰索拉唑、雷贝拉唑、氯霉素、西米替丁、塞来考昔、氯马斯汀、奎尼丁、克拉霉素、阿瑞吡坦、红毒素、伊马替尼和其他抑制剂)；和/或细胞色素450诱导剂(例如但并不局限于：胰岛素、奥美拉唑、利福平、苯巴比妥、卡马西平、炔诺酮、地塞米松、异烟肼、苯巴比妥、糖皮质激素、依法韦仑、曲格列酮和其他诱导剂)。

抗体捕获剂的其他实例包括针对骨骼；肌肉；上皮；内皮；内分泌；肾的；肝；神经；血管；冠状动脉；和细胞的健康和/或损伤；细胞毒性；和/或炎症的非蛋白和/或蛋白标记的抗体；并且其中捕获组分可以是核酸结合多肽并且可以结合核酸分析物，这些核酸分析物含有可以指示对以下项的敏感性的单核苷酸多态性：药物毒性；疾病；药物配伍禁忌；药效；以及其他健康和/或疾病的指示物。还可以使用其他结合分子。

抗体捕获剂的其他实例包括一种或多种针对以下各项的抗体的组合：人铁蛋白；脂质A；细菌脂多糖；细菌肽聚糖；脂磷壁酸；磷壁酸；霉菌酸；细菌鞭毛；伞毛；菌毛蛋白；菌毛；糖萼；粘液层；荚膜；细菌热休克蛋白；细菌脂蛋白；细菌铁载体；以及其他细菌产物；

捕获组分可以是一种或多种单链DNA结合多肽的一个组合；并且其中捕获组分可以是一种或多种抗体；多肽；脂质；碳水化合物；和/或二价阳离子的一个组合；其可以特异性结合：人铁蛋白；脂质A；细菌脂多糖；细菌肽聚糖；脂磷壁酸；磷壁酸；霉菌酸；细菌鞭毛；伞毛；菌毛蛋白；菌毛；糖萼；粘液层；荚膜；细菌热休克蛋白；细菌糖蛋白；细菌脂蛋白；细菌铁载体；以及其他细菌产物。

抗体捕获剂的其他实例包括一种或多种针对以下各项的抗体的组合：黄曲霉毒素；伏马菌素；一起其他真菌毒素；甲壳质；麦角固醇；真菌脂蛋白；真菌糖蛋白；以及其他真菌产物。

捕获组分可以是针对以下各项的一种或多种抗体的一个组合，这些项包括：甲壳质；几丁质酶；甲壳质结合域和/或MQMTKAEFTFANLKHDDLEEIYSELSD QFPYWD(SEQ ID NO：10)(Genbank登录号157801001)；YITCLFRGARCRVYSGRSCCFGYYCRRDFPGSIFGTCSRRNF(SEQ IDNO：11)(Genbank登录号126030190)；或可以结合甲壳质的任何其他多肽；并且其中捕获组分可以是一种或多种可以特异性结合黄曲霉毒素；甲壳质；麦角固醇；真菌脂蛋白；真菌糖蛋白；真菌毒素；以及其他真菌产物的抗体；多肽；脂质；和/或碳水化合物的一个组合。

抗体捕获剂的其他实例包括一种或多种针对以下各项的抗体的组合：干扰素α干扰素β病毒壳体蛋白；病毒刺突蛋白；病毒整合酶；病毒血凝素；病毒神经氨酸酶；病毒逆转录酶；病毒糖蛋白；病毒脂蛋白；以及其他病毒产物；并且其中捕获组分可以是一种或多种单链DNA结合多肽；单链RNA结合多肽；双链DNA结合多肽；双链RNA结合多肽；以及可以结合病毒核酸的其他分子的一个组合；并且其中捕获组分可以是一种或多种可以特异性结合人干扰素α人干扰素β病毒壳体蛋白；病毒刺突蛋白；病毒整合酶；病毒血凝素；病毒神经氨酸酶；病毒逆转录酶；病毒糖蛋白；病毒脂蛋白；以及其他病毒产物的抗体；多肽；脂质；和/或碳水化合物的一个组合。

捕获剂可以是能够结合细胞色素P450分子；和/或基因；和/或底物；和/或诱导剂；和/或抑制剂的分子；以及其他的编码；和/或修饰；和/或调节细胞色素P450分子的分子。

多核苷酸

例如，该网可以含有1-500种不同的多核苷酸；它具有针对1-500种具体的多核苷酸的处于氢键和/或离子或静电相互作用形式的内在结合亲和力；或者它可以通过复合溶液中的氢键；离子键；和/或静电相互作用结合1-500种不同的多核苷酸结合蛋白。

其他捕获剂

分子网可以含有捕获组分，如LPS结合蛋白、CD14、多粘菌素B和可以结合脂质A、内毒素和/或脂多糖、以及其他微生物脂类的其他分子；并且由此捕获组分可以是能够结合肽聚糖、鞭毛蛋白、副猪嗜血杆菌pilA、伞毛、热休克蛋白和诱导炎症的其他细菌产物的抗体；和/或由此捕获组分可以是能够结合真菌细胞组分和真菌产物的抗体；和/或由此捕获组分可以是能够结合病毒组分和病毒产物的抗体；和/或由此捕获组分可以是能够结合哺乳动物促炎细胞因子(例如组胺、TNF、IL-1β、INFγ和脓毒症中涉及的其他分子)的抗体。

分子网可以含有能够结合生长因子受体和肿瘤细胞表面上的其他肿瘤细胞标记的捕获组分；并且由此所述分子网可以将所述肿瘤细胞固定在柱；盒；管；和其他装置之内；并且由此非肿瘤细胞可以穿过所述装置。

分子网可以含有能够结合并固定T细胞受体、B细胞受体、主要组织相容性复合体、和细胞表面上的其他抗原识别细胞表面标记的捕获组分；并且由此所述分子网可以结合并固定特异性细胞产物；并且由此所述分子网可以将免疫细胞和/或免疫细胞产物固定在柱；盒；管；和其他装置之内；并且由此未固定的细胞和细胞产物以及流体可以通过所述装置；并且所述未固定的试剂可以回到生物源。

分子网可以含有捕获组分，使得可以结合重金属、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、细胞因子、胰岛素、激素、药物、以及在哺乳动物中可以异常升高的其他分子。

分子网可以含有捕获组分，这些捕获组分可以是有机的或无机的分子和/或活微生物细胞，这些分子和活微生物细胞可以结合和/或吸收和/或储存化学物质，例如重金属、石化产物、汽油、除草剂、农药、和其他环境污染物。

捕获剂的还有其他实例是生物可用形式的金属(例如铁、锰、镁、和其他金属)；细胞外基质(例如藻酸盐泥、纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原、和其他胞外基质)；抗体(例如株特异性抗体、种特异性抗体、抗TNF、抗花生蛋白、抗甲壳质、抗原肌球蛋白、抗肽聚糖、抗脂质A、抗脂多糖、抗鞭毛蛋白、抗pilA、抗伞毛、抗脂磷壁酸、抗铁蛋白、抗CCP、抗干扰素α、抗干扰素β、抗干扰素γ、抗黄曲霉毒素、抗小鼠几丁质酶1(chit1)、抗去铁胺B、抗铁色素、抗2,2-联吡啶、抗红酵母酸、和其他抗体)；抗原(例如pilA、菌毛、鞭毛蛋白、鞭毛、热休克蛋白、瓜氨酸化蛋白、和其他抗原)；受体(例如类固醇受体、信息素受体、TNF受体I、TNF受体II、IFN-α受体I、IFN-α受体II、半乳糖受体、唾液酸受体、甘露糖受体、和其他受体)；配体(例如唾液酸、甘露糖、肿瘤坏死因子和其他配体)；酶(例如几丁质酶和其他酶)；底物(例如甲壳质、原肌球蛋白、和其他底物)；细胞(例如非克隆性和克隆性T细胞、非克隆性和克隆性B细胞、巨噬细胞、树突细胞、神经细胞、心肌细胞、内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞、基质细胞、β细胞、上皮细胞、肺上皮细胞、骨骼肌细胞、小胶质细胞、枯否氏细胞、肥大细胞、嗜碱细胞、嗜中性白细胞、角化细胞和其他细胞)；来自一个或多个属、种、或株的完整的或破坏的微生物，例如鲍氏不动杆菌、不动杆菌属、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌属、链球菌属、分枝杆菌属、奈瑟菌属、沙门菌属、志贺菌属、衣原体属、疏螺旋体、肺炎克雷白杆菌、克雷白菌属、埃希菌属、假单胞菌属、密螺旋体、支原体、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、弹状病毒、逆转录病毒、嗜肝病毒、黄病毒、假丝酵母属、曲霉菌、疟原虫、阿米巴、和其他微生物；药物(例如类固醇、非甾体抗炎剂分子、β阻断剂、他汀类、和其他药物)；生物制剂(例如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、PEG-sTNF-RI、和其他生物制剂)；结合域(例如甲壳质结合域和其他结合域)；结合蛋白(例如flgl5、脂多糖结合蛋白、肌动蛋白、和其他结合蛋白)；核酸结合蛋白(例如单链DNA结合蛋白和其他核酸结合蛋白)；含核酸的核糖体DNA序列；含核酸的基因或基因片段；正义RNA、反义RNA；碳水化合物结合分子(例如dectin-1、retrocyclin 2、凝集素、甘露聚糖结合蛋白和其他结合分子)；防御素；抗原识别分子(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和其他分子)；抗原提呈分子(例如主要组织相容性复合体I和主要组织相容性复合体II以及其他分子)；孤儿受体(例如可溶性TNF受体和其他受体)。

2.连接剂

连接剂(或“连接物”)被用来使捕获剂彼此相连。在本领域中的大量的适合的连接物是已知的，并且很多是可商购的。参见例如Hermanson(赫曼森),G.T.，BIOCONJUGATETECHNIQUES(生物结合技术)，第二版，2008，Elsevier Inc.公司，牛津，通过引用将其结合在此。最常见地，连接剂是双功能的(同双功能的或异双功能的)。双功能连接剂具有两个官能团，其中每一个都可以结合捕获分子的反应基团。(仅仅是为了易于引用，捕获剂上的化学反应基团称为“反应基团”，同时连接物上的化学反应基团称为“官能团”)。为了说明而不是限制，在表2中提供了双功能连接剂的实例。在可商购的连接物中普遍使用的官能团包括酰胺、叠氮化物、酰亚胺、和酯。在某些实施方案中，可以使用三功能或多功能连接剂。多功能连接剂包括羟甲基膦基连接物和三氮烯连接物。

除了连接物官能团的性质之外，一个重要的连接物特性是有效长度，它大约为连接到同一连接物分子上的两种捕获剂之间的距离。为了描述，有效长度可以被认为大约与发布的延伸的链长(按埃计)相同。例如连接物琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)具有大约的长度，同时连接物5双-dPEG6NHS酯具有大约的长度。连接物长度还可以通过参考链中的碳的数目、通过参考连接物中的重复单元(例如乙二醇单元)的数目等而被表征。使用不同的连接物或连接物的不同组合可以构成不同的分子网，在某些型式的分子网中，在多层结构中，一个或多个连接物长度可以逐层变化。在这些背景下，将理解的是，关于优选的连接物长度，仅仅被预期为近似。

例如基于长度，可以将连接物分为四类：

i)零长度连接物(1-乙基-10-[10-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC))；

ii)短的、非选择性的连接物(例如甲醛、戊二醛)；

iii)具有范围在大约6至大约的长度的连接物；

iv)具有的长度的连接物。

EDC促进氨基和羧基部分的连接，但是本身并不生成一个物理连接物。短的、非选择性的连接物可以被用来稳定分子网层。在科学文献中描述了具有范围在大约6至大约的长度的多个连接物；在表2中提供了实例。在科学文献中描述了具有的长度的连接物，并且可以如在实例12中所述进行制造。

在一些实施方案中，分子网或分子网层含有至少一种具有范围在大约6至大约的长度的连接物。在一些实施方案中，分子网或分子网层含有至少一种、至少两种、至少三种、或三种以上的具有范围在大约6至大约的长度的连接物，和/或一种或多种具有大于的长度的连接物。在一些实施方案中，分子网含有至少一种不是甲醛或戊二醛的连接物，和/或至少一种不是零长度连接物的连接物。

应当理解的是，优选使用不形成均聚物的连接物。在制作分子网中使用多个种类的连接物时，选择连接物和/或连接条件，以便将只有连接物的异源低聚物或聚合物的形成降至最低。

在某些网或网层(例如其中捕获细胞的分子网)中，长的连接物可能是有用的。在一些情况下，可以如在实例12中所述制备长的连接物。简要地，在这个方法中，通过两种杂二功能连接物连接直链的生物聚合物(多糖、多肽、或多核苷酸)，使得生成的分子包括被生物聚合物加上连接物的长度隔开的两个反应基团。

交联剂可以结合一个以上的捕获组分；并且可以按保护捕获组分的二维或三维结构的方式结合一个类型以上的捕获组分，并且可以保护捕获组分的二级；三级；或四级结构。优选地，保护了捕获组分的至少一个分析物识别基序或结合位点的结合。

示例性的化学交联剂包括[N-e-马来酰亚胺己酰基]琥珀酰亚胺酯(EMCS)、乙二醇二[琥珀酰亚胺琥珀酸酯](EGS)、NHS-(PEG)n-马来酸二胺、NHS-(PEG)n-NHS，并且其中n可以是1至50；由此化学交联剂的长度可以在2和200埃之间。

可以按范围从1纳摩尔至1毫摩尔的不同浓度施用交联剂。将选择交联剂和浓度，以便达到在不同条件(例如像0至45摄氏度的温度)、缓冲条件(例如0至800毫摩尔盐和0％至11％洗涤剂)下的分子网稳定性。交联剂被选择为使得制作的网抵抗冷冻干燥，随后是再水合。

表2

B.分子网的制作

为了生产本发明的分子网，使具有反应基团的捕获剂(“捕获剂反应基团”)与具有互补官能团的连接物(“连接物官能团”)结合。在这种背景下，“互补”表示两个基团相互作用以形成共价化学键。

在一个方法中，通过结合至少一个(并且更通常多于一个)种类的捕获剂和至少一个(并且更通常多于一个)种类的连接剂来制备分子网。假设使用双功能的连接剂，在以下条件下结合捕获剂和连接物，在这些条件下该网中的大多数连接剂分子被结合到两种捕获剂上，并且每一种捕获剂经由连接物而连接到一种或多种其他捕获剂上。将预期的是，取决于一种或多种连接物和捕获剂，一些连接物可以与单个捕获剂分子形成分子内键，但是选择溶剂、pH、缓冲剂、温度、单体浓度等条件，来促进不同捕获剂分子彼此连接。将认识到的是，如果在制作期间未被洗掉，未连接的或单连接的捕获剂可以陷入分子网中，但是多数或基本上所有(例如>95％或>99％)的捕获剂都连接到至少一种其他捕获剂上。

将认识到的是，如果使用多功能连接剂，那么可以将单独的连接物结合到两种以上的捕获剂上。

在生成的分子网中，捕获剂彼此直接连接以形成一个无定形的三维结构，与以下结构相反，例如其中多种捕获剂(例如抗体)单独地连接到位于下面的基底或一个或多个聚合物链上。

可以描述生成的分子网，为了描述而不是限定的目的，作为一种分支的假无规共聚物，其中单体是捕获剂和连接剂。

分子网可以称为无规共聚物，因为给定多个种类的二或多功能连接剂、具有多个反应基团的捕获剂、以及多个种类的捕获剂的混合物，生成的分支的聚合物具有不可预测的、不规则的、网络的结构。

分子网可以称为假无规共聚物，因为与真的无规聚合物相反(a)连接物结合捕获剂但是优选并不结合连接物，并且捕获剂结合连接物而不是其他捕获剂，以及(b)并不是连接物上的每一个反应基团都可以结合任何捕获剂分子上的反应基团(例如在含有抗体和DNA捕获剂、以及磺基-NHS连接物和琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧)]-丁酸酯(SPB)连接物的组合物中，磺基-NHS连接物将连接抗体但是将不与核酸反应，同时SPB异双功能连接物将不结合抗体到DNA)。

为了说明，可以如下形成分子网，(1)在一个位置沉积含有一种或多种捕获剂(典型地是一个集合的捕获剂组合物)的溶液，以及(2)在其中连接物和捕获剂形成一个交联网的条件下，向捕获剂溶液中添加一种或多种连接物(典型地是一个集合的连接物组合物)。例如可以将捕获剂沉积在一个平面表面上(例如在一个疏水基底上)。典型地，该网是自组装的连接物和捕获剂的以下混合物。然而，并不排除在一些实施方案中，可以使用化学催化剂或其他试剂(例如光活化的可光活化连接物)以促进形成该网。以下将更详细地描述制作方法。

在结合了单体并且形成该网之后，有时骤冷该结合反应(例如使用让这些连接物不反应的小分子)和/或除去任何连接的捕获剂和/或连接物是有用的。例如，可以通过使用任选地含有洗涤剂的水性缓冲剂洗涤该网，来除去未连接的单体。

以下将讨论示例性的基底。该基底可以是惰性材料、多孔材料(例如硝酸纤维素)、衍生以结合该网的材料，等。适合的用于制造分子网的基底包括，但并不局限于硝酸纤维素、聚苯乙烯、和聚氨酯。如果该基底包括反应基团，那么该网的第一层可以与该基底共价结合。在一些情况下，在可去除的模具内结合这些单体。

在一些实施方案中，如以下所讨论的，可以在一个“升高的分子基质”或“下层”(例如未交联多肽基质)上形成该网。当该下层是蛋白质时，它可以包括存在于该网的第一层中的一种或多种或所有的捕获剂，或者可以包括其他蛋白质(例如BSA)或分子(例如碳水化合物)。在一个替代的实施方案中，“下层”并不包括捕获剂(例如并不包括在该网的层中发现的捕获剂)。在一个替代的实施方案中，该“下层”只与戊二醛或甲醛交联。

在一个替代的方法中，可以通过在注射器或其他容器中结合连接物和捕获剂，并且将该混合物挤入由此发生交联的液体中而形成网。

任选地，可以通过使该网与甲醛或戊二醛接触(典型地0.037mM，在环境温度下接触15min)来稳定分子网(或分子网层)。

C.捕获剂和连接物组合物

在一些实施方案中，分子网只包括一个单一种类的捕获剂(例如抗干扰素-α抗体)。更通常地，分子网包括具有不同结合特异性的多个不同(异质性)种类的捕获剂(例如抗干扰素-α抗体、抗干扰素-β抗体、和抗蝰蛇毒素抗体)。通常，分子网包括多个种类的捕获剂(例如抗干扰素-α抗体、DNA结合分子和寡核苷酸)。

类似地，该网可以含有一个或多个种类的连接物。

以下将描述用于选择捕获剂和捕获剂的组合的方法。

D.多层分子网

虽然简单的分子网具有有用的特性，但是在优选的实施方案中，形成了更复杂的分子网。在一个步骤中，简单的网可以被称为“一区域”或“一层”网，这些术语是可互换地使用的。更复杂的网可以被称为“多层”、“两层”、“三层”等分子网。多层网可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个层。用于诊断目的的分子网通常具有至少两个层并且通常具有两个以上的层(例如3-8层)。

通过以下方法制备两层网：如以上所述制作一个一层网，并且通过结合该一层网与至少一个(并且更通常多于一个)种类的捕获剂和至少一个(并且更通常多于一个)种类的连接剂来制作第二分子网。虽然不完全准确，但是使制造另外的网层的过程可视化是合宜的，该过程为：在一层网的顶部上移液捕获剂与连接物的溶液，以形成置于第一层上的不同的第二层，任选地制造一个第三层等，导致一个大致圆柱形的结构或一个大致同心系列的半球状层。图1展示了多层分子网。

通常，选择这些连接物和捕获剂，使得多层网的一个层的组成不同于至少一个其他层的组成。在一些实施方案中，该至少一个其他层是一个相邻层。在一些实施方案中，选择这些连接物和捕获剂，使得多层网的一个层的组成不同于该网的所有其他层。例如，在一些型式中，第二层的组成不同于第一层的组成。因此，在捕获剂组成和/或连接物组成方面，第二层可以不同于第一层。作为试剂和连接物的选择的结果，两个层可以具有不同的孔隙率。为了说明而不是限制，在表3中显示了两层分子网的实例。

表3

正如对于细心的读者明显的是，分子网的多孔性质表示在第二步中添加的连接物和捕获剂将不必需完全保持在第一层的“顶部”上。而是，连接物和剂可以迁移到第一层的“孔”中。然而这样的迁移可能是有限的，这样当这两个群的连接物和捕获剂可能在第一和第二层之间的界面处有点混杂时，生成的多层网的第一层的底部(假设此时是一个圆柱形结构)将具有在第一步骤中添加的连接物和捕获剂的组合物，并且多层网的最外层或最顶层的顶部将具有在第二步骤中添加的连接物和捕获剂的组合物。

该混杂的一个结果是，在两个层之间的界面处的组成可能有点不同于用于形成这两个层中的任一个层的组分。

在具有同样的捕获剂和连接物组成的两个层之间的界面(例如一个多层网，其中每一个层都具有同样的组成)还将不同于该网的非界面区域。典型地，作为制作方法的结果，在界面中的捕获剂和连接物的浓度是更高的。也就是说，使用1微升的每一种捕获剂和连接物溶液形成第一层，然后通过添加1微升的每一种捕获剂和连接物溶液到预成形第一层上来形成第二层，与从2微升的每一种捕获剂和连接物形成一个单层相比，这将导致捕获剂和连接物的不同密度和分布。

在一个实施方案中，多层网可以具有作为一个核心的一个层，以及形成为围绕该核心的同心半球或一个或多个壳的另外的一个或多个层。然而，其他形状是可能的。例如，虽然多层分子网可以具有大致圆柱形或或大致矩形的形状。例如，多层网可以在一端比在另一端更窄(例如锥形)。在一个优选的实施方案中，如此配置这些层，这样与最上(或最外)层接触的液体(例如样品)可以依次流过每一个随后的层。也就是说，并不是所有“层”是同时或同样地可进入的。

将认识到的是，在第二步骤中添加的连接物，除了使在第二步骤中添加的捕获剂彼此交联之外，还将在第一层中的捕获剂与在第二层中的捕获剂连接，因此使这些层彼此结合。

我们已经发现的是，具有特定连接物的多层网以及在每一种连接物中的捕获剂组成都被赋予了许多有价值的特性。例如，分子网具有同时捕获具有不同大小和不同化学的不同的多个种类的分析物的能力。这允许同时检测感染的多个标记(例如)，进而提供了更高的在结果方面的置信度。此外，我们已经观察到的是，相对于其他检测方法，分子网达到了高信噪比和低的非特异性结合。对于给定的足迹，分子网配置促进了更多的每单位面积的结合和检测，导致更容易地可检测的信号(例如视觉上可检测的颜色信号)。此外，分子网容易地适应许多种装置规格，并且是稳定的和可储存的。

E.结合目标的检测

可以用符合分析物的性质的常规方法检测结合到分子网上的分析物。最通常，固定的分析物被可检测地标记的抗配体结合，洗掉未结合的标记的抗配体并且检测该标记。例如，可以使用特异性结合目标蛋白的抗体检测蛋白分析物(包括细胞和细胞片段)。可以使用标记的凝集素或其他碳水化合物结合剂检测碳水化合物。可以使用可检测地标记的互补核酸或使用核酸结合蛋白检测核酸分析物。示例性核酸结合蛋白包括双链DNA结合蛋白，例如bZIP、拓扑异构酶、含锌指蛋白、螺旋-转角-螺旋蛋白、核酸酶、和其他蛋白；以及单链DNA结合蛋白、DNA多聚酶和其他蛋白。此外，我们已经开发了新颖的结合蛋白，如在这以下所作描述。

可替代地，抗配体可以是未标记的，并且然后在它已经结合到结合的分析物上之后与标记缔合。例如，未标记的山羊IgG可以与被捕获剂结合的分析物缔合，并且然后使用可检测地标记的小鼠抗山羊IgG抗体进行检测。作为一个其他实例，可以使用生物素结合的抗配体，并且然后使用链霉亲和素结合的可检测标记进行检测。

在一个不同的实施方案中，可以通过添加能够被酶转化以产生可检测信号的底物检测结合的酶(虽然并不必需定位)，或者可以通过添加产生可检测信号的酶和试剂检测结合的底物。在一些情况下，在结合到分析物之后，捕获剂自身可以经历一个构象变化，使得发射可检测信号，和/或使得可以检测分析物-捕获剂复合物。

可以同时使用分析物检测分子、或检测试剂的异质性组合来检测捕获剂结合的分析物。示例性分析物检测分子包括适体；多聚核糖核酸探针；多聚脱氧核糖核酸探针；肽；蛋白质；抗体；功能或非功能性酶；底物结合域；糖蛋白；脂蛋白；碳水化合物；糖脂类；受体；配体结合域；配体；脂质；胆固醇；甾醇；药物；生物制剂；抗生素；抗细菌剂；抗病毒剂；抗霉菌剂；抗寄生虫剂；哺乳动物细胞；和微生物；并且由此可以用一种或多种可检测标记来标记所述异质性分析物检测分子；其中一个或多个类型的分析物检测分子到一个或多个类型的被属于一个或多个分子网的一种或多种捕获组分固定的分析物的结合可以产生信号或产生增强的信号；并且可以指示阳性测试。

应当理解的是，这些实例是为了说明而不是限制，并且很多其他方法是有可能的。例如，可以在固定之前使分析物与可检测标记缔合。

许多可检测标记在本领域是已知的，例如比色的、荧光的、放射性的、发光的、发磷光的、酶的标签((例如碱性磷酸酶、萤光素酶)亲和标签)等。原则上可以使用任何类型的可检测标记。然而，最优选的是适合比色和/或荧光检测的标记。用肉眼而不用专门化的装置可检测的可见标记具有某些优点。不需要添加另外的底物或试剂的发射信号的标记可以提供更快和更便宜的读出。

荧光可检测标记的实例包括Cy3、Cy5、FITC、PE、Alexa、荧光素、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、丽丝胺、藻红蛋白、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、SyB绿，等。比色可检测标记包括染料、胶体金或银、着色的胶乳珠。

可以将一个或多个种类的分析物检测分子结合到一种或多种特异性可检测分子上，这些可检测分子例如：酶(例如辣根过氧物酶、碱性磷酸酶、三磷酸腺苷酶、腺苷酸激酶、β-内酰胺酶、脲酶、乳糖酶、丙酮酸脱氢酶、碳酸酐酶、过氧化氢酶、延胡索酸酶、超氧化物歧化酶、二氢叶酸还原酶、环氧合酶、激酶、磷酸酶、萤光素酶、细胞色素P450氧化酶、以及其他氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶类、异构酶、和连接酶类)；超细微颗粒(例如纳米颗粒、纳米晶体、纳米簇、纳米粉、以及由碳、二氧化硅、陶瓷、聚合酶、玻璃、和材料复合物制成的其他颗粒)；荧光团(例如9,10-二苯基蒽、1-氯-9,10-二苯基蒽、2-氯-9,10-二苯基蒽、9,10-双(苯乙炔基)蒽、1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽、2-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽、1,8-二氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽、2,4-二-叔丁基苯基1,4,5,8-四羧基萘二酰胺、罗丹明B、5,12-双(苯乙炔基)并四苯、紫蒽酮、16,17-(1,2-亚乙二氧基)紫蒽酮、16,17-二己氧基紫蒽酮、16,17-丁氧基紫蒽酮、N,N'-二(2,5,-二-叔丁基苯基)-3,4,9,10-苝二甲酰亚胺、1-N,N-二丁基氨基蒽、6-甲基吖啶碘化物、Cy3、Cy5、Cy7、太平洋蓝、FITC、PE、DiA、尼罗红、Totol和3、Yoyol和3、SYBR绿、Sytox橙、Popol和3、Bobol和3、Evoblue-30、DY-485、DY-500、DY-554、DY-633、DY-613、DY-590、DY-650、DY-490XL、DY-520XL、DY-480XL、Alexa488、Alexa647、ProQ祖母绿、ProQ钻石、IRDye 700DX、Adams(亚当斯)苹果红680、Adirondack(阿迪朗达克)绿520、桦木黄580、蛇眼红900和其他荧光团)；氧化还原依赖性标记(例如2,2'-联吡啶(Ru复合物)、硝基菲咯啉(Fe复合物)、N-苯基邻氨基苯甲酸、1,10-菲咯啉(Fe复合物)、N-对乙氧基菊橙、2,2'-联吡啶(Fe复合物)、5-6-二甲基菲咯啉(Fe复合物)、邻-联茴香胺、二苯胺磺酸钠、二苯基联苯胺、二苯胺、紫精、和其他标记)；pH依赖性氧化还原标记(例如2,6-二溴苯酚-靛酚钠、2,6-二氯苯酚-靛酚钠、邻-甲酚靛酚钠、硫堇、亚甲蓝、靛蓝四磺酸、靛蓝三磺酸、靛胭脂、靛蓝单磺酸、酚藏花红、番红T、中性红、和其他标记)；可见染料(例如考马斯亮蓝、Sypro Ruby、银染剂、和其他染料)；底物(例如萤光素、氧、鲁米诺、过氧化氢、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、磷酸对硝基苯、和其他底物)；放射性同位素(例如氚、碳-14、磷-33、磷-32、锝-99、钼-99、硫-35、和其他同位素)；聚合物(例如聚磺苯乙烯胶乳和其他聚合物)；胶体(例如胶体晶体、胶体金属、10-60nm胶体金颗粒、10-80nm胶体银颗粒和其他胶体)；磁性颗粒(例如赤铁矿、不锈钢、铜、铁、磁铁矿、锌、合金、镍、钴、钆、和其他磁性颗粒)；过氧化氢、和苯基草酸酯。

在分析物检测分子上的可检测标记可以与染料分开结合，这些染料例如：3-3'-二氨基联苯胺四盐酸盐；1,9-二甲基亚甲蓝氯化物；溴甲酚紫；溴苯酚蓝；溴百里酚蓝；二-樟脑醌；荧光素；甲紫；乳香胶；雷氏曼着色剂；甲基紫；氮蓝四唑氯化物；酚红；玫红酸；藏红素；szechrome；噻唑橙；亚甲蓝氯化物；氯三嗪染料(例如但并不局限于汽巴蓝3GA、普施安红H-E7B、普施安绿H-4G和黄H-E3G)；三嗪染料；苏木精染剂；曙红；酸性复红；苦味酸；瑞氏染液；醛复红；间胺黄；银盐；甲苯胺蓝；高碘酸-希夫氏染色剂；马松三色染色剂；马洛里氏三色染色剂；魏格特氏弹性染色剂；Heidenhains'azan三色染色剂；银染色剂；地衣红染色剂；天狼星红F3BA；核固红；阿尔新蓝；碘；罗克沙尔固蓝；中性红；苏丹黑B；油红O；尼罗红；结晶紫和其他可见染料。

用于将标记结合或另外缔合或掺入到抗配体(例如)中的方法在本领域是熟知的。

检测来自固定的标记的信号的方法同样也是熟知的，并且取决于标记的性质。很多装置可用于这样的检测，包括透射仪、色度计、荧光计、发光计、等。

多分析物检测

分子网是强大的工具，部分地是因为它们可以很好地适合同时检测多个不同的分析物。原则上，可以使用单检测系统来检测被网结合的若干不同分析物中的每一种。例如，在网中(其中捕获剂结合“分析物W、X、Y、和Z”)，检测系统抗配体中的每一种都可以用相同的可检测标记来进行标记。这会使得可能确定是否已经未捕获、或捕获至少一种分析物，但是不允许在一些分析物(例如W和Y)而不是其他分析物(例如X和Z)的结合之间易于区分。通过定位捕获部分到特定的层可以解决这一问题。例如，如果层1含有分析物W和X，层2含有分析物X和Y，并且层3含有分析物Y和Z，如果只在层3中观察到结合的可检测信号，那么可以推出样品含有分析物Z但是不含有分析物W、X、或Y。然而，这要求将信号定位到一个特定的层，这可能是不方便的。

可替代地，分析物W、X、Y、和Z可以各自被不同地标记(例如具有不同颜色的染料)，并且基于观察到的标记，可以推出一种分析物的存在或缺乏。应当理解的是，可以结合这两种方法(差别性标记，和基于一个特定的层中的结合的推论)。最后，可以使用多个网来测定样品，例如通过使用具有多个网的装置。例如，可以使用具有三个多层网的装置，其中第一个网具有用于分析物W和X的捕获剂，第二个网具有用于分析物X和Y的捕获剂，并且第三个网具有用于分析物Y和Z的捕获剂。

比色混合是指在光存在下，从一个或多个分子源发射的反射光谱。所述反射在性质上可以是规则的或发散的，并且可以是单次或多次散射。在可检测信号被限制在多层网(分层的或叠加的网)的不同层中时，结合到分析物检测分子的结合的有色可检测分子可以产生不同的颜色；其中可以发生比色混合；其中可以发生一个或多个异染性反应；由此在测试体积中，颜色检测标记的存在可以是阳性测试；并且由此所述有色分析物检测分子可以结合到一种或多种分析物上，由通过交联在一个或多个分子网内而夹持的一种或多种捕获组分固定这些分析物；并且由此所述有色分析物检测分子可以按密集和密堆积的方式结合到分析物上；并且由此可以通过多个透镜放大所述有色分析物检测分子；可以通过磁性极化而被极化；可以被传感器感测；可以在视觉上评定每单位测试体积；并且可以比常规方法更早地在视觉上评定；并且可以比许多常规方法更快地发出阳性测试的信号。

披露了一种或多种分子网和/或多个分子网片的布置，由此捕获分子的布置和捕获分子的对应的特定表面化学以及对特定分析物的对应的结合偏好可以被布置在分子网的多个段内；由此特定分析物到特定捕获分子的结合和固定可以产生一个检测模式；并且其中可以通过固定特异性标记的分析物检测分子来确定检测模式；并且由此所述检测分子可以提供一种或多种信号；并且由此信号的模式和/或布置和/或计时可以提供在二元或分析测试中的信息，可以结合：产生一个不同的阳性信号；可以产生一个强化的信号；

可以通过照相术来监测分析物检测分子到分子网的结合程度；通过眼睛，或者使用测试装置传感器，借助以下各项可以监测分析物检测分子到分子网的结合程度和/或结合强度；振动频率及其变化；热导及其变化；产热及其变化；晕色及其变化；电导及其变化；电势及其变化；磁场及其变化；光产生及其变化；光衍射及其变化；比色吸收及其变化；有色光谱及其变化；电磁势及其变化；电化学电势及其变化；电化学有色光谱及其变化；磷光及其变化；荧光吸收及其变化；化学发光及其变化；电致发光及其变化；声致发光及其变化；机械发光及其变化；压电发光及其变化；破碎光及其变化；热释发光及其变化；摩擦发光及其变化；氧化还原电位及其变化；pH及其变化；以及其他感测或监测测试区中的每单位体积的分子网的检测分子结合的方法；并且由此可以通过以下各项增强信号：放大器的存在；孵育时间；热；光；光子；酸；碱；放大透镜；电流；滤光器；极化作用；以及其他方法；并且由此信号可以发送至以下各项并且可以由其传播：中央处理单元；处理器；微处理器；算术逻辑单元；数据存储；闪速存储器；发送器；调制器，存储装置；计算机硬件；通用串行总线；个人计算机；简易计算机；嵌入式计算机；计算机网络能力；以太网和其他工具；并且由此可以用常规算法分析信号，并且可以用常规软件分析信号。

对于“声致发光”表示在被声音激发时，从液体中的爆聚泡中发射的短脉冲的光。在声学驱动场下，泡运动直至最后的塌陷阶段。

对于“机械发光”表示由固体上的任何机械作用产生的光发射。机械作用可以包括但并不局限于施用超声、拉力、推力、扭力、和其他作用。

对于“破碎发光”表示由机械应力产生的光发射，该应力施用至分子以产生分子破裂。还可以施用到分子的相互作用上，由此破裂可以发生在相互作用对之内或之间。

对于“热释发光”表示由陷在刚性基质中的种类之间的反应产生的光发射，其中光释放是作为升温的结果。

对于“摩擦发光”表示由某些固体的表面的一起摩擦产生的光发射。还可以发生在固体被压碎时。

对于“压电发光”表示由某些固体的压力变化产生的光发射。

对于“变色”表示可以是热的存在或缺乏的结果的在颜色方面的变化。

对于“比色混合”表示在光存在下，从一个或多个分子源发射的反射光谱。所述反射在性质上可以是规则的或发散的，并且可以是单次或多次散射。

在一个实施方案中，通过来自酶反应的光产生，装置可以检测样品中的一种或多种不同的分析物。由此反应物可以结合至每测试体积的一个或多个分子网，并且可以结合每测试体积的一个或多个种类的分析物检测分子。所述分析物检测分子可以被结合到一种或多种光产生酶上，并且可以被固定在每测试体积的一个或多个分子网上。当酶底物存在时可以发生光产生反应。当催化剂存在时，可以放大光产生反应。当一个或多个光利用(light harnessing)装置存在时，可以放大光产生反应。当一个或多个光利用装置(例如光纤、光电二极管、半导体和其他装置)存在时，可以聚焦、放大、并导向所述来自光产生反应的光。可以通过传感器(例如太阳能电池、太阳膜、光电倍增管和其他产生来自光子能的电压或电流的光子传感器)来检测来所述自光产生反应的光。

在另一个实施方案中，通过来自化学反应的光产生，装置可以检测样品中的一种或多种不同的分析物。由此反应物可以结合至每测试体积的一个或多个分子网，并且可以结合每测试体积的一个或多个种类的分析物检测分子。所述分析物检测分子可以被结合到一种或多种光产生染料上，并且可以被固定在每测试体积的一个或多个分子网上。当一种或多种亲核分子存在时，可以发生光产生反应。当催化剂存在时，可以放大光产生反应。当一个或多个光利用装置存在时，可以放大光产生反应。当一个或多个光利用装置(例如光纤、光电二极管、半导体和其他装置)存在时，可以聚焦、放大、并导向所述来自光产生反应的光。可以通过传感器(例如太阳能电池、太阳膜、光电倍增管和其他产生来自光子能的电压或电流的光子传感器)来检测来自光产生反应的所述光。

F.制造具有所希望的特异性的分子网

分子网特别好地适合于检测多种不同的分析物。应当理解的是，由具体的网或装置结合并检测的特定的分析物将随物品的预期用途而变化。作为举例，当希望检测感染性细菌病原体的存在时，可以使用单个网或装置来检测感染的多个标志，例如像病原体蛋白的存在、病原体核酸的存在、病原体细胞的存在、病原体碳水化合物的存在、对感染的宿主免疫应答的存在、以及类似标志。通过同时检测感染的多个独立的标志，分子网允许做出具有更大置信度的测定。

在设计分子网中必须解决至少四个主要的设计要素。它们是(按任意顺序)：

第一，必须选择特定系列的分析物，这样测定将提供有用的信息给医师或操作者。

第二，必须选择捕获剂来检测特定系列的分析物的存在或缺乏。

第三，必须选择用于每一分析物的检测系统。

第四，必须选择连接物，并且必须确定网的每一层的特定连接物和捕获剂组成。

分析物的选择

在诊断背景下，必须选择分析物来鉴定和/或区分由不同的传染因子引起的感染。优选地，针对这些(或每一个)传染因子选择了多个分析物。在一些实施方案中，检测了至少一种、两种、三种或所有四种以下病原体标记：(1)病原体蛋白，(2)病原体核酸，(3)病原体多糖，(4)病原体脂质。在一些实施方案中，检测了至少一种、两种、三种或所有四种以下宿主标记(1)补体激活；(2)抗病原物质抗体；(3)干扰素；(4)凝集素结合蛋白；(5)急性期蛋白；(6)8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dGUA)；(7)抗微生物肽(AMPs)；(8)LPS结合蛋白(LBP)。表4提供了可以被用来检测感染的分析物的实例，连同示例性的对应的捕获剂。将认识到的是，表4用于说明，而并不旨在是综合性的。

表4

在选择捕获剂和检测系统中，对特定分析物的特异性可以来自捕获剂、检测系统，或同时来自这二者。参见表5。

表5

每一层的连接物，以及特定连接物和捕获剂组成的选择

可以基于广泛的指导和经验检验来选择第四设计要素。典型地，选择捕获剂的组合以提供在病原体或其他分析物的检测中的冗余。例如，一个用于检测细菌感染的网可以检测整个细菌、细菌蛋白、细菌核酸和细菌脂多糖，所有这些均指示感染。这个冗余为测定提供了更高的置信度和更好的敏感性。通常，在多层网中，其中各层之间的孔隙率都不同，从该网的外部到内部，或者从该网的一端(例如顶部)到另一端(例如底部)，孔隙率倾向于减小，使得在样品流过该网时，首先流过较高孔隙率的层，并且此后是孔隙率逐渐降低的层。通常，用临床或其他样品中的分析物浓度峰值和检测系统的敏感性来表示捕获剂的浓度。

需要经验检验来设计具有适合的特性的分子网。经验检验可以涉及：

(a)通过结合多个单独的等分部分的系列的捕获剂与多个单独的等分部分的一个或多个系列的连接剂来产生具有不同构成的多个分子网，产生针对每一考虑的系列捕获剂的多个不同的候选分子网，其中任选地，各分子网之间的单独的捕获剂和/或连接物的浓度都不同；

(b)评定每个网结合分析物的能力，其中所述评定包括使这些网与含有分析物的样品接触，典型地接触5至60分钟，并且确定哪个网最有效地结合所述分析物，由此鉴定一个或多个导引网；

(c)使一个或多个所述导引网与一个或多个第二系列的捕获剂结合，这可以与第一系列相同，在形成多层网的条件下添加一种或多种连接剂，并且评定每一个多层网结合第一和第二分析物的能力，其中所述评定包括使多层网与含有分析物的样品接触，并且确定哪个多层网最有效地结合所述分析物。

(d)重复步骤(c)以添加多个网层；

(e)评定候选网的非特异性背景和敏感性，并且选择具有可接受的低背景和敏感性的那些网。

尽管以上进行了广泛讨论，但是应当理解的是，在设计诊断性或其他测定系统中涉及许多其他因素。

IV.分子网的用途

分子网在医学诊断中具有广泛应用，例如传染因子的存在和性质的重点护理确定，检测癌症、炎症和慢性疾病的征象，确定药物敏感性，兽医诊断，以及类似方面。在本应用中，使生物样品(例如血液、尿液、唾液、粪便、伤口渗出物、等)与一个或多个分子网接触，并且确定一种或多种分析物的存在或缺乏。

除了医学诊断应用之外，本发明的分子网可以用于其他类型的分析物检测，包括食物、水和温湿环境试验(例如检测化学的或生物污染物)、生物威胁评定、以及类似方面。分子网还可以用于血液的亲和过滤，以除去药物、自体反应的细胞、细胞产物、毒素、病原体、或免疫因子，以及用于药物筛选。

可以在它们应用于分子网之前处理样品。例如，可以通过机械、酶或化学破坏来破坏样品。可以使用机械、酶和化学破坏来处理组织、细胞、或其他分子复合物，以使感兴趣的分析物可被该网结合。对于“机械破坏”表示用于破坏组织、细胞或其他分子复合物来释放组分分子的机械方法，例如通过研磨、声处理、等。对于“酶活性或破坏”表示使用酶来破坏组织组织、细胞、或其他分子复合物以释放组分分子的方法。对于“暴露于化学物质或化学破坏”表示通过化学物质(例如氧化剂、还原剂、洗涤剂、盐类、热、酶、苯酚/氯仿、亲核体和其他试剂)来破坏组织、细胞、或其他分子复合物以释放组分分子的方法。可以通过过滤和离心以及类似方法来处理样品制剂。在一些实施方案中，样品制备是在含有一个或多个分子网的装置中进行的。

在一些实施方案中，用分子网(例如在分层分子网中的最顶部的网，或者在含有一系列分子网的装置中的第一个网)来破坏样品。例如，该网可以是一个洗涤网，并且可以含有洗涤剂；溶剂；酸；碱；表面活性剂；盐类；还原剂；氧化剂；和其他分子的一个组合；并且可以用于洗涤样品；由此所述洗涤网可以溶解；结合；降解；削弱以下各项的结构完整性：哺乳动物细胞、原生动物、细菌、真菌、植物、病毒及其产物；并且由此所述洗涤网可以从食物、流体、组织、或环境样品内的较大分子复合物释放可溶性蛋白、肽和其他有机分子。

为了诊断目的，基本的分子网是结合分析物的一种网(例如“分析物结合网”)。然而，也可以使用具有其他功能的“辅助网”，例如，用于样品处理。辅助网可以被配置为多层网中的一个或多个层。可替代地，可以在一圈的多个网中串联使用辅助网(其中的一些或全部可以是多层网)。例如并且没有限制，生物样品可以穿过一个溶解网以溶解细胞，穿过一个尺寸排除网以除去未溶解的细胞或碎片，并且然后穿过一个多层分析物结合网，在其中分析物被结合和检测。辅助网的实例是溶解网、洗涤网、尺寸排除网、和酶网。

“溶解网”是含有能够溶解哺乳动物和微生物细胞的分子(例如溶菌酶、洗涤剂、螯合剂、穿孔素、膜攻击复合物、盐类、和能够细胞溶解的其他分子)的分子网。

“洗涤网”是可以位于装置中的、含有缓冲剂，和/或盐类、pH、洗涤剂、螯合剂、金属、蛋白质、多核苷酸、碳水化合物和/或脂质的混合物的分子网。它还可以用来非特异性地结合或固定样品分子，并且可以用来除去或溶解样品中的细胞。

“尺寸排除网”是含有以一种方式布置的分子的分子网，以产生分子间的不规则孔径。部分通过化学交联剂的反应臂的长度和性质，以及相邻分子上的表面化学来产生孔径。相邻分子的物理形状和大小也影响孔径。

“酶网”是含有一个或多个类型的酶的分子网，这些酶可以具有一个或多个底物特异性。酶网还可以含有对于酶的必要的辅因子。酶网的目的是用于与样品中的特定底物相互作用，并且产生对应的产物，当在随后的网(例如阳性选择网)上固定时，可以检测该产物。

阴性选择网和阳性选择网是分析物结合网的类型。“阴性选择网”是可以位于装置中的、含有盐类、洗涤剂、螯合剂、金属、蛋白质、多核苷酸、碳水化合物和/或脂质、药物、抗生素、和其他分子的混合物的分子网。基于特定表面化学或亲和力或特性的缺乏，它还可以用来结合或固定样品分子，并且可以用来固定样品中的细胞亚群。“阳性分子网”是含有特异性地固定样品中的特定分析物的捕获分子的分子网。所述网可以位于一个装置内。基于特定表面化学或亲和力或特性的存在，它还可以用来结合或固定样品分子，并且可以用来特异性地固定样品中的细胞亚群。

可以使用任何数量的方式来使样品与一个或多个分子网接触，连同用于洗涤和检测步骤。在一个实施方案中，多个网被装配于微量滴定板的孔中，并且使用常规手工或机器人流体转移来进行该测定。在另一个实施方案中，使用了浸渍片形式式，其中这一个或多个网被附接到与样品和检测试剂接触的基底上。其他形式包括(没有限制)：片、盒、卡、立方体、盘、接头、和板。

在分析物已经结合在分子网中之后，有时包括洗涤步骤来改进特异性、敏感性和/或信号。在一个装置中，在样品制备或洗涤步骤中，可以使用缓冲系统。在表面的疏水位点一般会引起非特异性结合增加，因为蛋白质到表面的物理吸附是由疏水性相互作用介导的。此外，过量的带电基团通常还会增加非特异结合的可能性。例如，在中性pH，一些蛋白质拥有净正电荷，并且将倾向于与带负电的表面缔合。在一些实施方案中，含有高盐和洗涤剂浓度的缓冲系统可以减少在装置中的重要检测表面上的非特异性结合。可以应用缓冲剂来增强或猝灭一种或多种可检测信号。例如并且没有限制，缓冲剂可以含有过氧化氢；漂白剂；氧化剂；螯合剂；适体；有机分子；底物；和无机分子。

V.诊断(分析物结合)分子网的实例

A.细菌网

在一个实施方案中，测试可以含有多个分子网，其中一个分子网可以是细菌网，并且可以含有能够特异性结合以下项的捕获组分：在对细菌感染的应答中特异性诱导的宿主反应分子、细菌DNA、鞭毛、菌毛、伞毛、荚膜、S-层、肽聚糖、细菌特异性聚合酶、细菌特异性热休克蛋白、甘露糖和其他表面多糖类、细菌核糖体亚基、以及其他细菌特异性分子。

细菌网可以含有特异性针对革兰氏阳性菌和它们的产物(例如脂磷壁酸、细菌素)的捕获组分，革兰氏阳性菌特异性肽聚糖结合蛋白，和革兰氏阳性菌感染的其他指示。细菌网可以含有对革兰氏阴性菌和它们的产物(例如脂多糖、脂质A、外膜泵)特异的捕获组分、特异性针对革兰氏阴性菌的外膜结合蛋白、以及革兰氏阴性菌感染的其他指示。测试还可以含有一个病毒网，其中捕获组分可以特异性地结合：病毒核酸、衣壳蛋白、刺突蛋白、血凝素、神经氨酸酶、病毒聚合酶、逆转录酶、病毒产物、在对病毒感染的反应中特异性诱导的宿主分子、以及抗病毒细胞因子(例如干扰素-α和干扰素-β)。测试还可以含有一个真菌网，其中捕获组分可以特异性地结合：在对细菌感染的反应中特异性诱导的宿主反应分子、甲壳质、黄曲霉毒素、真菌糖蛋白、真菌多糖类、二酰化的脲、和其他真菌特异性分子。测试可以含有一个原生动物网，其中捕获组分可以特异性结合在对原声动物感染中特异性诱导的宿主反应分子、原生动物特异的碳水化合物结构、原生动物特异的糖蛋白、原生动物特异的DNA序列、和其他原生动物特异的分子。

在另一个实施方案中，测试可以含有在叠加的或分层的布置中的革兰氏阴性细菌网、革兰氏阳性细菌网。可以用不同的检测标记来标记分析物检测分子；并且由此结合到一个以上的分子网的分析物可以产生增强的信号、混合的信号、多重信号、和不同的信号。这样的阳性测试结果的一个实例可以是指示样品呈细菌阳性的蓝色信号的存在，与指示样品呈革兰氏阳性菌阳性的红色信号存在相结合，由此红色和蓝色信号的组合产生紫色信号。这样的阳性测试结果的另一个实例可以是指示样品呈细菌阳性的蓝色信号的存在，与指示样品呈革兰氏阴性菌阳性的黄色信号存在相结合，由此蓝色和黄色信号的组合产生绿色信号。

B.总肿瘤坏死因子网

在一个优选的实施方案中，测试可以含有能够测量样品中的总肿瘤坏死因子(TNF)的分子网。所述TNF网可以含有能够捕获并固定以下各项的捕获组分：可溶性TNF配体；可溶性TNF受体I和II；能够结合TNF配体的可溶性TNF受体片断(例如TNF-BP-I、TNF-BP-2、和其他TNF-BP)；抗TNF抗体；TNF:抗TNF抗体复合物；TNFR:抗TNFR抗体复合物；TNF:TNFR:抗TNFR抗体免疫复合物；TNF:TNF-BP-1:抗TNF抗体复合物；TNF:TNF-BP-2:抗TNF抗体复合物；TNF:TNF-BP-1:抗TNF-BP抗体复合物；TNF:TNF-BP-2:抗TNF-BP抗体复合物；以及在样品中的其他的结合TNF的复合物。所述TNF网可以含有一个或多个TNF网，由此所述TNF网可以由以下捕获组分组成，例如但并不局限于：抗TNF抗体；抗TNFR抗体；抗TNF-BP-1抗体；抗BP-2抗体；TNFR-I；TNFR-II；肝素；和其他TNF结合分子。所述TNF测试可以含有洗涤缓冲剂以除去非结合的样品分子。所述TNF测试可以含有能够用一种或多种指示物分子标记的分析物检测分子。其中在洗涤步骤以后，所述分析物检测分子到结合的分析物的结合可以被认为是阳性测试。

C.抗生素抗性测试

在另一个实施方案中，测试可以是抗生素抗性测试，并且可以含有上述能够捕获并固定处于存活状态的整个生物的微生物网；并且由此所述测试可以使用不同地标记的分析物检测分子来鉴定抗性；或抗性靶标；或赋予抗性的方法。

在一个实施方案中，测试可以是使用胞外基质网来捕获并固定处于存活状态的整个细菌的抗生素抗性指示物测试，并且由此所述测试可以使用不同地标记的检测分子；由此所述检测分子是标记的抗生素；由此用不同的标记物标记每一种类的抗生素；由此在标记的检测分子的异质群存在下孵育所述活细菌；由此施用一种洗液；由此一种或多种结合的检测分子可以指示抗生素敏感性。

D.细胞外基质网

在另一个优选的实施方案中，测试含有一个或多个细胞外基质网，其中所述细胞外基质网可以被用来捕获并固定细菌或任何其他微生物或任何哺乳动物细胞。所述捕获组分可以特异性结合一种或多种表面糖蛋白、多糖、甘露糖、蛋白质、脂质、糖脂、脂蛋白或其他表面分子。所述网可以用来结合活细胞，并且由此所述测试可以使用特定分析物检测分子；并且由此所述测试可以用来分析所述结合的细胞的特征、动力学、特性和反应。

E.感染监视指示物测试

在另一个实施方案中，测试可以是使用细菌、病毒、真菌和原生动物的分子网或其组合的感染监视指示物测试，用来鉴定感染的一种或多种宿主特异性指示以及感染的一种或多种微生物特异性指示。

F.变应原鉴定

在另一个优选的实施方案中，测试可以用来鉴定食物或环境样品中的变应原，其中所述测试含有一个或多个分子网来捕获并固定整个的或处理的变应原；由此测试可以在一个或多个测试区中中产生一个或多个信号；并且由此所述测试区含有一个或多个分子网并且在体积中可以是密集的；并且由此分子网-分析物检测分子复合物的密集性质产生增强的阳性信号；并且可以产生更快的每单位体积信号。

VI.含有分子网的装置

本发明提供了使用分子网来确定样品中的一种或多种分析物的存在或量的分析装置。该装置可以包括一系列的内部结构、室和通道；由此一个或多个所述结构可以具有一个表面，该表面支持和/或固定可以共价地或非共价地附接；或安装；到一个表面的一个或多个分子网，这些结构可以由有机聚合物、金属、玻璃或其他材料制成，并且由此固定的分子网可以能够结合样品中的一种以上的分析物。分子网可以被形成；安置；吸附；粘附；胶粘；交联；和/或安装到一个表面上。表面可以是(没有限制)多孔的；非多孔的；电晕蚀刻的；和/或成型的，并且可以具有一个以上的表面化学。表面可以是平面、珠粒、或其他。

该装置还可以包括处于一个或多个布置中的多个分子网；在装置的一个或多个测试区中，或者由此单独的分子网可以被分隔成分开的测试区，其中所有测试区可以暴露于所述测试样品或一种分离的、半纯化的、或分级的测试样品，使得一种或多种分析物能够被在所述装置中的一个或多个测试区中的一个或多个分子网中的多种捕获分子固定。

披露了一种装置，该装置含有一个或多个分子网、或分子网壁，含有散布的捕获分子和改性的金属纳米颗粒；其中结合分析物可以改变所述分子网或分子网壁的物理的、磁的、电的、化学的、振动的、压缩的、比色的、热的、和空间的特性，由此所述改变的特性可以是一个信号，并且可以被传感器检测，以产生在所述装置的二元或分析测试中的信息。

该装置可以含有入口端；通道；分区；缓冲剂储存室；样品处理室；样品检测室；废物容纳室；流出端；和其他隔室。隔室可以含有测定所需的试剂，如缓冲剂、洗液、核酸引物、酶、化学物质、底物、催化剂和样品处理和/或分析物放大所需的其他分子；核酸探针、抗体、多肽、酶和其他标记的分析物检测分子；底物、化学催化剂、辅因子、和在信号产生反应中的其他分子；放大器、透镜、滤光器、和在信号放大中涉及的其他因子；以及光检测器、半导体、和在信号检测中的其他因子。

通道的内腔聚合物表面可以用一种或一种以上以下各项进行涂覆：整联蛋白；聚精氨酸肽；在中性、酸性和碱性溶液中具有总体正电荷的氨基酸；聚阳离子脂质；重组受体；金属；金属氧化物；单链DNA结合蛋白；乙二胺四乙酸；乙二醇四乙酸；胶凝素；抗体；蛋白A；蛋白G；重组配体；模式识别受体(PRR)；来自多个PRR的域；多个含蛋白病原相关分子模式(PAMPS)的域；冻干的或凝胶洗涤剂(例如吐温20、吐温80、CHAPS、辛基硫代葡萄糖苷、tritonX-100、和/或NP40)；十二烷基硫酸钠；鲑精DNA；脂多糖结合蛋白(LBP)；和优先共价地或非共价地结合粗或半纯化样品中的组分的任何其他分子。可以通过压力变化；机械剪切；振动；流体波；声波；气体微泡；pH梯度；洗涤剂；盐度变化；粘度变化；温度变化；和流速变化洗涤该装置的内部结合表面；并且可以除去在一个或多个室中的分子的非特异性结合。

该装置可以被适配用于检测样品中的多种不同分析物的方法，通过将样品拉入可以含有横向布置的分子网和/或分子网片的装置的测试体积，这样在它流过该装置时，这些分子网和/或分子网片赋予样品微流体和/或纳米流体特性；和/或通过滴加分子网和/或分子网的片到所含样品中；其中所述分子网和它的片可以含有能够赋予分子网(和它的片)内的和周围的微流体和/或纳米流体的微通道和纳通道以及表面化学；数字微流体；和/或使用连续流和/或非连续流微流体；和/或纳米流体使样品移动穿过含有横向布置的分子网的测试体积，这些分子网赋予微流体和/或纳米流体。

以此方式，以这样一种方式(在装置之内的分子网的一个或多个区带；和/或分子网片的一个或多个区带；和/或一个或多个位置中，可以产生一种信号或多种不同信号的一个或一种组合)检测样品中多种不同的分析物。

可以在环境过滤单元中使用分子网，由此分子网可以用来从样品中除去特定分析物；由此分析网可以被引入到液体环境中；或者由此分子网可以被置于管子和/或管和/或软管中，并且液体样品可以移动穿过这些管子和/或管和/或软管来固定来自所述样品的分析物。

分子网可以用作分子壁，由此分析物可以同时结合一个或多个分子壁；并且由此可以检测；分析；和/或定量分析物的结合；通过装置的检测室的限定体积之内的分子网特性的变化。通过例如以下各项的绝对值和/或变化，可以检测和/或定量样品分析物固定：物理抗性；形状；光散射特性；化学特性；物理压缩力；电势；振动频率；磁性；热吸收；电导；以及在固定时，分析物赋予分子网的其他物理的和电化学特性。

分子网可以用作分子海绵，用于吸附和固定分析物以及从样品中除去它们的目的；由此分子网可以沉积在样品中，并且由此捕获组分可以结合所述分析物和/或与其相互作用，并且由此从样品中除去分子网以及当(以及如果)从样品中除去分子网时，可以从样品中除去所述分析物；和/或由此将未结合的样品移出分子网外可以分离；过滤；和/或分级；该样品。

用于生物样品过滤目的的分子网可以被填充到柱、盒、管子、管、软管、和其他装置中；由此分子网含有可以结合分析物的捕获组分，这些分析物是细胞，以及这些分析物是通过基于亲和力的相互作用的具体反应性的细胞产物；并且由此非分析物和流体可以穿过所述分子网并且可以回到生物源。

这些装置可以具有分子网，这些分子网含有能够结合生长因子受体和在肿瘤细胞表面上的其他肿瘤细胞标记的捕获组分；并且由此所述分子网可以将所述肿瘤细胞固定在柱；盒；管；和其他装置内；并且由此非肿瘤细胞可以穿过所述装置。

这些装置可以具有分子网，这些分子网含有能够结合并固定T细胞受体、B细胞受体、主要组织相容性复合体、和细胞表面上的其他抗原识别细胞表面标记的捕获组分；并且由此所述分子网可以结合并固定特异性细胞产物；并且由此所述分子网可以将免疫细胞和/或免疫细胞产物固定在柱；盒；管；和其他装置内；并且由此未固定的细胞和细胞产物以及流体可以穿过所述装置；并且所述未固定的剂可以回到生物源。

这些装置可以具有分子网，这些分子网含有可以结合重金属、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、细胞因子、胰岛素、激素、药物、以及在哺乳动物中可以异常升高的其他分子的捕获组分。

这些装置可以具有分子网，这些分子网含有捕获组分，这些捕获组分可以是有机的或无机的分子和/或活微生物细胞，这些分子和活微生物细胞可以结合和/或吸附和/或储存化学物质，例如石油、重金属、石化产物、汽油、除草剂、农药、和其他环境污染物。

分子网可以包含在一个真空容器(vacutainer)装置内，其中真空容器的负压将样品拉入含有一个或多个分子网的测试体积中；并且其中可以由所述分子网固定样品分析物；并且其中在真空容器装置内可以检测固定的分析物；或者其中可以从真空容器装置一起除去具有结合的分析物的分子网，并且这些分子网可以被置于用于分析物检测的第二装置中。

在一些实施方案中，该装置由化学敏感的分子和/或聚合物的组合制成，这些分子和聚合物可以分层施用在模具上，以形成具有通道和室的有序系统，能够迅速地同时检测生物或环境样品中的许多不同种类的分析物。该装置的一个方面是可以使用微制造方法形成的通道和室的有序系统，由此最小化进样量，并且允许以便宜的方式制造该装置。

在另一个实施方案中，多层网被固定在装置中，并且样品依次流过该网的这些层。可替代地，装置可以包括多个分子网并且被配置成使得样品流过若干个网。在任一情况下，样品可以通过毛细作用或通过活跃的泵送流动。其他传送方法(例如电泳)也是可能的，但是这些方法要求专门的装备并且在若干方面是较不方便的。

优选地，该装置是自主手持式装置。典型地，该装置含有一个用于引入生物样品的端口或隔室，连同含有检测试剂的隔室，以及对于测定必需的其他试剂。其他试剂可以包括缓冲剂和样品处理剂(例如细胞溶解液)。在实施方案中，其中检测系统产生不能被视觉分析的信号(例如除了比色系统之外)，该装置可以包括用于检测信号的元件，或者可以被偶联到用于检测信号的仪器上。在一些实施方案中，可以在与一个或多个网接触之前将样品处理，例如溶解细胞，除去细胞或浓缩样品。

因此，披露了一种用于确定测试样品中的分析物的存在或量的分析装置。该装置可以包括一系列结构，其中一个或多个所述结构具有一个表面，该表面提供共价地或非共价地附接或适配到聚合物表面上的分子网。固定的分子网能够结合样品中一种以上的分析物。

该装置还包括分开到多个室中的多个分子网，其中所有的网都暴露于所述测试样品或细分级的群的测试样品，使得一种或多种分析物能够通过与每一分子网的捕获分子相互作用而被固定。

该装置可以包括一系列结构，其中每一结构具有一个表面，该表面提供了共价地或非共价地附接到所述结构上的固定的分子网，并且能够特异性结合分析物；多个分子网被分开在分开的室内的该装置表面上，其中所述测试样品含有一种或多种分析物，流过通道的网络并且流过一个或多个过滤器、筛或分子网，由此该测试样品被逐步分级并且流进一个或一个以上的室中，每一个室含有由不同的捕获组分组成的一个或多个分子网；一个缓冲系统，来减少或抑制分级的样品剂和分子网之间的非特异相互作用，一种标记的试剂，包括偶联到可检测标记上的特异性结合成分，其中当被固定在分子网上的结合分析物固定时，所述可检测标记能够产生一个信号，以指示测试样品中所述分析物的存在或量。

该装置可以含有一个或多个检测室，所述室含有通过摩擦、悬架或附接固定到该室的表面的一个或多个分子网，其中通过将所述样品注入该装置，所述分子网能够结合来自分级的样品的至少一个种类的分析物群；注入洗涤缓冲剂到该装置中以除去样品与该分子网的非特异性结合；注入检测溶液，由此检测剂特异性地结合固定的分析物；并且注入洗涤缓冲剂到该装置中以除去未结合的检测剂。

这些装置可以产生针对单独的分析物和分析物的混合物这二者的不同的诊断信号。这些装置可以从所不希望的分析物中分离出所希望的分析物。这些装置可以在该装置内的分开的区域中有区别地分离分析物，使得在一个区域中选择分析物A和B，并且在该装置的另一区域中分析物A和B不被选择，从而选择分析物C、D、E和F。在一些实施方案中，该装置由化学敏感的分子和/或聚合物的组合制成，这些分子和聚合物可以分层施用在模具上，以形成具有通道和室的有序系统，能够迅速地同时检测生物或环境样品中的许多不同种类的分析物。该装置的一个方面是可以使用微制造方法形成的通道和室的有序系统，由此最小化进样量，并且允许以便宜的方式制造该装置。

在装置的一个实例中，主通道可以与样品端口相连，并且可以通向分支点或节点，那里可以存在多个后续通道。每一后续通道可以含有过滤器和/或筛，并且通向一个室，其中所述室可以含有被室特征支持并且固定到室特征的过滤器和/或筛和/或分子网形式的选择特征。该室可以被连接到另外的通道上，并且可以通向第二室，该第二室含有被室特征支持并且固定到室特征的一个不同的分子网。一个通道可以从该第二室导出，通向废物流出端口。

在装置的另一个实例中，可以含有连接到连续通道的一个样品输入端口，该连续通道具有一系列不同的过滤器，这些过滤器具有逐渐减小的孔径，用来选择亚细胞分子或病毒，并且可以通向多个通道(这些通道通向一个或多个室)的一个节点。每个室可以含有一个或多个分子网，并且可以被另一通道连接到废物流出端口。

在另一个实例中，装置可以含有连接到交替的组的通道和室。每一通道都可以由附接到通道的内腔表面的增加梯度的选择分子的组成，并且可以通过相互作用的表面化学结合特定样品组分。所述通道可以连接到一个节点上，该节点可以连接到多个室，这些室可以含有一个分子网，该分子网由捕获分子组成，这些捕获分子可以结合样品中的分子，该样品具有与感兴趣的分析物类似的表面化学，但是可以优先结合到该网，而感兴趣的分析物未抑制地进入附接通道中，该附接通道可以通向最终室或可以通向样品接入端口。

在另一个实施方案中，装置可以含有样品输入端口，并且可以含有与一个通道邻近的芯吸剂。该通道可以含有一系列不同的分子网，由此来自输入端口的样品缓慢地扩散进入并且遍及该通道。所述分子网含有捕获组分，这些捕获组分具有不同的表面化学和允许样品中所不希望的组分的最大结合的构象。然后可以借助抽吸穿过样品接入端口来除去剩余样品组分。

在另一个实施方案中，装置可以含有选择特征的混合物，这些选择特征包括：在内腔表面、过滤器、筛、和分子网上的梯度涂层，并且这些涂层可以位于通道中并且可以位于室中。所述选择特征可以被附接到内腔表面上，或者可以被悬吊或可以被安装倚靠一个内腔的唇。

在另一个实施方案中，具有可选择特征的、用于样品制备的装置可以基于大小、亲和力、表面化学、形状、疏水性、亲水性、和活性来区别样品组分。

在另一个实施方案中，装置可以含有具有升高的物理特征的表面，并且可以由聚合物组成，并且可以含有促进结合特定分子(例如分子网中的组分)的表面化学。

在一个装置的优选的实施方案中，聚合物装置可以在该装置的两个端部都含有端口。该装置可以具有方向性，其中该装置可以具有样品输入端口和样品输出端口。该装置可以含有大连续通道，并且所述通道可以含有附接到通道特征上的一系列不同的过滤器和/或筛和/或分子网。

在另一个实例中，输入和输出端口可以是鲁尔锁紧式连接器。输入和输出端口可以是阴鲁尔锁紧式连接器。使用阴鲁尔锁紧式将允许流体经由一个注射器而被引入。典型地，注射器包括在该注射器的配发端的阳鲁尔锁紧式连接器。对于流体样品，鲁尔锁紧连接器可以允许通过在注射器柱塞上施力，直接将样品从注射器转移进入该装置的所述输入端口中。

在另一个实例中，装置是连接两个不同的注射器的适配器。一个注射器可以含有粗样品，并且该样品可以被推入适配器中，并且穿过适配器装置，以将所不希望的样品从分析物分离。另一注射器可以被连接到适配器装置的相反端，并且接收半纯化的或纯化的分析物。

在另一实例中，装置可以具有组装的分层的段，以产生具有通道和室的系统，其中样品从最外层穿过，穿过多个内层，并且到达到相反的最外层。当它穿过该装置的顺序的层时，所述样品部分或整体被纯化，以产生可以针对分析存在的半纯化的或纯化的分析物。

在另一个实例中，装置可以包括用作室的窗口表面的、具有透明的和半透明的聚合物的一个外表面。

示例性系统：

本发明的实施方案包括使用分子网分析样品存在特定类型的分析物的装置。在一些实施方案中，这样的装置包括在操作上偶联到分子网上的一个或多个传感器。这些传感器可以提供一个信号，该信号指示或不指示被捕捉在该网内的、并且因而最初存在于样品内的某种分析物的存在。在一些实施方案中，信号的缺乏可以指示或不指示样品内的某种分析物的存在。

在一些实施方案中，可以将能量施用到传感器上，以引起某些分析物产生信号。可以通过传感器将能量施用到分子网，在那里部分分子网发射反应信号(例如荧光、振动)。在一些实施方案中，单独存在分析物将使传感器产生信号。例如，分子网可以在结构上被附接到一个或多个压电传感器上，在那里分析物的捕获使分子网的结构变化(例如硬化、收缩)，并且由此将机械应变施用到该压电传感器上。在该应变下，压电传感器发射一种电信号，指示分析物的存在。

在此披露的系统和装置通常包括一个结构，该结构可以是更大结构的壳体或子壳体，以容纳一个或多个分子网。这些结构通常包括被配置为支持一个或多个分子网的一个或多个支持表面。在一些实施方案中，这样的支持表面形成在被配置为容纳流体样品的室的至少一部分。因此，在一些实施方案中，应当理解的是，“室”是包括一个或多个支持表面的结构元件。在一些实施方案中，这些结构是模块化的和/或便携式的。在一些实施方案中，该结构是可以接入计算装置的、较小的(即手持式)盒。在一些实施方案中，这些结构包括可移动部件，它可以被物理地致动用于处理样品。

图8A显示了根据本发明的一个实施方案的示例性分析物检测系统800的简化示意图。系统800包括一个计算装置802。计算装置802一般包括至少一个用于执行机器指令的处理器。计算装置802可以被连接到另外的子系统上，例如打印机、键盘、固定盘、监控器，它偶联到显示适配器上。外围装置和输入/输入(IO)装置，它们偶联到I/O控制器上，可以通过本领域已知的任何数量的工具(例如串行端口)连接到计算装置802上。例如，串行端口和不同的外部接口(例如USB、无线的、等)可以被用来将计算装置连接到广域网络(例如互联网)、鼠标输入装置或扫描仪。经由系统总线的互连允许处理器与每一子系统交流，并且控制来自系统存储器或固定盘的指令的执行，连同子系统之间的信息的交换。系统存储器和/或固定盘可以体现计算机可读介质。

系统800还包括在操作上偶联到计算装置802上的至少一个传感器804。传感器804通常如在此所述进行配置，并且可以包括一个整合的或非整合的放大器。分子网806被显示了在操作上偶联到传感器804上。应理解，在一些实施方案中，分子网806可以包括多个分子网。应当进一步理解的是，分子网806可以被类似地配置为在此披露的任何分子网，以及它们的组合。

在使用中，将潜在地含有某种分析物的样品物理地施用至分子网806上，该分子网被预配置为捕获某种分析物。传感器804检测某种分析物的存在并且将适当信号发送到计算装置802。计算装置802加工该信号以指示，对于一次使用，是否在分子网内存在分析物，并且因而最初存在于样品内。然而在一些实施方案中，应当理解的是，预定信号的缺乏没有可以指示某种分析物的存在。例如，传感器804可以将某个电磁波长(例如激光)施用到样品上，其中波长被分析物吸收指示它的存在。因此，某个波长的缺乏将显示了一个阳性指示。

在一些实施方案中，系统800可以包括用于容纳计算装置802和/或传感器804和/或分子网806的一个或多个结构。对于这些结构，不同的材料和配置是可能的。在一些实施方案中，可以由聚合物和/或金属构成这些结构。例如，结构可以被配置为金属板或成型的塑料壳体，该壳体具有用于在结构上支持系统800的物理方面的多个外壁和内壁。这些结构的部分可以被配置为管、室、和管道，以将样品传递穿过系统800。在另外的方面，例如泵、电源、和电气硬件还可以构成系统800。在一些实施方案中，传感器804和分子网806可以被配置在分开地接入计算装置802的模块化结构内。在图8B中显示了这样的子系统的实例，如装置808。

图8B显示了根据本发明的一个实施方案的示例性装置808的透视和详细视图。该装置808包括一个结构810，它被显示了为便携式狭长壳体。结构810包括被配置用于支持分子网814的至少一个表面812。可以根据分子网支持表面和在此描述的基底来配置表面812。表面812限定了至少一部分样品检测室816。传感器818可以被偶联到表面812上，或者被偶联到限定了样品检测室816的另一表面上。样品检测室816将通常包括一个输入端口，或用于物理地将样品施用到分子网814上的其他开口。该结构可以包括一个视窗820以证实样品的施用，和/或用于查看被捕捉在分子网814内的某种分析物的存在的视觉指示。传感器还可以包括可操作地偶联到传感器818上的连接器822。可以根据已知的连接器标准(例如USB)来配置连接器822，用于连接到计算装置802上。

图8C显示了根据本发明的一个实施方案的一个示例性多室系统824。系统824被配置为使用分子网的一个等温核酸亲和力测试系统。系统824包括一个改性室826，在那里可以经由化学变化来处理样品(例如变性、改性、等)。改性室826通常是检测过程开始的地方，并且因此包括一个输入端口。缓冲剂容纳室828与改性室826处于流体连通。缓冲剂容纳室828被配置为释放改性和/或加工助剂和/或缓冲溶液进入改性室826中。放大室830在下游与改性室826流体连通。放大室830可以包括一个或多个分子网832，这些分子网通过横跨一个或多个连接表面来细分放大室830。

在放大室830内的分子网832可以包括放大因子(例如酶)，它放大穿过放大室830的一个或多个某一类型的分析物的可检测存在。这些酶可以被配置为与这些分析物结合。显示了与放大室830和/或检测室836流体连通的洗涤室834。洗涤室834被配置为储存可释放到放大室830和/或检测室836的洗涤液。检测室836被配置为包括一个或多个分子网838，这些分子网依次被配置为捕获一个或多个特定类型的改性的和/或处理的和/或放大的分析物。分子网838被配置为细分检测室834。生成的洗涤液，包括未结合的样品部分，可以被传递到与检测室836处于流体连通的废物室840，用于输出端口的释放。

可理解地，系统824的其他配置是有可能的。在一些实施方案中，放大室830和/或洗涤室834可以被配置为检测室，以类似于检测室836的方式。在另外的实施方案中，一个或多个传感器可以被定位在用于检测一个或多个某一类型的分析物的室内。仍然在另外的实施方案中，一个或多个阀可以定位在室之间，以选择性地引起这些室之间的流体连通。例如，在测试过程期间的某些时间释放缓冲溶液和/或洗涤液。仍然在另外的实施方案中，正压和/或负压经由一个流体偶联泵使样品液进入一个入口端，穿过不同的室，并且穿过一个输出端口而被排出。

图8D显示了根据本发明的一个实施方案的另一个示例性多室系统842。系统842包括用于容纳不同的室和其他部件的一个结构844。系统842还包括支持过滤器848的过滤室846。过滤室846通常与入口端处于流体连通，用于接收样品。过滤器848可以被配置为洗涤网、过滤元件、或筛。洗涤过滤室850与过滤室846处于流体连通。洗涤过滤室850包括一个或多个过滤器852，这些过滤器被配置为阻止某些部分样品通过。检测室854与洗涤过滤室850处于流体连通；这些室可以被一个或多个单向液流阀853分开，以阻止回流。检测室854包括至少一个分子网856，它被配置为捕获至少一种某一类型的分析物。

系统842进一步包括多个容纳室858。每一容纳室858可以包括一个或多个类型的流体，例如洗液、试剂、缓冲剂、等。在使用者致动多个开关860(在此显示了为按钮)中的至少一个时，每一容纳室858可以被配置为释放对应的流体。开关860可以被配置为活化机电阀或机械阀。在一些实施方案中，这些开关不是使用者以直接的和同时的方式致动的，而是被配置为经由一个事件(例如单向液流阀853、不同的检测器、和/或其他机构的触发)的发生而致动。

系统842进一步包括一个计算装置862，它可以被配置为类似于示例性计算装置802。计算装置862可以包括传感器、放大电路、和信号处理电路，该信号处理电路被配置为检测被捕捉在分子网856内的某种分析物的存在。显示器864可以被偶联到计算装置862上，用于显示测试结果和配置。在一些实施方案中，显示器864是一个触摸屏，它可以接受使用者输入，以控制开关860和系统842的其他方面。外部接口866(例如USB端口)可以被连接到计算装置862上，以输出来自计算装置862的数据。

图8E显示了根据本发明的一个实施方案的一个示例性多室枪装置868。枪装置868包括多个流体连接室，这些室被类似地相对于系统824和改性室826的室而配置，并且通常包括至少一个分子网。然而，枪装置868包括可移动地连接到前部分872上的后部分870。如所显示的，前部分872被完全撤回到后部分870中。后部分870离开前部分872的相对致动导致在这些室内的负相对压力，并且因此将把样品或缓冲剂吸入枪装置868的一个端口874，用于样品的测试或缓冲。相反地，后部分870朝向前部分872的相对致动导致这些室内的正相对压力，并且因此将在分子网内的某种分析物的潜在捕获之后，将样品或缓冲剂从端口874排出。

检测组分

装置还含有信号检测器(即传感器)，例如光电倍增管；光电池；多晶硅箔；薄膜光伏；光伏晶片；光伏模块；捕光可印材料；铜-铟-镓-硒化物基太阳能电气系统；单晶硅；多晶硅；串结薄膜硅；光电二极管；半导体二极管；和能够将光能转化成电流或电压两者之一的其他光电探测器。

在一些实施方案中，装置可以包括安装在对应的室内的不同的传感器阵列。装置(或在装置中的测试体积/网)可以包括能够连接到一个或多个信号放大器上的一个或多个光纤；并且可以含有一个或多个信号检测器；并且可以将一个或多个检测信号传输到一个或多个电路；并且可以将电信息传输到计算机用于分析。

示例性检测安排

图9A显示了根据本发明的一个实施方案，示例性传感器布置900的详细示意图。传感器布置900被用于进行使用分子网的分析物检测方法。传感器布置900被配置在室902内，该室具有多个传感器904，这些传感器限定了室902的至少一些部分。每一传感器904可以包括放大电路/装置，它放大分析物的存在和/或由传感器904产生的信号。可以按不同方式配置每一传感器904以检测分析物的不同方面，或者多个不同类型的分析物。在一些实施方案中，传感器904可以被配置为用来检测预定的运动、温度、电势、光(UV/可见)、振动、刚性、酸度、碱度、pH变化、能量导率(电流、热，等)、机械张力、机械扭力、弹性、磁场、和它们的组合。

显示了由不同的捕获分子构成的分子网906和交联剂偶联到多个传感器902(a)中的至少一个上。进一步显示了被分子网906捕获的多种分析物908，以及经由一个放大过程结合到分析物上的多个检测分子910。可理解地，很多分析物缺乏易于被通常可得的传感器可检测的特性。为了补偿这一点，检测分子910包括容易地电路可检测的特性，并且被用来结合分析物，并且因此允许它们的检测。例如，检测分子910可以与含铁物质结合，并且传感器904(a)可以包括压电应变检测器。剩余的传感器904(b)(c)、和/或传感器904(a)可以包括永久磁铁或电磁铁。这些磁铁可以将检测分子910拉离或拉向分子网906，所用力使压电应变检测器发射电信号，并且因此指示分析物908的存在。在另一个实例中，检测分子910可以与导电物质或电阻物质结合，这改变了传感器904之间的导电和/或电容关系。在另一个实例中，检测分子910可以与荧光物质结合，当暴露于不同波长的光时，这允许传感器904检测某一波长的光的存在。在另一个实例中，每个传感器904包括一个分子网。可理解地，很多更多的传感器布置是可能的。

图9B显示了根据本发明的一个实施方案的示例性传感器布置912的详细示意图。传感器布置912包括类似于图9A的分子网906而配置的一个分子网914。然而，在该布置中，检测分子被配置为结合具有某种可见颜色或若干颜色的某些物质。鉴于分子网914，可以布置一个或多个显微透镜916，以提供一个针对肉眼的颜色的视野。因此，在一些实施方案中，分析物是可检测的，而不需要将能量施用至传感器布置912。在一些实施方案中，以一种特定的方式安排分子网914，以显示一个预定符号，例如字母或数字。在一些实施方案中，用于夹持分子网的支持表面918是透明的，以允许光通过。在一些实施方案中，支持表面918可以包括一个简单光源电路，例如可开关地偶联到电池上的一个LED，以提供具有特定波长的光或白光。

图9C显示了根据本发明的一个实施方案的多个交联的检测分子的一个示例性分子排列920。检测分子922被配置为结合一种或多种某些分析物。检测分子922可以被彼此化学交联和/或PEG化，以向放大因子924发信号，这被描绘为黑暗填充的圈。存在放大因子924，以此增强信号，或以此提供信号的存在。放大因子924可以包括酶、金属纳米颗粒、染料、荧光团、化学物质、辅因子、底物、和它们的组合。

图9D显示了根据本发明的一个实施方案的一个示例性分子网配置926。显示了分子网配置926的一个宏观视图具有不规则表面928。分子网配置926可以包括不规则的密度、袋和通道、多个表面化学、和其他物理特性。这显示于显微镜视图中，其中不同类型的捕获分子和放大元件经由交联连接。通道和袋提供了用于捕获分析物的较大的表面积，并且因此有效利用了紧密的分子网。可以通过在交联过程之前和之中给分子网通气来形成这样的通道和袋。在一些实施方案中，可以使用非结合微颗粒在交联过程之前和/或之中提供这些通道和袋。可以在交联过程之后通过不同的方法(例如冲洗、蒸发、或溶解)除去这些非结合微颗粒，并且因此为通道和袋提供空的空间。

示例性装置、子系统、和结构方面

正如以上所指出的，参考图8A，在此披露的传感器和分子网的不同组合可以被配置在分别地接入外部计算装置(例如计算装置802)的一个模块化结构之内。相反地，一些实施方案不需要计算装置。在一个实例中，在图10A中显示了这样的一个实施方案。

图10A显示了根据本发明的一个实施方案的用于检测不同分析物的存在的示例性测试装置1000。装置1000被配置为具有多个孔的一个狭长结构。在一些实施方案中，装置1000被配置为一个一次性塑料棒。每一个孔可以包括一个特定的分子网，该分子网分别被配置为指示特定分析物的存在。例如，孔1002可以包括一个分子网，该分子网被配置为通过在应用样品时显示以前非可见的符号而指示特定病毒的存在。以类似方式，孔1004可以被配置为指示特定细菌的存在。以类似方式，孔1006可以被配置为阳性对照孔，以证实如果没有病毒和细菌符号出现时的孔1002和孔1004的操作功能性。

图10B和10C显示了根据本发明的一个实施方案的示例性测试室1008的简化的结构描绘。室1008包括支持一个或多个传感器1012和一个或多个分子网1014的内表面1010。可以经由一个附接的管或通道1016将样品引入到室1008中。通道1016可以包括内腔表面、不同的过滤器、和筛(共同地用1017表示)，用于除去部分样品。如在图10C中所显示的，内表面1010的一个部分1018包括支持分子网的物理特征1020。这些物理特征被配置为具有结合与非结合表面的多面凸起。顶面1022可以支持分子网，同时侧面1024可以被配置为减少分析物的非特异性结合。还可以在通道1016内使用这些物理特征，例如，这些物理特征可以位于通道壁上，以检测特定分析物，并且滤出其他分析物。

图10D显示了根据本发明的一个实施方案的示例性分子网布置1026的一个简化示意图。在这个布置1026中，经由通过在测试室的室壁1028上的分子网的结合而固定分析物，可以完成分析物的检测。结合方式被配置为通过分子网来改变这些壁的物理的、化学的、磁的、电的、机械的、光散射的、光折射的、和/或光反射的特性。在测试之前和之后，这些室壁都通常被校准到这些特性的已知量。可以使用传感器来查明这些特性，用于确定分析物是否结合到分子网上。

图11A显示了根据本发明的一个实施方案的用于样品处理和/或样品分级的一个示例性适配器1100的透视图。适配器1100被配置为一个狭长管1102，该管具有用于流体连接到样品引入和除去装置(例如注射器和管)的一个附属特征1104。在这个实例中，显示了在内腔1106的每一端的鲁尔式连接器。不同的过滤器和筛将内腔1106分级为多个亚区。该内腔的这些过滤器、筛、和内腔表面可以包括捕获某些分析物的分子网。在使用中，可以将未处理的样品经由第一注射器施用到一端中。当样品几乎完全注入该内腔时，可以将第二注射器附接到另一端，并且然后再用第一注射器注入。以此方式，将纯化的或处理的样品注入第二注射器，该样品不含有被过滤器、筛、和内腔壁捕获的分析物。

图11B显示了根据本发明的一个实施方案的示例性过滤单元1108的侧视图。以类似于适配器1100的方式，过滤单元1108包括被配置为过滤器、筛、和/或内腔表面的一个或多个内部分子网。过滤单元1108被配置为管状盒，如通过信号的存在指示的，在用分析物饱和之后，该过滤单元用相同或类似的盒是容易地可替代的。过滤单元1108被配置在封闭的回路内，并且将流体摄入和排出到同一样品源。在一些实施方案中，过滤单元1108被配置为结合可以从生物样品中除去的细胞、细胞残余(cellular reminas)、细胞碎屑、细胞产物、金属、螯合剂、药物、生物制剂、氮、细胞因子、核酸、蛋白质、病毒、真菌、原生动物、以及其他分子和/或试剂。

图12显示了根据本发明的一个实施方案的示例性含尖头装置1200的透视图。装置1200包括被配置为塑料盒的结构1202。微针或大针1204从结构1202延伸，并且与内部聚合物室1206或管处于流体连通。室1206可以包括不同的疏水或亲水涂层化学。可变形的并且有弹性的球状物1208从结构1202的顶部延伸，并且与室1206处于流体连通。样品端口1210与针1204相反，并且也与室1206处于流体连通。样品端口1210可以包括一个适配器来连接注射器或诊断装置。室1206包括一个或多个分子网，并且还可以包括一个或多个传感器。在使用中，针1204可以被施用进入靶组织中以进入脉管系统。然后泵压球状物1208将血液吸入室1206中并且吸入到分子网上。然后可以将注射器或诊断装置附接到样品端口1210，以确定分析物在分子网内的存在。

图13A显示了根据本发明的一个实施方案的洗涤网1300的透视图。洗涤网1300由分子网构成，它被配置为具有1302，以过滤含有一种或多种所不希望的分析物的样品。洗涤网1300的大小可以被确定为手动并且灵活地跨实验室或现场环境中的容器或管，或者可替代地预容纳在滤架组件中。在使用中，可以施用洗涤网来覆盖容器(例如碗或带刻度的量筒)的开口。然后可以按使得过滤的样品1306流到容器中的方式将未过滤的样品1304倒在洗涤网1300上。

图13B显示了根据本发明的一个实施方案的分子网的示例性多重网络1308的示意性描绘。多个分子网1310被彼此分层、叠加或悬挂，并且可以被进一步附接到更大的结构上，例如检测标记。每一个分子网包括被被配置以产生一种或多种信号(S¹、S²、S³)的不同的检测分子。信号的实例包括(而没有限制)比色的、荧光的、发光的、和磷光的信号。在捕获一种或多种某些分析物时，检测分子可以被配置为产生单信号或多重信号(例如多种颜色)。例如S¹＝蓝色，S²＝红色，并且S³＝黄色。进一步，S¹+S²＝紫色并且S¹+S³＝绿色。经由对应的检测分子，将多种信号(例如颜色)和/或信号的组合绑定到特定类型的分析物上，可以由此指示不同分析物的存在。

图13C显示了根据本发明的一个实施方案的示例性测试体积1312的的示意性描绘。测试体积1312被配置为具有进口和出口的室。测试体积1312容纳了与多个传感器以交替方式叠加的多个分子网1314。传感器1316可以被配置为检测光或其他波能，并且可以包括在聚合物上的硅太阳能电池、染料敏化的太阳能电池、聚合物太阳能电池、有机太阳能电池、和/或单或多面纳米天线。测试体积1312进一步包括偶联到传感器1316上的放大器1318。放大器可以被配置为由硅或聚合物材料制成的发光的太阳能聚光器，并且可以被连接到硅或聚合物多结PV太阳能电池。放大器还可以被配置为聚光的光伏或纳米天线的网络。在使用中，制成样品来填充测试体积，这可以使一个或多个种类的分析物被分子网捕获。分析物的存在可以通过测试体积1312影响光和能量的传播，这通过传感器1316是可检测的。然后来自传感器1316的亮度和/或热和/或热光伏的测量的特性可以与指示或不指示分析物存在的预期特性进行比较，并且因此确定它们在样品中的存在。

图14A显示了根据本发明的一个实施方案的被配置为海绵1400的示例性分子网的简化描绘。海绵1400由开孔(大或小)吸附分子网结构构成，类似于人造或有机海绵。在一些实施方案中，由与分子网交织的人造海绵材料(例如开孔聚合物泡沫)的混合构成。如图14B所示，海绵1400可以置于容纳样品的容器中。经由与海绵1400的捕获分子“C”的物理相互作用，海绵1400随着时间的过去可以吸附分析物“A”。其发生是由于海绵在样品流体中有力吸引的吸附特性。在饱和之后，可以从样品中移开海绵1400，并且对分析物的存在进行分析。

图15A显示了根据本发明的一个实施方案的示例性多室装置1500的俯视图。装置1500包括具有内部管和室的结构壳体1502。该装置包括一个输入端口1504，第一洗涤端口1506，检测试剂端口1508，和第二洗涤端口1510，所有这些都与主通道处于流体连通。主通道进一步与含有一个或多个分子网的多个测试室1512处于流体连通。主通道最终在废物端口终止。在使用中，在输入端口1504，样品可以经由正压或负压被引入主通道中。由于在输入端口1504、第一洗涤端口1506、和检测试剂端口1508不同洗液和试剂的流入，样品可以被化学地改变。因此，与最初引入装置1500时相比，在样品到达测试室1512时，它将被化学地改变。

图15B显示了根据本发明的一个实施方案的另一个示例性多室装置1515的俯视图。装置1515被配置为类似于图15A的装置1500。然而，装置1515包括内室1516、1518，它们与样品分布室1520处于流体连通。内室1516和1518可以容纳不同的试剂、酶、洗液、化学物质、和类似物。可以使内室1516和1518分别经由开关1522和拉片1524与样品分布室1520处于流体连通。在使用中，样品最初被引入到分布室1520中。然后使用者可以按所希望的顺序手动活化开关1522和拉片1524，以将物质释放到样品分布室1520中，并且在引入测试室1512之前或之中使样品化学地变化。

图16显示了根据本发明的一个实施方案的另一个示例性多室装置1600的分解图。装置1600由多个层1602(a-f)构成，每一个都具有一个或多个开口。当组装多个层1602(a-f)时，这些开口形成在装置1600内的水平和/或垂直移动的多个通道和室。这些通道和室可以包括一个或多个分子网。在使用中，样品可以在该装置内和遍及该装置而水平或垂直迁移，以填充每一个室。因此，然后可以针对不同类型的分析物的存在而对这些室进行分析。传感器可以被嵌入到每一层内来输出信号。可替代地，可以移开每一层并且由阅读器进行阅读。

图17显示了根据本发明的一个实施方案的另一示例性多室装置1700的俯视图。装置1700由类似于装置1500的方式构成。然而，装置1700包括四个不同的路径(R₁、R₂、R₃、R₄)，用于样品分析物的差分检测。每一路径R_1-4包括被多个通道(a-p)相互连接的多个室(1-12)。每一室可以包括不同的分子网，这些分子网具有不同的化学和机械样品制备特征、选择特征、过滤特征、分级特征、传感器、接入点、和/或输入/输出点。每一通道可以包括不同的内腔涂层、选择特征和/或过滤特征。在使用中，样品可以迁移遍及该装置来填充每一测试室。选择的化学和分级特征结合传感器，然后可以确定在每一测试室中一个或多个类型的分析物的存在。

VI.实例

实例1：用来检测病毒感染的分子网

本预示实例描述了用于检测病毒感染的三层分子网的制作。该网结合1)干扰素α；2)干扰素β；3)病毒MAVS和4)病毒蝰蛇毒素。

材料

捕获剂

1)针对干扰素-α的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

2)针对干扰素-β的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

3)针对IPS-1(MAVS)的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

4)针对蝰蛇毒素(cig5)的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

连接物

5)EGS(母液＝25mM，在DMSO中)。

方法

1.按1:1:1:1比率混合捕获剂1-4(抗体)。

2.下层-添加含有100ug的抗体混合物的10uL等分部分到基底(硝酸纤维素)表面。让在4℃吸附过夜。除去包括任何未固定的抗体的剩余液体。

第一层

3.将10uL的抗体混合物移液到下层上。立即添加1uL EGS。在室温孵育1hr。

4.通过添加10uL的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)猝灭，让其静置10分钟。

5.用移液管除去剩余液体。通过移液50uL PBS(pH 7.4)到网上并且除去来洗涤网3x次。

另外的层

6.重复步骤4-7以产生第二层。

7.重复步骤4-7以产生第三层。

冷冻干燥或添加50uL PBS+0.001％矿叠氮化钠并且在4℃储存直至使用。

表6多层分子网含量

实例2：用来检测细菌感染的分子网

本预示实例描述了用于检测细菌感染的三层分子网的制作。该网结合1)革兰氏阴性菌脂多糖，2)革兰氏阴性菌脂质A，3)革兰氏阳性菌磷壁酸，和4)CpG细菌DNA。

材料

捕获剂

1)针对脂多糖的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

2)针对脂质A的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

3)针对肽聚糖的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

4)针对磷壁酸的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

5)DNA结合肽1(VLFGKLA)(SEQ ID NO：12)(母液＝1mg/mL)；

6)DNA结合肽2(VMFGKLA)(SEQ ID NO：13)(母液＝1mg/mL)；

7)DNA结合肽6(VFFGRLA)(SEQ ID NO：14)(母液＝1mg/mL)。

连接物

8)EGS(母液＝25mM，在DMSO中)；

9)EMCS(母液＝25mM，在DMSO中)；

10)BS(PEG)₉(母液＝250mM在DMSO中)。

方法

1.按1:1:1:1比率将捕获剂1-4(抗体)混合到管A中(1μg/mL)。

2.按1:1:1:1比率将捕获剂5-7(DNA结合肽)混合到管B中(1mg/mL)。

3.在新管C中混合等份的管A+管B。

4.下层添加10uL的来自管C的等分部分到基底(硝酸纤维素)表面。让在4℃吸附过夜。除去包括任何未固定的抗体的剩余液体。

第一层

1.将10μL的管C混合物移液到下层上。立即添加EGS、BS(PEG)₉和EMCS各自1μL。在室温孵育1hr。

2.通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

3.通过添加10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

4.用移液管除去剩余液体，用移液管用50uL PBS洗涤3次。

另外的层

1.重复步骤1-4以产生第二层。

2.重复步骤5-8以产生第三层。

3.冷冻干燥或添加50μL PBS+0.001％叠氮化钠并且在4℃储存直至使用。

表7多层分子网含量

层	一种或多种捕获剂	一种或多种连接物
			第一	抗体和DNA结合肽	EGS，BS(PEG)9，EMCS
第二	同上“	同上“
			第三	同上“	同上“

实例3：多层网优于用相同捕获剂含量含量制成的单层网

制备单层、2-层、3-层和4-层网，它们结合1)细菌肽聚糖，2)脂磷壁酸，3)细菌脂多糖，4)细菌脂质A和5)细菌CpG DNA。如图2所示，与使用相同总量的捕获剂制成的单层相比，在结合分析物方面，多层是更有效的。

材料

用于细菌网的捕获剂

1)针对肽聚糖的抗体；

2)针对脂质A的抗体；

3)针对脂多糖的抗体；

4)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

6)DNA结合肽6(VFFGRLA)(母液＝1mg/mL)。

连接物

7)EMCS(母液＝25mM)；

8)EDC(母液＝25mM)；

9)S(PEG)₉(母液＝25mM)。

无脂奶(100％)；

磷酸盐缓冲盐水，pH7.4；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

聚苯乙烯基底。

二、三和四层网

1)按1:1:1比率将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1μg/mL)。

2)按1:1比率将DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL)。

3)在管C中，按1:1比率混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

第一层

4)添加[移液管]10μL的管C混合物到表面上以产生第1层。

5)立即添加[移液管]1μL EGS、EMCS和BS(PEG)₉到点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

6)让其在室温下静置1hr。

7)通过添加[移液管]10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

8)用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

重复步骤11-15制备第二、第三和第四层，以上，每次移液这些组分到已经形成的一个或多个层上。将生成的网储存在4℃下，在PBS和0.001％叠氮化钠中，并且储存在4摄氏度直至使用。

具有1x、2x、或3x浓度的捕获剂的单层网

1)按1:1:1比率，将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1μg/mL(1x)、10μg/mL(2x)、100μg/mL(3x))。

2)按1:1比率将多种DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL(1x)、10mg/mL(2x)、100mg/mL(3x))。

3)在管1xC、2xC、3xC中，按1:1比率，混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

第一层

4)添加[移液管]10μL的每一管C(1xC-3xC)混合物到表面上以产生第1层。

6)让其在室温下静置1hr。

8)用移液管除去剩余液体，用移液管用50uL PBS洗涤3次。

9)添加50μL PBS+0.001％叠氮化钠并且储存在4摄氏度直至使用(还可以冷冻干燥并且储存在室温或4度下直至使用)。

测定步骤

1)以一式三份，构建单、双、三和四层网，并且与ELISA型式(未交联的吸附的捕获分子)进行比较，并且在等摩尔浓度的EGS、EMCS和BS(PEG)₉存在下，构建具有1x、2x和3x浓度的捕获组分的单个网。

2)将50pg/mL的用罗丹明标记的细菌酰化的脂蛋白掺入EDTA处理的全血样品，并且按10μL/孔添加。

3)在室温下孵育样品和检测分子15分钟(或60分钟，对于ELISA)。

4)用300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.05％吐温20、和10％白蛋白(洗涤缓冲液)洗涤这些孔。

5)在549nm激发这些孔，并且用酶标仪测量在566nm处的吸光度。

结果

多层网和内在结合能力的原理的实例。在聚苯乙烯板的孔中，按1x浓度每层的浓度，用捕获组分一式三份构建单、双、三和四层网。还构建具有1x、2x和3x浓度的捕获组分的单层网。在该实验中，使用EGS、EMCS和BS(PEG)₉交联剂来构建所有这些网。网的性能与标准ELISA形式(标准ELISA形式＝未交联的吸附的捕获分子)进行比较。将50pg/mL的细菌酰化的脂蛋白掺入EDTA处理的全血样品，并且按10μL/孔添加到每一孔中。样品和检测分子与每个分子网一起孵育15分钟(或60分钟，对于ELISA)，并且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.05％吐温20、和10％白蛋白(洗涤缓冲液)洗涤。用酶标仪测量在566nm处的吸光度。值代表一式三份网的平均吸光度。误差条代表平均值(SEM)的标准误差。通过不成对学生t检验获得P值。参见图2。

实例4：分层网在混合血样中的特定分析物的结合能力方面的值的实例

为了比较分层网和具有相同体积的非分层网的特性，构建了两个细菌捕获网变体(每个变体12个重复)，并且评估了结合两种具有非常不同的化学特性的细菌分析物的能力。

用捕获分子、和连接物BS(PEG)₉、EMCS和EGS构建3层网。使用相同连接物和相同数量的捕获分子、BS(PEG)₉、EMCS和EGS，构建具有与3层网相等体积的单层网。

将临床浓度的荧光团标记的细菌分析物掺入全血，并且与每个网变体孵育15分钟，并且然后洗掉。通过在525和566nm处的荧光发射测量固定的分析物。

制备结合以下各项的网

1)细菌肽聚糖；

2)脂磷壁酸；

3)细菌脂多糖；

4)细菌脂质A；

5)细菌CpG DNA。

材料

用于细菌网的捕获剂

4)针对肽聚糖的抗体；

5)针对脂质A的抗体；

6)针对脂多糖的抗体；

4)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

6)DNA结合肽6(VFFG LA)(母液＝1mg/mL)。

连接物

7)EMCS(母液＝10μM)；

8)EDC(母液＝2.5μM)；

9)BS(PEG)₉(母液＝5μM)。

无脂奶(100％)；

磷酸盐缓冲盐水，pH7.4；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

聚苯乙烯表面。

用于构建分层网的方法

9)按1:1:1比率，将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1μg/mL)。

10)按1:1比率，将多种DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL)。

11)在管C中，按1:1比率混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

12)添加[移液管]10μL的管C混合物倒表面上以产生第1层。

13)立即添加[移液管]1μL EGS、EMCS和BS(PEG)₉到点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动基底5至10次进行混合。

14)让其在室温下静置1hr。

第一、第二和第三层

1)添加[移液管]10μL的管C混合物到下层上以产生第1层。

2)立即添加[移液管]1μL EGS、EMCS和BS(PEG)₉到点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

3)让其在室温下静置1hr。

重复步骤1-3以添加层2和3，其中将捕获剂和连接物混合物移液到存在的一个或多个下层上。

用于构建具有等价于分层网的体积的单分层网的方法

1.按1:1:1比率，将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1μg/mL)。

2.按1:1比率，将多种DNA结合肽混合液到管B中(1mg/mL)。

3.在管C中，按1:1比率混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

4.添加[移液管]40μL的管C混合物倒表面上以产生第1层。

5.立即添加[移液管]4μL EGS、EMCS和BS(PEG)₉到来自管C混合物的样点上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

6.让其在室温下静置1hr。

7.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

在室温下，用100％无脂奶阻断网30分钟。

测定步骤

1)在12的重复中，构建具有相等体积的单或三层网。

2)将50pg/mL的用罗丹明标记的细菌酰化的脂蛋白掺入EDTA处理的全血并且按10μL/孔添加，或者将5pg/mL的用FITC标记的细菌胞壁酰二肽掺入EDTA处理的全血并且按10μL/孔添加。

3)在室温下，孵育样品15分钟。

5)在490nm和549nm激发孔，并且用酶标仪分别测量在525nm和566nm处的吸光度。

结果

结果总结在图3中。值代表在12个重复的每个网变体中检测的平均荧光。误差条表示平均值(SEM)的标准误差。使用不成对学生t检验来比较显著性。确定在结合胞壁酰二肽方面，具有等体积的3层网和1层网之间的显著性(P-值＝0.005)。在酰化的脂蛋白结合方面，在3层网和具有等体积的1层网之间不存在显著性差异。

实例5：使用全血的细菌分析物到网的结合

本实例和图4显示了ELISA和分子网的多分析物结合能力的比较。按临床相关浓度，将荧光标记的细菌分析物(A，脂多糖；B，酰化脂肽；C，胞壁酰二肽；D和E，细菌CpG寡核苷酸；以及F，人纤维蛋白原作为对照)掺入EDTA处理的全血，具有用针对以下细菌抗原的捕获组分构建的ELISA或分子网的重复：革兰氏阴性菌的外膜组分(脂多糖和脂质A)和革兰氏阳性菌的细胞壁组分(肽聚糖)以及细菌CpG DNA。由于荧光团中的限制，将LPS和CpG DNA 2掺入相同的血样中，酰化脂肽和CpG DNA 1掺入相同的血样中，并且胞壁酰二肽和纤维蛋白原掺入相同的血样中。在洗涤之前，样品与ELISA一起孵育60分钟，或者与分子网一起孵育15分钟。使用酶标仪评估荧光。值代表由在ELISA形式(灰色线)或分子网(黑色线)中的固定的分析物发射的平均荧光。

制备了结合以下各项的网：

6)细菌肽聚糖；

7)脂磷壁酸；

8)细菌脂多糖；

9)细菌脂质A；

10)细菌CpG DNA。

材料

用于细菌网的捕获剂

7)针对肽聚糖的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

8)针对脂质A的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

9)针对脂多糖的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

4)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

6)DNA结合肽6(VFFGRLA)(母液＝1mg/mL)。

连接物

7)MCS(母液2μM)；

8)GS(母液1.5μM)；

9)BS(PEG)₉(母液1μM)；

10)甲醛(母液0.115％v/v)。

无脂奶(100％)；

磷酸盐缓冲盐水，pH7.4；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

聚苯乙烯。

用于构建分层网的方法

15)按1:1:1比率，将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1mg/mL)。

16)按1:1比率，将多种DNA结合肽混合到管B中(mg/mL)。

17)在管C中，按1:1比率，混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

第一层

18)添加[移液管]10μL的管C混合物到表面上以产生第1层。

19)立即添加[移液管]4μL的以下各项中的每一个：甲醛、EGS、EMCS和BS(PEG)₉到来自管C混合物的样点上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

20)让其在室温下静置1hr。

第二层

21)添加[移液管]10μL的管C混合物到表面上以产生第2层。

22)立即添加[移液管]4μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS到有点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

23)让其在室温下静置1hr。

第三层

24)添加[移液管]10μL的管C混合物到表面上以产生第3层。

25)立即添加[移液管]4μL的以下各项中的每一个：EGS、EMCS和BS(PEG)₉到点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

26)让其在室温下静置1hr。

第四层

27)添加[移液管]10μL的管C混合物到表面上以产生第4层。

28)立即添加[移液管]4μL EGS、EMCS和BS(PEG)₉到有点样的管C混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

29)让其在室温下静置1hr。

30)用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

31)在室温下，用100μL的100％无脂奶阻断网30分钟。

用于ELISA包被的方法

8)按1:1:1比率，将针对脂质A和脂多糖以及肽聚糖的抗体混合到管A中(1mg/mL)。

9)按1:1比率，将多种DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL)。

10)在管C中，按1:1比率，混合抗细菌抗体和DNA结合肽。

11)涂覆50μL的管C每孔，并且让其在4℃吸附过夜。

12)用3×100μL PBS洗涤这些孔。

13)在室温下，用100μL的100％无脂奶阻断30分钟。

测定步骤

1)将EDTA处理的来自八个收集供体的全血分为19个等分部分用于连续稀释。

2)使用具有不同表面化学的5个荧光团标记的细菌分析物和1个荧光团标记的人分析物(作为对照)。

3)建立每个稀释集合的两类分析物(LPS+CpG DNA 2；酰化脂蛋白+CpG DNA 1；以及胞壁酰二肽+纤维蛋白原)。

4)用以下分析物进行1:2稀释的连续稀释：

a.脂多糖-范围：0.03-2ng/mL；

b.酰化脂肽-范围：0.03-1ng/mL；

c.胞壁酰二肽-范围：0.03-1ng/mL；

d.CpG ODN 1-范围：0.015-0.5pMol；

e.CpG ODN 2-范围：0.015-0.5pMol；

f.人纤维蛋白原-范围：0.06-2μg/mL。

5)将20μL的PBS添加到每个孔中。

6)在室温下，添加5μL的每一稀释到每个孔中，并且孵育15分钟(对于网)和60分钟(ELISA)。

7)用300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.05％吐温20、和10％白蛋白(洗涤缓冲液)洗涤这些孔。

8)在490、495、549、592nm处激发这些孔，并且用酶标仪分别测量在525、519、566和618nm处的吸光度。

实例6：用来检测金黄色葡萄球菌感染的分子网

本预示实例描述了用于检测金黄色葡萄球菌感染的三层分子网的制作。该网1)金黄色葡萄球菌；2)金黄色葡萄球菌肽聚糖，3)金黄色葡萄球菌SsaA，4)金黄色葡萄球菌TSST-1，5)金黄色葡萄球菌α-毒素，6)荚膜多糖类，以及7)细菌CpG DNA。

材料

捕获剂

1)针对金黄色葡萄球菌的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

2)针对金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

3)针对金黄色葡萄球菌SsaA的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

4)针对TSST-1的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

5)针对α-毒素的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

6)补体C3(母液＝1μg/mL)；

7)凝集素结合蛋白(母液＝1μg/mL)；

8)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

9)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

10)DNA结合肽6(VFFGRLA)(母液＝1mg/mL)。

连接物

11)EGS(母液＝25mM，在DMSO中)；

12)EMCS(母液＝25mM，在DMSO中)；

13)BS(PEG)₉(母液＝250mM，在DMSO中)；

14)甲醛(母液＝37％v/v)。

方法

1.按1:1:1:1比率，将捕获剂1-7(抗体和蛋白受体)混合到管A中(1μg/mL)。

2.按1:1:1:1比率，将捕获剂8-10(DNA结合肽)混合到管B中(1mg/mL)。

3.添加来自管A和管B的等份到新管C中。

第一层

4.[移液]10μL的管C混合物移液到基底(聚苯乙烯)上。立即添加EGS、EMCS和BS(PEG)₉各自1μL。在室温孵育1hr。

5.通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

6.通过添加10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

7.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第二层

8.重复步骤4-7；然后添加10μL的在PBS中的0.1％w/v的甲醛溶液，让其在室温下静置10分钟。

第三层

9.重复步骤4-8以产生。

冷冻干燥或添加50μL PBS+0.001％叠氮化钠并且在4℃储存直至使用。

表8多层分子网含量

实例7：用于检测被耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的分子网

本预示实例描述了用于检测被耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的三层分子网的制作。该网结合青霉素结合蛋白2a(PBP2a)和细菌CpG DNA。

材料

捕获剂

1)针对PBP2a的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

2)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

3)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

4)DNA结合肽7(RRRRRRRRRRRR)(母液＝1mg/mL)。

连接物

5)磺基DST(母液＝0.119mM)；

6)DTSSP(母液＝0.125mM)；

7)EDC(母液＝0.03mM)；

8)THPP(母液＝2.5mM)；

8)甲醛(母液＝0.37％v/v)。

检测剂

9)染料标记的金黄色葡萄球菌探针GCCAGCAGCGCGGTAATACG(Genbank登录号M87484)(SEQ ID NO：13)；

10)染料标记的金黄色葡萄球菌探针GGACTACCAGGGTATCTAATCC(Genbank登录号M87484)(SEQ ID NO：14)；

11)染料标记的金黄色葡萄球菌探针GGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATAT AGG(SEQ IDNO：15)；

12)染料标记的金黄色葡萄球菌探针AATAGAGAAAAAAAAAAAGATGGC AAAG(SEQ IDNO：16)；

13)染料标记的金黄色葡萄球菌探针AATAGAGAAAAGAAAAAAGATGGCAAAG(SEQ IDNO：17)；

14)染料标记的金黄色葡萄球菌探针AGATGTGCACAGTTATTACACATAT(SEQ ID NO：18)；

10)染料标记的金黄色葡萄球菌探针GCTATTATTTACTTGAAATGAAAGACTG-CGGAGGCTAACT(SEQ ID NO：19)；

11)染料标记的金黄色葡萄球菌探针ACGACAAVVATGCAVVAVVTG(Genbank登录号X68417)(SEQ ID NO：20)；

11)染料标记的mecA探针GCAATACAATCGCACTACATTAATAG(Genbank登录号X52593)(SEQ ID NO：21)；

12)染料标记的mecA探针CATTTTGAGTTCTGCAGTACCG(Genbank登录号X52593)(SEQID NO：22)；

13)染料标记的mecA探针TCATAGCGTCATTATTCC(SEQ ID NO：23)；

14)染料标记的mecA探针ATCACTTGGTATATCTTCACC(SEQ ID NO：24)；

15)染料标记的mecA探针TATCCACCCTCAAACAGGTGAATT(SEQ ID NO：25)；

16)染料标记的mecA-mecRI探针CCAAACCCGACAACTAC(SEQ ID NO：26)；

17)染料标记的mecA-mecRI探针CGTGTCAGATACATTTCG(SEQ ID NO：27)；

18)染料标记的mecl探针CCGGAATTCGCATATGGATTTCAC(SEQ ID NO：28)；

19)染料标记的mecl探针G ATGGTTC GT AGGTT ATGTTG(SEQ ID NO：29)；

20)染料标记的mecl探针CGGATCCGAAATGGAATTAATATAATG(SEQ ID NO：30)；

21)染料标记的mecl探针C GG AATTC G ACTTG ATTGTTTC CT(SEQ ID NO：31)。

牛血清白蛋白(BSA)(母液＝1mg/mL)。

方法

1.在管A中，稀释PBP2a抗体(1μg/mL)。

2.按1:1比率，将多种DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL)。

3.在管C中，按1:1(体积:体积)比率混合针对PBP2a和DNA结合肽的抗体。

下层

4.添加[移液管]5μL的BSA到基底上。

5.立即添加[移液管]1μL EDC到点样的BSA上，添加1μL的甲醛到点样的BSA上。

6.通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

7.让其在室温下静置1hr[该步骤将使高度交联的基底作为一个结构角色]。

8.通过添加[移液管]10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

9.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第一层

10.添加[移液管]10μL的管A混合物到表面上以产生第1层。

11.立即添加[移液管]1μL DTSSP到点样的管A混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[以构建一个子集的捕获分子之间的更长的间隔臂]。

12.等待5分钟，然后添加1μL磺基DST到样点，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[以构建一个子集的捕获分子之间的更短的间隔臂，并且产生一个完整的第二层-第一层来捕获片段的PBP2a分析物]。

13.让其在室温下静置1hr。

14.通过添加[移液管]10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

15.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第二层

16.添加5μL的管B到分层的捕获分子的顶部。

17.迅速添加1μL的DTSSP到点样的管B混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[以构建核酸捕获层1]。

18.让其在室温下静置1hr。

19.通过添加[移液管]10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

20.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第三层

21.添加10μL的管C到分层网上。

22.立即添加[移液管]1μL DTSSP到点样的混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[该步骤使得能够构建一个子集的捕获分子之间的更长的间隔臂]。

23.等待5分钟，然后添加1μL磺基DST到样点，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[该步骤使之能构建一个子集的捕获分子之间的更短的间隔臂，并且产生一个完整的第三层-该层可以捕获片段的或更长的或完整的PBP2a分析物以及片段的或更长的或完整的核酸]。

24.通过添加[移液管]10μL的50mM Tris缓冲液进行猝灭，让其静置10分钟。

25.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

26.添加50μL PBS+0.001％叠氮化钠并且储存在4摄氏度直至使用(还可以冷冻干燥并且储存在室温或4度下直至使用)。

表9多层分子网含量

层	捕获剂	连接物
			第一	抗体	DTSSP，DST
第二	DNA结合肽	DTSSP
			第三	抗体和DNA结合肽	DTSSP，DST

实例8：革兰氏阴性菌脓毒症测定

背景

本实例描述了用于从血样诊断患者中的败血症的分子网。在他们的血液中，脓毒性患者可以具有5-1000pg/mL LPS和0-200CFU/mL的细菌。制备一个网，它结合1)脂多糖(LPS)，2)脂质A，3)细菌CpG DNA，4)酰化脂蛋白以及6)大肠杆菌。

材料

捕获剂

1)针对脂多糖的多克隆抗体(母液＝1μg/mL)；

2)针对脂质A的抗体(母液＝1μg/mL)；

3)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

4)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽6(VFFGRLA)(母液＝1mg/mL)。

连接物

6)EMCS(母液＝25mM)；

7)EDC(母液＝25mM)；

8)甲醛(母液＝0.37％v/v)。

检测系统

1)染料结合的针对脂多糖的抗体；

2)染料结合的针对脂质A的抗体；

3)染料结合的CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT(假单胞菌)(SEQ ID NO号：3)；

4)染料结合的GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT(埃希氏菌属)(SEQ ID NO号：33)；

5)染料结合的ACGACAGCCATGCAGCACCT(GenBank登录号AF233451)(SEQ ID NO号：34)。

牛血清白蛋白(BSA)(母液＝1mg/mL)；

磷酸盐缓冲盐水，pH7.4；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

聚苯乙烯表面。

方法

1.按1:1比率，将抗脂质A和脂多糖抗体混合到管A中(1μg/mL)¹。

2.按1:1比率，将多种DNA结合肽混合到管B中(1mg/mL)。

3.在管C中，按1:1比率，混合抗PBP2a抗体和DNA结合肽。

下层

4.添加[移液管]5μL的BSA到表面上。

6.通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

9.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第一层

10.添加[移液管]10μL的管A混合物到表面上以产生第1层。

12.等待5分钟，然后添加1μL磺基DST到样点，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次来混合[以构建一个子集的捕获分子之间的更短的间隔臂，并且产生一个完整的第二层-一层，以捕获片段的PBP2a分析物]。

13.让其在室温下静置1hr。

15.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第二层

16.添加5μL的管B到分层的捕获分子的顶部。

18.让其在室温下静置1hr。

20.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

第三层

21.添加10μL的管C到分层网上。

22.立即添加[移液管]1μL DTSSP到点样的混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[该步骤使之能够构建一个子集的捕获分子之间的更长的间隔臂]。

23.等待5分钟，然后添加1μL磺基DST到样点，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合[该步骤使之能够构建一个子集的捕获分子之间的更短的间隔臂，并且产生一个完整的第三层-该层可以捕获片段的或更长的或完整的PBP2a分析物以及片段的或更长的或完整的核酸]。

25.用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

表10多层分子网含量

实例9筛选分子网用于增强的细菌或病毒感染的分析物的检测

以一式三份，在聚苯乙烯孔中筛选30个网候选物。在每种情况看下，捕获剂是针对革兰氏阴性菌外膜(脂多糖和脂质A)和细菌DNA结合肽的抗体，其中这些变量是(i)一种或多种化学交联剂的组合和(ii)网层的数量。作为参考(此后称为“ELISA”)，将没有交联剂的捕获剂混合物吸附到基底上，并且结合并检测分析物。

制备结合以下各项的网

1)人干扰素-α；

2)人干扰素-β。

制备结合以下各项的网

1)细菌肽聚糖；

2)细菌脂多糖。

材料

用于病毒感染网的捕获剂

1)抗人干扰素-α抗体(母液＝1mg/rnL)；

2)抗人干扰素-β抗体(母液＝1mg/rnL)。

用于细菌感染网的捕获剂

1)抗脂多糖抗体(母液＝1mg/mL)；

2)抗肽聚糖抗体(母液＝1mg/mL)。

连接物

1)甲醛(母液＝16％w/v)；

2)EGS(母液＝25mM，在DMSO中)；

3)EMCS(母液＝25mM，在DMSO中)。

样品

1)EDTA处理的来自女性供体1的病毒感染的全血；

2)EDTA处理的来自女性供体2的病毒感染的全血；

3)EDTA处理的来自健康男性供体1的全血；

4)EDTA处理的来自健康男性供体2的全血；

5)来自在划线平板上分离的菌落的多个CFU(源＝人样品)。

用于病毒感染网的生物素酰化的检测剂

1)抗人干扰素-α抗体；

2)抗人干扰素-β抗体。

用于细菌感染网的生物素酰化的检测剂

1)抗脂多糖抗体；

2)抗肽聚糖抗体。

磷酸盐缓冲盐水(PBS)；

吐温20；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

卵白蛋白；

脱脂乳。

方法

检测分子的制备

1.为了生物素复原，将生物素平衡到室温，并且然后再悬浮于0.246mL的DMSO中，以给出终浓度为83mM的生物素。

2.在一个单管中组合50μL的每一抗体类型(一个针对病毒并且一个针对细菌)，并且在添加8μL的生物素之前调至室温，以达到6.8mM生物素/管的终浓度。

3.在室温下，在黑暗中孵育每一反应90分钟，直至反应完成。

4.在4℃在PBS中透析集合的检测分子过夜。

5.在-20℃在PBS中长期储存。

用于ELISA包被的步骤

1.相对于用于病毒网的捕获剂，按1:1的比率收集检测分子。

2.相对于用于细菌网的捕获剂，按1:1的比率收集检测分子。

3.通过添加10μL的病毒或细菌捕获组分(大约10ug捕获组分/孔)到聚苯乙烯板的孔中，在4℃O/N(过夜)来包被ELISA。

4.第二天，从4℃移出聚苯乙烯板，允许它们达到室温，用ELISA形式洗涤这些孔，以除去未吸附的病毒和细菌捕获分子。

用于网构建的步骤

5.向有待构建的细菌或病毒网的孔中，添加10μL的病毒或细菌捕获组分+1μL的每一种交联剂到对应的孔中。

6.简要地，通过摇动板进行混合。

7.让其静置1小时。

8.除去未结合的捕获分子，用PBS洗涤。

9.为了另外的层，重复步骤3至6。

10.在室温下，在100％无脂奶中阻断网20分钟。

测定步骤

1.根据以上方法，以一式三份，构建单、双、三和四层网。

2.EDTA处理全血样(对于病毒网：血液取自病毒感染的个体，在PBS中以1:1000稀释；对于细菌网：在PBS中以1:1500稀释菌落，并且然后在全血中以1:5稀释)，并且按10μL/孔添加到每个网。

3.向样品，按5μL/孔添加生物素酰化的检测分子。

4.与每个网一起孵育样品和检测分子15分钟(或60分钟，对于ELISA)。

5.用0.3mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)、0.05％吐温20、和10％卵白蛋白(洗涤缓冲液)洗涤这些孔。

6.对于检测步骤，按在脱脂乳中1:1000稀释，使用结合到胶体金(20nm)颗粒的山羊抗生物素抗体，并且在室温孵育30分钟(10μL/孔)。

7.用每孔0.3mL的洗涤缓冲液洗涤这些孔。

8.用酶标仪测量每个孔中的吸光度。

层的数量和构成是由甲醛(F)、和/或EMCS、和/或EGS构成的1、2、3、和4层，单独地或组合地构成(表11)。

表11在筛选实验中的分子网含量

实例10：在人血液中的革兰氏阴性菌和来自革兰氏阴性菌的分析物的检测

按在临床脓毒症患者血液中发现的浓度，掺入EDTA处理的全血(掺入以下各项的混合物：酰化脂蛋白-30pg/mL；LPS-3pg/mL；大肠杆菌DNA-0.06pMol；大肠杆菌-40CFU/mL和白色念珠菌(酵母对照)-40个细胞/mL)。将50μL的掺入的样品与5μL革兰氏阴性比色菌检测系统一起在三重分子网中孵育，并且孵育15分钟。对于ELISA孔，在添加5μL的检测系统之前(与和分子网一起使用时相同)，将50μL的相同血样孵育60分钟，并且在室温孵育30分钟。用300μL的洗涤缓冲液洗涤这些孔，并且在酶标仪上读出在510nm处的吸光度而将这些板定量。

制备分子网来固定与革兰氏阴性菌感染有关的以下分析物：

脂多糖；

脂质A；

酰化脂蛋白；

CpG细菌DNA；

革兰氏阴性菌CFU。

网构成和制作

捕获剂-

1)针对脂多糖的抗体(母液＝1μg/mL)；

2)针对脂质A的抗体(母液＝1μg/mL)；

3)针对肽聚糖的抗体(母液＝1μg/mL)；

3)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

4)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽6(VFFGRLA)(母液＝1mg/mL)。

连接物是-

1)BS(PEG)₉(母液＝7.9mM，在DMSO中)；

2)EGS(母液＝2.5mM，在DMSO中)；

3)EMCS(母液＝1.4mM，在DMSO中)；

4)甲醛(母液＝3.7％v/v，在双蒸H₂O中)。

将被革兰氏阴性菌检测系统检测的分子

1)革兰氏阴性菌CFU；

2)革兰氏阴性菌外膜；

3)脂多糖；

4)脂质A；

5)酰化脂肽；

6)革兰氏阴性菌CpG 16s rDNA。

革兰氏阴性菌检测系统中的分子

1)针对脂质A的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

2)针对脂多糖的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

3)革兰氏阴性菌探针5'-生物素-ACGACAGCCATGCAGCACCT(母液＝500pmol)。

染料

1)‘超级黑’染料浓缩物；

2)‘皇家蓝’染料浓缩物。

磷酸盐缓冲盐水(PBS)；

吐温20；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

抗生物素蛋白(来自蛋清)；

脱脂乳；

聚苯乙烯表面。

方法

检测系统的比色标记

1)产生以下各项的混合物并且称为‘蓝-黑1’-1份蓝，2份黑。

2)对于生物素酰化的DNA探针：100pmol的每个探针与50μL的100％蛋清(抗生物素蛋白源)在磷酸盐缓冲盐水中孵育，至总体积100μL；在4℃进行结合反应过夜。

3)添加抗生物素蛋白结合的DNA探针到含有100μL染料的对应的管中，并且添加50μL的抗体至一个管中。

4)在4℃与染料一起孵育48hr。

5)添加3.7％(w/v)的最终甲醛来结合吸附的染料，在RT(室温)孵育1hr。

6)在4℃在50x体积的磷酸盐缓冲盐水中透析O/N(过夜)。

7)第二天，用新鲜的盐水缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，在4℃孵育O/N(过夜)。

8)第二天，用新鲜的盐水缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，在4℃孵育O/N(过夜)。

9)从透析盒中移出，并且使用网测定来评定结合。

用于ELISA包被的步骤

1.相对于用于细菌网的捕获剂，按1:1体积比体积的比率收集检测分子。

2.通过添加10μL的细菌捕获组分(大约10μg捕获组分/孔)到聚苯乙烯板的孔中，在4℃O/N(过夜)来包被ELISA。

3.第二天，从4℃移出聚苯乙烯板，允许它们达到室温，用ELISA形式洗涤这些孔，以除去未吸附的病毒和细菌捕获分子。

用于网构建的步骤

下层

32)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面。

33)立即添加[移液管]5μL甲醛到点样的捕获分子上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

34)让其在室温下静置1hr。

第一层

35)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第1层。

36)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2μL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

37)让其在室温下静置1hr。

第二层

38)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第2层。

39)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2uL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

40)让其在室温下静置1hr。

第三层

41)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第3层。

42)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2μL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

43)让其在室温下静置1hr。

44)用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

45)在室温下，用100μL的1:1比率的蛋清和100％无脂奶阻断网30分钟。

测定步骤

1.根据以上方法，以一式三份，构建三层网。

2.将以下各项的混合物掺入EDTA处理的全血样品：酰化脂蛋白-30pg/mL；LPS-3pg/mL；大肠杆菌DNA-0.06pMol；大肠杆菌-40CFU/mL和白色念珠菌(酵母对照)-40个细胞/mL，并且按50μL每孔添加。

3.向样品按5μL/孔添加检测分子。

6.用酶标仪测量每一孔中的吸光度。

由甲醛、BS(PEG)₉、EGS和EMCS组成的细菌捕获网的数量和构成(表12)。

表12在筛选实验中的分子网含量

结果显示了在图6中。

实例11：在血液中的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌细胞的检测

按20CFU/mL将单核细胞增生李斯特菌细胞(革兰氏阳性)和大肠杆菌细胞(革兰氏阴性)掺入来自人供体的全血中。包括真菌细胞(20个细胞/mL)作为阴性对照。

制备分子网来固定与革兰氏阴性和革兰氏阳性菌感染有关的以下分析物：

脂多糖；

脂质A；

酰化脂蛋白；

CpG细菌DNA；

革兰氏阴性菌CFU；

革兰氏阳性菌CFU；

肽聚糖。

网构成和制作

捕获剂-

1)针对脂多糖的抗体(母液＝1μg/mL)；

2)针对脂质A的抗体(母液＝1μg/mL)；

3)针对肽聚糖的抗体(母液＝1μg/mL)；

4)DNA结合肽1(VLFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

5)DNA结合肽2(VMFGKLA)(母液＝1mg/mL)；

6)DNA结合肽6(VFFG LA)(母液＝1mg/mL)。

连接物是-

1)BS(PEG)₉(母液＝7.9mM，在DMSO中)；

2)EGS(母液＝2.5mM，在DMSO中)；

3)EMCS(母液＝1.4mM，在DMSO中)；

4)甲醛(母液＝3.7％v/v，在双蒸H₂O中)。

将被革兰氏阴性检测系统检测的分子

7)革兰氏阴性菌CFU；

8)革兰氏阴性菌外膜；

9)脂多糖；

10)脂质A；

11)酰化脂肽；

12)革兰氏阴性菌CpG 16s rDNA。

将被革兰氏阳性菌检测系统检测的分子

13)肽聚糖；

14)革兰氏阳性菌CpG 16s rDNA。

革兰氏阴性菌检测系统中的分子

1)针对脂质A的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

2)针对脂多糖的多克隆抗体(母液＝1mg/mL)；

革兰氏阳性菌检测系统中的分子

1)针对肽聚糖的抗体(母液＝1mg/mL)；

2)革兰氏阳性菌探针5'-生物素-ACGACAACCATGCACCACCTG(母液＝100pmol)。

染料

3)‘超级黑’染料浓缩物；

4)‘皇家蓝’染料浓缩物。

磷酸盐缓冲盐水(PBS)；

吐温20；

50mM Tris缓冲液，pH 7.5；

抗生物素蛋白(来自蛋清)；

脱脂乳；

聚苯乙烯表面。

方法

检测系统的比色标记

10)产生以下各项的混合物并且称为‘蓝-黑1’-1份蓝，2份黑，用于革兰氏阴性菌检测系统。

11)产生以下各项的混合物并且称为‘黑’-1份黑，用于革兰氏阳性菌检测系统。

12)对于生物素酰化DNA探针：100pmol的每个探针与50μL的100％蛋清(抗生物素蛋白源)在磷酸盐缓冲盐水中孵育，至总体积100μL；在4℃进行结合反应过夜。

13)将抗生物素蛋白结合的DNA探针添加到含有100μL染料的对应的管中，并且添加50μL的抗体至一个管中。

14)在4℃与染料一起孵育48hr。

15)添加3.7％(w/v)的最终甲醛来结合吸附的染料，在RT(室温)孵育1hr。

16)在4℃在50x体积的磷酸盐缓冲盐水中透析O/N(过夜)。

17)第二天，用新鲜的盐水缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，在4℃孵育O/N(过夜)。

18)第二天，用新鲜的盐水缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，在4℃孵育O/N(过夜)。

19)从透析盒中移出，并且使用网测定来评定结合。

用于ELISA包被的步骤

用于网构建的步骤

下层

46)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面。

47)立即添加[移液管]5μL甲醛到点样的捕获分子上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

48)让其在室温下静置1hr。

第一层

49)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第1层。

50)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2μL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

51)让其在室温下静置1hr。

第二层

52)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第2层。

53)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2μL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

54)让其在室温下静置1hr。

第三层

55)添加[移液管]10μL的捕获混合物到表面上以产生第3层。

56)立即添加[移液管]1μL的EGS，并且然后是4μL的EMCS，并且然后是2μL的BS(PEG)₉到捕获混合物上，并且通过在5cm距离内，轻轻来回摇动表面5至10次进行混合。

57)让其在室温下静置1hr。

58)用移液管除去剩余液体，用移液管用50μL PBS洗涤3次。

59)在室温下用100μL的1:1比率的蛋清和100％无脂奶阻断网30分钟。

表12在筛选实验中的分子网含量

测定步骤

1.根据以上方法，以一式三份，构建三层网。

2.将以下各项的混合物掺入EDTA处理的全血样品：单核细胞增生李斯特菌-40CFU/mL，大肠杆菌-40CFU/mL和白色念珠菌(酵母对照)-40个细胞/mL，并且按每孔50μL添加。

3.向样品按5μL/孔添加检测分子。

6.用酶标仪测量每个孔中的吸光度。结果显示在图7中。

实例12：用于产生延长的连接物的方法

延长的连接物可以用来制造尤其多孔的层。可以制造/购买含有一个或一个以上种类的以下各项的延长分子：游离胺、羟基、羧基或巯基。

延长分子的实例：

蛋白质：聚精氨酸(连接到多肽链中的5至50个氨基酸)；

蛋白质：聚赖氨酸(连接到多肽链中的5至50个氨基酸)；

碳水化合物：纤维素；

碳水化合物：直链淀粉；

碳水化合物：木聚糖；

核酸：鲑精DNA。

方法：

1.一个均匀的群的延长分子可以与一个均匀的群的异双功能交联剂混合，这样交联剂的每一分子中只有一个功能端结合到延长分子上，以产生以下构造：实例：EMCH-{直链淀粉}-EMCH。

2.可以用50nM Tris，pH 7.5来淬灭延长的连接反应。

3.通过尺寸排阻色谱法并且通过透析，可以从未连接的单体中分离延长的连接。

4.延长的连接可以与捕获分子混合，以产生分子网中的一个层。实例：含巯基捕获分子-EMCH-直链淀粉-EMCH-含巯基捕获分子。

实例13：用于构建具有增强的分析物结合特性的小规模网制作；在连接物比捕获分子摩尔过量中的说明。

通过将10μL的白蛋白沉积到聚苯乙烯表面上形成下层，随后立即添加1μL甲醛以形成用于分子网的一个坚固的结构基底。在15分钟以后，将9μL的捕获分子和1μL的EGS沉积到下层上，并且在RT(室温)孵育30分钟。通过添加10μL的捕获分子、1μL EMCS和1μL的EGS，并且在RT(室温)孵育30分钟来添加第二层。通过沉积11μL的抗体和1μL BS(PEG)₉并且在RT(室温)孵育30分钟，来添加第三层。在使用之前，用白蛋白和酪蛋白阻断该网30分钟。其他实例已经使用一个范围的连接物对捕获分子比率，范围是从0.5-500倍摩尔过量。

表13

虽然已经参考它的具体实施方案对本发明做了描述，本领域的那些技术人员应当理解的是，可以做出不偏离本发明的范围的不同改变并且可以取代等效物。此外，可以做出许多修改来适应特定的情况、材料、物质的构成、方法、一个或多个工艺步骤，以达到由本发明提供的益处而不偏离本发明的范围。所有这样的修改都预期在于此所附的权利要求的范围之内。

在此引用的所有出版物和专利文献通过引用结合在此，就像特别并且单独地表明每一个这样的出版物或文献将通过引用结合在此。出版物和专利文献的引用并不预期指示为任何这样的文献都是相关现有技术，它也并不构成对相关现有技术的内容或日期的任何承认。

Claims

1.一种制造物品，包括

具有一种第一捕获剂组合物的一个第一部分，该第一捕获剂组合物包括一个或多个种类的第一捕获剂和一个或多个种类的第一连接剂，其中在该第一部分中的至少一些捕获剂通过一种第一连接剂直接连接至在该第一部分中的至少一种其他捕获剂；

具有一种第二捕获剂组合物的一个第二部分，该第二捕获剂组合物包括一个或多个种类的第二捕获剂和一个或多个种类的第二连接剂，其中在该第二部分中的至少一些捕获剂通过一种第二连接剂直接连接至在该第二部分中的至少一种其他捕获剂；

其中至少一个种类的第一捕获剂不同于至少一个种类的第二捕获剂；并且

其中在该第一部分中的一些捕获剂通过多种连接剂连接至在该第二部分中的多种捕获剂，使得该第一部分和该第二部分形成一个连续的分子网，所述分子网的每个部分具有不同的孔隙率。

2.一种制造物品，包括

具有一种第一捕获剂组合物和一种第一连接剂组合物的一个第一部分，该第一捕获剂组合物包括第一多个异质性捕获剂，该第一连接剂组合物包括第一多个异质性连接剂，其中在该第一部分中的至少一些捕获剂通过一种连接剂直接连接至在该第一部分中的至少一种其他捕获剂；

具有一种第二捕获剂组合物和一种第二连接剂组合物的一个第二部分，该第二捕获剂组合物包括第二多个异质性捕获剂，该第二连接剂组合物包括第二多个异质性连接剂，其中在该第二部分中的至少一些捕获剂通过一种连接剂直接连接至在该第二部分中的至少一种其他捕获剂；

其中该第一部分的第一捕获剂组合物和第一连接剂组合物不同于该第二部分的第二捕获剂组合物和第二连接剂组合物；并且

其中在该第一部分中的至少一些捕获剂分子通过多种连接剂连接至在该第二部分中的至少一些捕获剂分子，使得该第一部分和该第二部分形成一个连续的分子网，所述分子网的每个部分具有不同的孔隙率。

3.一种制造分析试剂的方法，包括通过结合以下各项，形成一个第一层

(a)第一多个种类的捕获剂，其中所述第一多个种类的捕获剂结合一个以上的生物靶，所述捕获剂具有多个捕获剂反应基团，以及

(b)一种第一连接剂或多个第一连接剂，其中这一种或多种连接剂含有与多个捕获剂反应基团互补的多个反应基团，

在其中多种捕获剂经由这一种或多种连接剂而相互连接的条件下，由此形成一个第一层，该第一层包括相互连接的多种捕获剂的第一网络；

并且然后通过结合以下各项形成邻近该第一层的一个第二层

(c)第二多个种类的捕获剂，其中所述第二多个种类的捕获剂结合一个以上的生物靶，所述捕获剂具有多个捕获剂反应基团，以及

(d)一种第二连接剂或多个第二连接剂，其中这一种或多种连接剂含有与多个捕获剂反应基团互补的多个反应基团，

在其中第二多个捕获剂中的捕获剂经由这些第二连接剂而可以相互连接的条件下，由此形成一个第二层，并且

其中在第二多个种类的捕获剂中的一些捕获剂经由第二多个连接剂与第一多个种类的捕获剂中的一些捕获剂相互连接，以形成一个连续的分子网，所述分子网的每个层具有不同的孔隙率。

4.如权利要求3所述的方法，包括在步骤(c)之前除去多种未结合的捕获剂和连接剂。

5.如权利要求3至4的任一项所述的方法，其中第一多个种类的捕获剂的组成不同于第二多个种类的捕获剂的组成。

6.如权利要求3至4的任一项所述的方法，其中在步骤(b)中的一种或多种连接剂不同于在步骤(d)中的多种连接剂。

7.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(b)中的一种或多种连接剂不同于在步骤(d)中的多种连接剂。

8.如权利要求3、4和7的任一项所述的方法，进一步包括进行1-6个另外轮的结合捕获剂和连接剂，其中每一轮产生分子网的一个另外的层。

9.如权利要求5所述的方法，进一步包括进行1-6个另外轮的结合捕获剂和连接剂，其中每一轮产生分子网的一个另外的层。

10.如权利要求6所述的方法，进一步包括进行1-6个另外轮的结合捕获剂和连接剂，其中每一轮产生分子网的一个另外的层。

11.一种分析试剂，通过如权利要求3至10的任一项所述的方法进行生产。

12.一种同时确定在样品中的多个预定分析物的存在或缺乏的方法，该方法包括使该样品与根据权利要求1或2所述的一种制造物品接触，该制造物品具有对于所述分析物特异的多种捕获剂，并且确定所述分析物是否被所述制造物品结合。

13.如权利要求12所述的方法，其中确定所述分析物是否被所述制造物品结合包括使结合的分析物与结合一种或多种所述分析物的一种或多种检测试剂接触。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述检测试剂是用比色的、荧光的、或发光的可检测标记而被可检测地标记的。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述检测试剂选自下组，该组由以下各项组成：抗体、核酸、凝集素和DNA结合多肽。

16.如权利要求13所述的方法，其中使用两种或更多种检测试剂，每一种检测试剂特异结合到不同种类的分析物上。

17.如权利要求16所述的方法，其中用相同的可检测标记来标记所述两种或更多种检测试剂。

18.如权利要求16所述的方法，其中用不同的可检测标记来标记至少两种所述检测试剂。

19.如权利要求18所述的方法，其中用第一可检测标记所标记的第一检测试剂结合在第一部分中的分析物，并且用第二可检测标记所标记的第二检测试剂结合在第二部分中的分析物。

20.如权利要求18所述的方法，其中捕获的分析物被第一检测试剂的结合和不同的捕获的分析物被第二检测试剂的结合是可区别的，并且其中这两种分析物的结合可以区别于只有一种分析物的结合。

21.一种装置，包括：

具有至少一个分子网支持表面的一个便携式壳体；以及

偶联到该至少一个分子网支持表面上的、如权利要求1或权利要求2所述的至少一个分子网。

22.如权利要求21所述的装置，其中该便携式壳体包括至少一个附属特征，该特征被配置为在操作上偶联到一个样品处理装置上。

23.如权利要求21所述的装置，其中该至少一个分子网支持表面的至少一部分限定了在该便携式壳体内的一个室，其中该室包括一个室入口。

24.如权利要求23所述的装置，其中该分子网跨该室的至少一部分。

25.如权利要求24所述的装置，其中该室包括一个室出口，并且其中该至少一个分子网将在该室入口和该室出口之间的室分开。

26.如权利要求25所述的装置，其中多个分子网将在该室入口和该室出口之间的室细分。

27.如权利要求23所述的装置，其中该分子网被偶联到该至少一个分子网支持表面上，使得该分子网限定了该室的一个壁。

28.如权利要求23所述的装置，其中一个针被附接到该便携式壳体上，该针被流体偶联到该室入口。

29.如权利要求23所述的装置，其中多个传感器和多个分子网被至少部分地偶联到该至少一个分子网支持表面上。

30.如权利要求29所述的装置，其中该多个传感器被该多个分子网分层。

31.如权利要求30所述的装置，其中该多个传感器和该多个分子网被布置成在一个叠加布置中交替。

32.如权利要求31所述的装置，其中该室包括偶联到该多个传感器上的至少一个放大器。

33.如权利要求23所述的装置，其中该室包括多个分层的分子网。

34.如权利要求33所述的装置，其中每个分子网被配置为结合不同的分析物或多个分析物的组合。

35.如权利要求34所述的装置，进一步包括一个或多个可检测地标记的检测剂。

36.如权利要求35所述的装置，其中基于一种预定检测剂与一种预定分析物的结合，每个分子网被配置为发射一种不同的颜色，所述预定分析物被一种捕获剂结合。

37.一个系统，包括：

一个计算机系统，包括至少一个处理器；以及

一个可操作地偶联到该处理器上的传感器，

其中该传感器是可操作地偶联到支持如权利要求1所述的分子网的一个结构上，该传感器被配置为提供在被该分子网容纳的预定分析物的直接存在下产生的一种信号，

其中该处理器被配置为接收并且处理来自该传感器的信号。

38.如权利要求37所述的系统，其中该结构包括限定一个样品室的至少一部分的一个支持表面，该表面支持该分子网，并且其中该传感器暴露于该样品室并且被该支持表面或该结构的另一表面支持。

39.如权利要求38所述的系统，其中该结构包括至少一个另外的室，该另外的室与该样品室、洗涤室、缓冲剂容纳室、放大室、以及废物室的至少之一处于流体连通。

40.如权利要求38所述的系统，其中该结构包括限定多个对应的样品室的多个支持表面，并且每一个支持表面支持多个对应的分子网。

41.如权利要求40所述的系统，其中每个样品室被安排为处于彼此流体连通。

42.如权利要求37所述的系统，其中该传感器包括一个太阳能电池、或多个纳米天线中的至少之一。

43.如权利要求37所述的系统，其中该传感器包括一个染料敏化的太阳能电池、一个聚合物太阳能电池或一个有机太阳能电池中的至少之一。