DE19703718A1 - Affinitätssensoren und -assays - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Affinitätssensoren und -assays zur Detektion von Substanzen über spezifische Bindungen zwischen Rezeptoren und Liganden, also auf Rezeptor-Ligand-Systeme.

Derartige Sensoren und Assays werden insbesondere jedoch nicht ausschließlich im Bereich der Biosenso­ rik und Biochemie, der Pharmazie, der Pharmazeutik, der Umweltchemie und auch ganz allgemein im Bereich der Chemie verwendet. Im Bereich der Biosensorik und Biochemie werden sie häufig zum Nachweis von Antikör­ pern oder Proteinen beispielsweise durch Oberflächen- Plasmonen-Resonanz, Immunhistologie, Immunchromato­ graphie oder auch typischerweise bei Dip-Stick-Assays verwendet.

Bekannt sind beispielsweise sogenannte Dip-Stick-As­ says, bei denen ein analytspezifischer Antikörper an einen geeigneten Träger (den Stick) gebunden ist, der den Analyten aus der zu testenden Lösung fängt. Ein weiterer analytspezifischer Antikörper, der ein ande­ res Epitop auf dem Analytmolekül erkennt, wird gleichzeitig hinzugegeben. Der Bereich des Dip- Sticks, in dem der erste Antikörper immobilisiert ist, kann anschließend angefärbt werden und signali­ siert somit das Vorhandensein des Analyten in der getesteten Lösung.

In immunchromatographischen Tests konkurrieren in einer Reaktionskammer freier Analyt und an die Fest­ phase gebundener Analyt um die Bindung an spezifische Antikörper. Bei hohen Analytkonzentrationen bleiben viele Antikörper-Farbstoffkonjugate in Lösung und wandern auf einer geeigneten Festphase zu spezifi­ schen anti-Antikörpern, die auf der Festphase kova­ lent immobilisiert sind. Dadurch entsteht eine farbi­ ge Markierung.

Aus dem Stand der Technik (Mayo und Hallock, Journal of Immunologicl Methods, Band 120 (1989), Seiten 105 bis 114) ist ein Verfahren bekannt, bei dem mit Hilfe von Oberflächen-Plasmonen-Resonanz die Bindungen zwi­ schen einem Liganden und einem Rezeptor nachgewiesen werden kann. Wesentlich ist dabei, daß der Rezeptor bzw. der Ligand an einer Oberfläche, die einen Wel­ lenleiter begrenzt, gebunden ist.

Problematisch bei sämtlichen dieser Verfahren ist, daß die Oberflächen, an die die Rezeptoren bzw. Li­ ganden gebunden sind, auch unspezifische Adsorption von Proteinen zulassen. Daher sind derartige Affini­ tätsassays in der Anwendung auf Realproben, bei­ spielsweise Proteingemische wie Blut, Serum oder Blutplasma lediglich eingeschränkt verwendbar. Um derartige unspezifische Bindungen zu vermeiden, wer­ den im Stand der Technik Standard- Blockierungsproteine oder stark hydrophile Verbindun­ gen eingesetzt. Beispielsweise wird von den Firmen Pharmacia und Fisons in den jeweiligen kommerziellen Oberflächen Plasmon Resonance Geräten (Biacore/IAsys) das Polysaccharid Dextran als Blockierungsreagenz verwendet. Der Einsatz dieser Verbindung stellt zwar eine deutliche Verbesserung zu früher dar, es ist jedoch dennoch noch nicht möglich, generell in Blut zu messen.

Nach dem Stand der Technik erfolgt der Farbnachweis von Antikörpern mit Goldpartikeln bzw. mit Partikeln aus Kohlenstoff oder SiO₂ (Uchida et al. Journal American Chemical Soc. 1990, Band 112, Seiten 7077 bis 7079). Die Bindung erfolgt dabei über hydrophobe Wechselwirkungen, wodurch stets die Gefahr der unspe­ zifischen Bindungen der Partikel an Oberflächen be­ steht. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die Biomoleküle nicht gerichtet gekoppelt werden können, so daß bei bestimmten Molekülen eine Inaktivierung durch die Bindung an die Partikel nicht auszuschlie­ ßen ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Affini­ tätssensoren und -assays, d. h. Nachweisreagenzien bzw. Rezeptor-Ligand-Systeme sowie Verfahren zum spe­ zifischen Nachweis von Analyten, beispielsweise Li­ ganden bzw. Rezeptoren, zur Verfügung zu stellen, die einen Nachweis derartiger Analyte mit hoher Genauig­ keit sowie mit geringem störenden Untergrundsignal ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch die Dendrimere gemäß An­ spruch 1 sowie durch die Verwendung dieser Dendrimere nach Anspruch 11 in Verbindung mit ihren kennzeich­ nenden Merkmalen gelöst.

Dendrimere sind dreidimensionale Polymere annähernd kugelförmiger Gestalt. Sie zeichnen sich durch eine festgelegte Zusammensetzung, großes Molekulargewicht sowie durch eine stark verzweigte Architektur aus. Sie werden daher häufig auch nanoskopische Verbindun­ gen genannt. Die Synthese erfolgt nach dem Stand der Technik dabei ausgehend von einem polyvalenten Mono­ mer schichtweise in sogenannten Generationen. Die Herstellung solcher Dendrimere ist ausführlich in Uchida et al. Journal American Chemical Soc. 1990, Band 112, Seiten 7077 bis 7079, beschrieben.

Durch Auswahl der Monomere kann die Größe dieser Mo­ leküle sehr genau festgelegt werden. Der kugelförmige Habitus ergibt sich aus den sterischen Wechselwirkun­ gen der letzten Generation. Durch Wahl der Monomere der letzten Generation kann die Funktionalität der Oberfläche der Dendrimere festgelegt werden. Darüber hinaus können diese Moleküle durch eine sogenannte konvergente Synthese erzeugt werden. Dabei werden zu­ nächst Kugelschnitte synthetisiert, die später mit­ einander verknüpft werden.

Bei Einsatz von Dendrimeren für die Anbindung spezi­ fischer Rezeptormoleküle bzw. spezifischer Ligandmo­ leküle kann über die Wahl der Monomere der letzten Generation die Funktionalität der Oberfläche der Den­ drimere festgelegt werden. Derartige Dendrimere er­ lauben die gerichtete Kopplung und spezifische Bin­ dung von Rezeptormoleküle bzw. Ligandenmoleküle und dadurch eine spezifische und sehr intensive Markie­ rung von Ligand- bzw. Rezeptormolekülen. Je nach Ana­ lyt (Rezeptor bzw. Ligand) wird an die Oberfläche der Dendrimere das jeweils komplementäre Molekül (Ligand bzw. Rezeptor) gebunden.

Dabei ist der Einsatzbereich dieser Dendrimer-Rezep­ tor/Ligand-Konjugate nicht nur auf das System Anti­ körper-Antigen beschränkt sondern kann prinzipiell auf alle Rezeptor-Ligand-Systeme übertragen werden, beispielsweise auf den Nachweis von Proteinen, Ribo­ nukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren. Auch an den Nachweis anorganischer Analyte kann gedacht wer­ den, wobei es auch hier möglich ist, ein Dendrimer- Antikörper-Konjugat oder auch ein sonstiger anorgani­ scher spezifischer Ligand für den Analyten in Verbin­ dung mit einem Dendrimer zu verwenden. Die große und regelmäßige Oberfläche ermöglicht es, eine hohe Bele­ gungsdichte mit Rezeptoren bzw. Liganden zu ermögli­ chen.

Die erfindungsgemäßen Dendrimere werden besonders vorteilhaft in der Bioanalytik, Biosensorik oder Im­ mundiagnostik eingesetzt.

Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Dendrimere und ihrer Anwendung werden in den abhängi­ gen Ansprüchen gegeben.

Durch die hohe Zahl an reaktiven Gruppen auf der Oberfläche der Dendrimere ist es möglich, neben den Rezeptormolekülen bzw. Ligandenmolekülen viele Farb­ stoffmoleküle pro Dendrimer zu binden. Derartige Farbstoff-Rezeptor/Ligand-Dendrimer-Konjugate können insbesondere vorteilhaft in der Biosensorik, Bioana­ lytik oder Immundiagnostik eingesetzt werden. Werden als Farbstoffe Fluorophore verwendet, so eignen sich die Dendrimere zum Einsatz bei Fluoreszenz-Immunoas­ says. Mit Hilfe dieser Konjugate wird bei sämtlichen im Stand der Technik bekannten Immunoassays eine be­ sonders intensive Farbmarkierung und damit ein beson­ ders guter Nachweis von Analyten möglich.

Die Dendrimere können mit den Rezeptormolekülen bzw. Ligandmolekülen über Spacermoleküle oder mit Hilfe von Crosslinker-Molekülen kovalent gebunden werden. Insbesondere ist über derartige kovalente Bindungen eine gerichtete Bindung der Rezeptoren bzw. Liganden möglich. In diesem Falle können die Liganden bzw. Rezeptoren auf den jeweiligen Analyten ausgerichtet werden, wodurch der Nachweis weiter verbessert werden kann. Auch der gleichzeitige Nachweis mehrerer Analy­ te über den Einsatz einer Mischung von Dendrimeren mit unterschiedlichen Rezeptoren/Liganden bzw. über den Einsatz von Dendrimeren, an die mehrere unter­ schiedliche Liganden bzw. Rezeptoren gebunden sind, ist möglich, so daß multifunktionale Nachweismethoden auf einfache Art und Weise durchgeführt werden kön­ nen.

Der parallele Nachweis mehrerer Analyte wird weiter vereinfacht durch die Bindung unterschiedlicher Farb­ stoffmoleküle an die Dendrimere, so daß die einzelnen Analyte über unterschiedliche Farbgebungen nachgewie­ sen werden können.

Anwendung finden mit fluorophorbeladene Dendrimeren markierte Antikörper in der Immunhistologie, wo Anti­ gene, die in geringen Konzentrationen im Gewebe ex­ primiert werden, detektiert werden sollen, was auf­ grund der hohen Fluorophordichte pro Antikörpermole­ kül mit Hilfe der erfindungsgemäßen Dendrimere mög­ lich wird. Ein weiteres Einsatzgebiet sind Fluores­ zenz-Immunstests in Mikrotiterplatten und die spezi­ fische Fluoreszenzmarkierung von Oberflächen pro- bzw. eukaryontischer Zellen mit Antikörper-Dendrimer- Farbstoffkonjugaten und anschließender Selektion mit­ tels eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers.

In sogenannten Dip-Stick-Assays ist ein analytspezi­ fischer Antikörper an einen geeigneten Träger gebun­ den, der den Analyten aus der zu testenden Lösung fängt. Ein weiterer analytspezifischer Antikörper, der ein anderes Epitop auf dem Analytmolekül erkennt, und welcher mit chromophorbeladenen Dendrimeren ge­ koppelt ist, wird gleichzeitig hinzugegeben. Durch die hohe Konzentration an Immunkomplexen und die hohe Farbstoffbelegung der Dendrimere färbt sich der Be­ reich des Dip-Sticks, in dem der erste Antikörper immobilisiert ist, besonders intensiv an und signali­ siert somit das Vorhandensein des Analyten in der getesteten Lösung.

In immunchromatographischen Tests konkurrieren in einer Reaktionskammer freier Analyt und an die Fest­ phase gebundener Analyt um die Bindung an spezifische Antikörper. Bei hohen Analytkonzentrationen bleiben viele Antikörper-Dendrimer-Konjugate, die mit Farb­ stoff markiert sind, in Lösung und wandern auf einer geeigneten Festphase zu spezifischen anti-Antikör­ pern, die auf der Festphase kovalent immobilisiert sind. Dadurch entsteht eine farbige Markierung. Durch die Kopplung von verschiedenen Farbstoffen an Anti­ körper-Dendrimer-Konjugate mit unterschiedlichen Spe­ zifitäten ist es möglich, beispielsweise Multianalyt- Teststreifen zu entwickeln, die das Vorhandensein des/der Analyte(n) sowohl durch die Position des ge­ färbten Bereichs als auch durch die entsprechende Farbe angeben.

Diese Anwendungsbeispiele sind nicht auf das Antigen- Antikörper-System beschränkt, sondern sind prinzi­ piell auf alle anderen Rezeptor-Ligand-Systeme über­ tragbar. Beispiele hierfür sind nukleinsäurebindende Proteine, komplementäre Nukleinsäurestränge, Lektine, Rezeptoren für niedermolekulare bzw. hochmolekulare Verbindungen sowie anorganische Substanzen. Einge­ schlossen sind auch die nativen Formen dieser Rezep­ tor- bzw. Bindungsmoleküle als auch deren rekombinan­ te Analoga. Ebenfalls eingeschlossen sind aktive Fragmente dieser Rezeptor- bzw. Bindungsmoleküle, die enzymatisch, chemisch oder rekombinant hergestellt werden.

Besonders vorteilhaft ist, daß die erfindungsgemäßen Dendrimere mit einer hydrophilen Oberfläche ausge­ stattet werden können, so daß in biologischen Real­ proben die unspezifische Bindung von Proteinen an die Dendrimer-Rezeptor/Ligand-Konjugate stark verringert wird und der Einsatz von Blockierungssubstanzen redu­ ziert werden oder auch ganz entfallen kann.

Dieser Vorteil wirkt sich insbesondere bei der Be­ schichtung von Transduktoroberflächen in Biosensoren aus, wobei hier die Transduktoren beispielsweise die­ lektrische Wellenleiter, planare oder faseroptische Oberflächenplasmonen-Resonanz-Meßwertwandler aber auch Mikrotiterplatten für den Einsatz in ELISAs ein­ schließen.

In diesem Falle werden Transduktoroberflächen mit Dendrimeren beschichtet, die eine hydrophile Oberflä­ chen besitzen und an die in Richtung des Probenmedi­ ums Rezeptoren bzw. Liganden gebunden sind. Dadurch wird eine hochspezifische und effektive Bindung der Analyten an die Transduktoroberflächen bewirkt und gleichzeitig die unspezifische Bindung von beispiels­ weise Proteinen an die Transduktoroberfläche stark verringert.

Die Beschichtung der Transduktoren kann mit Standard­ techniken durch geführt werden. Zur Derivatisierung von dielektrischen Wellenleitern wird beispielsweise eine Silanisierung durchgeführt und im Anschluß an diese silanisierte Oberfläche aminofunktionalisierte Dendrimere gekoppelt. Diese präparierte Oberfläche kann anschließend mittels homo- oder heterobifunktio­ neller Crosslinker mit biologisch aktiven Komponenten gerichtet beschichtet werden.

Eine besondere Form der gerichteten Synthese der er­ findungsgemäßen Konjugate sind Dendrimere, die über konvergente Synthese aus definierten Sektoren aufge­ baut werden. Damit ist es beispielsweise möglich, Dendrimere in der Oberflächenplasmonenresonanz ein­ zusetzen, die über einen thiolfunktionalisierten und einen hydroxylfunktionalisierten Sektor verfügen. Diese Dendrimere können zur direkten Transduktorbe­ schichtung genutzt werden, da die Thiolgruppen eine hohe Affinität zur Edelmetalloberfläche des Transduk­ tors der Oberflächenplasmonenresonanz aufweisen, dort kovalent binden und damit wegen der heterogenen Sek­ torierung der Dendrimere der hydrophile Teil zum Pro­ benmedium gerichtet ist. Über den Einsatz heterobi­ funktioneller Crosslinker lassen sich an diesem hy­ drophilen Teil Antikörper sowie Farbstoffe für Farb­ nachweise gerichtet an diese so präparierte Sensor­ oberfläche koppeln.

Im folgenden werden einige Beispiele für die erfin­ dungsgemäßen Dendrimere sowie ihre Verwendung gege­ ben.

Fig. 1 beschreibt eine Transduktoroberfläche, die mit erfindungsgemäßen Dendrimeren beschichtet ist.

Beispiel 1 Kopplung von Dendrimeren an Antikörper

1 mg Antikörper gelöst in Natriumacetatpuffer, 0,1 M, pH 4,5, mit 40 mM Natriummetaperjodat, wird für 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Oxidation der Zuckerseitenketten wird gestoppt durch Zugabe von 100 µl 15 mM Glycerin in H₂O und für 10 min bei RT inkubiert. Zum Entfernen überschüssiger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4. NH₂ -funktionalisierte Dendrimere (Star­ burst, Generation 4, Aldrich, Produkt-Nr. 41,244-9) (10 µl einer methanolischen Stocklösung, entspricht 5,7×10^-8 mol) werden durch Bildung Schiff′scher Ba­ sen, die durch gleichzeitige Gabe von 1 mg Na-Cyano­ borhydrid reduziert werden, an die Aldehydgruppen der oxidierten Kohlenhydratseitenketten der Antikörper gebunden. Die Inkubationszeit beträgt 24 h bei 4°C.

Beispiel 2 Kopplung von Dendrimeren an Antikörper a) Reversible Blockierung der Aminogruppen des Anti­ körpers

0,5 mg Antikörper in 50 mM Hepes-Puffer, pH 8,5, wer­ den für 1 h bei RT mit 33 µM Citraconic Anhydrid in­ kubiert. Zum Entfernen überschüssiger Reaktanden er­ folgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elu­ tionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4. Die Fraktionen werden spektrophotometrisch bei 280 nm auf den Gehalt an Protein untersucht. Die­ jenigen Fraktionen, die Antikörper enthalten, werden mittels Ultrafiltration mit z. B. Centrikon-Kartuschen (Amicon), die eine Ausschlußgrenze von 30 kDa haben, auf die gewünschte Proteinkonzentration eingeengt.

b) Irreversible Blockierung der Aminogruppen des An­ tikörpers

0,5 mg Antikörper in 0,1 M Borax-Puffer, pH 9,0, wer­ den für 1 h bei RT mit 3 µmol Essigsäure-N-Hydrox­ ysuccinimidester inkubiert. Zum Entfernen überschüs­ siger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4. Die Fraktionen werden spek­ trophotometrisch bei 280 nm auf den Gehalt an Protein untersucht. Diejenigen Fraktionen, die Antikörper enthalten, werden mittels Ultrafiltration mit z. B. Centrikon-Kartuschen (Amicon), die eine Ausschluß­ grenze von 30 kDa haben, auf die gewünschte Protein­ konzentration eingeengt.

Die in Schritt a) oder b) erhaltenen NH₂-blockierten Antikörper (0,5 mg/0,5 ml) werden mit 20 mmol 1-Et­ hyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), 5 mmol N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 10^-7 mol Dendrime­ ren (Starburst, Generation 4, Aldrich, Produkt-Nr. 41,244-9) in Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, für 16 h bei 4°C inkubiert.

Beispiel 3 Kopplung von Dendrimeren an Antikörper

1 mg Antikörper in 1 ml Borax-Puffer, 0,1 M, pH 9,0, wird mit 2 µmol des homobifunktionellen Spacermole­ küls Ethylenglycol-bis(Bernsteinsäure N-Hydroxysucci­ nimid) (EGS) für 2 h bei RT inkubiert. Zum Entfernen überschüssiger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Borax-Puffer. Die aktivierten Antikörper werden mit 5,7×10^-8 mol Dendrimere (Starburst, Generation 4, Aldrich, Pro­ dukt-Nr. 41,244-9) für 16 h bei 4°C inkubiert.

Beispiel 4 Kopplung von Dendrimeren an Antikörper

6×10^-8 mol Carboxyl-funktionalisierte Dendrimere (Starburst^TM, Generation 3,5, Aldrich, Katalog-Nr. 41,243-0) werden mit 5×10^-4 mol EDC und 1,7 µmol NHS in 100 µl Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4 für 1 h inkubiert. Zum Entfernen überschüssi­ ger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels einer Bio-Spin-Kartusche (BioRad, Produkt-Nr. 732- 6002). Die aktivierten Dendrimere werden zu 0,5 mg Antikörper in 0,5 ml PBS gegeben und für 30 min inku­ biert.

Die Trennung der Antikörper-Dendrimer-Konjugate von freien Antikörpern bzw. Dendrimeren erfolgt mittels Gelfiltration über Superdex^TM 200 prep grade (Pharma­ cia), wobei die Probengröße 1% des Säulenvolumens beträgt. Eluiert wird mit 10 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 7,0, Der erste spektrophotometrisch bei 280 nm detektierbare Peak enthält das Dendrimer-Antikör­ per-Konjugat.

Beispiel 5 Kopplung von Farbstoffen an Konjugate aus Antikörpern und aminofunktionalisierten Dendrimeren

Zu den Antikörper-Dendrimer-Konjugaten wird das glei­ che Volumen einer gesättigten Lösung des aminoreakti­ ven Farbstoffs, z. B. Procion Red, in Borax-Puffer, 0,1 M, pH 9,0 gegeben und 24 h bei RT inkubiert. Zum Entfernen überschüssigen Farbstoffs erfolgt eine Gel­ filtration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na- Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4. Das Farb­ stoff-Dendrimer-Antikörper-Konjugat ergibt in der SDS-Gelelektrophorese eine stark rot gefärbte Bande, die gegenüber dem nicht konjugierten Kontrollantikör­ per zu höheren Molekulargewichten hin verschoben ist.

Beispiel 6 Kopplung von aminoreaktiven Fluorophoren an Konjugate aus Antikörpern und aminofunktionalisierten Dendrime­ ren

Antikörper-Dendrimer-Konjugat (Ausgangsmenge des An­ tikörpers: 1 mg) wird mit dem gleichen Volumen einer 5 mg/ml Fluoresceinisothiocyanat in Borax-Puffer, 0,1 M, pH 9,0, gemischt und über Nacht bei RT inkubiert. Zum Entfernen überschüssigen Fluorophors erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Im Falle der Verwendung von Antikörpern mit reversi­ bel geblockten Aminogruppen wird der Antikörper mit 5%iger Essigsäure versetzt und für 30 min inkubiert. Zum Entfernen überschüssiger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Beispiel 7 Bindung von Farbstoffen mit Aminofunktionen an Kon­ jugate aus Antikörpern und Carboxylfunktionalisierten Dendrimeren

Zu den Antikörper-Dendrimer-Konjugaten, die wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt werden, wird das gleiche Volumen einer gesättigten Lösung des Farb­ stoffs, z. B. Direct Yellow 62, in Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, gegeben und für 16 h bei RT inkubiert. Zum Entfernen überschüssiger Reaktanden erfolgt eine Gelfiltration mittels Sephadex G 25. Elutionsmittel: Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Beispiel 8 Kopplung von Dendrimeren an ELISA-Platten a) Adsorptive Kopplung

Die Näpfe von ELISA-Platten (Nunc Maxisorp C96, Kata­ log-Nr. 446612), werden mit 100 µl einer Lösung von NH₂-funktionalisierten Dendrimeren (Starburst, Gene­ ration 4, Aldrich, Produkt-Nr. 41,244-9; 5,7×10^-5 M in 0,1 M Carbonat-Puffer, pH 9,6) für 16 h bei 4°C inku­ biert. Nach Spülen mit Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4 können die gewünschten (Bio-)Moleküle nach Methoden wie ausführlich in Hermanson, G.T. et al., Immobilized affinity ligand techniques, Academic Press, San Diego, 1992 beschrieben, gekoppelt werden.

b) Kovalente Kopplung

Die Näpfe von NH₂-funktionalisierten ELISA-Platten (Costar, Katalog-Nr. 3390) werden mit 100 µl einer 1 mg/ml Ethylenglycol-bis(Bernsteinsäure N-Hydroxysuc­ cinimid) (EGS) Lösung in Na-Phosphatpuffer, 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, für 1 h bei RT inkubiert. Bei ELISA-Platten mit aminoreaktiven Oberflächen (Costar, Katalog-Nr. 2505) entfällt dieser Aktivierungs­ schritt. Nach einem Spülschritt mit Phosphatpuffer erfolgt die Inkubation mit einer Dendrimer-Lösung (5,7×10^-5 M) in Phosphatpuffer. Nach nochmaligem Spü­ len können die gewünschten (Bio-)Moleküle nach Metho­ den wie ausführlich in Hermanson, G.T. et al., Immo­ bilized affinity ligand techniques, Academic Press, San Diego, 1992 beschrieben, gekoppelt werden.

Beispiel 9 Kopplung von Dendrimeren an Glasoberflächen

Die Glasoberfläche wird mit einer Lösung bestehend aus 94% Ethanol, 1% Essigsäure, 4% Wasser und 1% 3- Aminopropyltriethoxysilan für 1 h bei 110°C akti­ viert. Es folgt eine Inkubation mit 5% Cyanurchlorid und 5% N,N-Diisopropylamin in Aceton für 1 h bei RT. Nach Spülen mit Aceton erfolgt eine Inkubation mit 1% Dendrimerlösung in DMSO für 3 h bei RT. Nach Spülen mit DMSO können die gewünschten (Bio-)Moleküle nach Methoden wie ausführlich in Hermanson, G.T. et al., Immobilized affinity ligand techniques, Academic Press, San Diego, 1992, beschrieben, gekoppelt wer­ den.

Beispiel 10

Fig. 1 zeigt eine Edelmetalloberfläche 1 eines bio­ sensorischen Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Transduk­ tors. An diese Edelmetalloberfläche 1 sind Dendrimere 2 durch Chemisorption über Thiolgruppen kovalent ge­ bunden. Diese immobilisierten Dendrimere bestehen aus zwei Sektoren 3 und 4, wobei der Sektor 3 (weiß) die zur Bindung an das Edelmetall nötigen Thiolgruppen aufweist, während der Sektor 4 (schwarz) Hydroxyl­ gruppen aufweist. Durch die kovalente Bindung der Sektoren 3 an die Edelmetalloberfläche 3 sind die Sektoren 4 mit ihren Hydroxylgruppen zum Analyten ge­ richtet. An diese Sektoren 4 sind über die Hy­ droxylgruppen und über Spacermoleküle 5 Antikörper 6 gebunden, die für den Analyten spezifisch sind.

Eine besonders geordnete Belegung der Edelmetallober­ fläche 1 mit Dendrimeren und eine hohe Antikörper­ dichte ergibt sich hierbei dadurch, daß zuerst die reinen Dendrimere an die Edelmetalloberfläche gebun­ den werden und erst anschließend die räumlich sperri­ gen Spacer und Antikörper an die damit schon richtig orientierten Dendrimere gebunden werden.

Claims (22)

1. Dendrimere, dadurch gekennzeichnet, daß an ihrer Oberfläche spezifische Rezeptormoleküle und/oder Ligandenmoleküle gebunden sind.

2. Dendrimere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß der Rezeptor ein Antikörper ist.

3. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an ihrer Oberfläche Farbstoffmoleküle gebunden sind.

4. Dendrimere nach Anspruch 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Farbstoffmoleküle Fluoro­ phore sind.

5. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungen zumindest teilweise kovalente Bin­ dungen sind.

6. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dendrimere mit den gebundenen Rezeptoren und/oder Liganden und/oder Farbstoffen über Spa­ cermoleküle verbunden sind.

7. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptoren und/oder Liganden mithilfe homo- oder heterobifunktionelle Crosslinker an die Dendrimere gebunden sind.

8. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dendrimere eine hydrophile Oberfläche besit­ zen.

9. Dendrimeren nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere verschiedenen Rezeptoren und/oder mehre­ re verschiedene Liganden und/oder mehrere ver­ schiedene Farbstoffmoleküle an die Dendrimere gebunden sind.

10. Dendrimere nach mindestens einem der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dendrimere mindestens zwei Sektoren aufwei­ sen, in denen verschiedene Rezeptoren und/oder verschiedene Liganden und/oder verschiedene Farbstoffmoleküle gebunden sind.

11. Verwendung von Dendrimeren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche in der Bioanalytik, Biosensorik oder Immundiagnostik.

12. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 11 für Fluoreszenz-Immunoassays.

13. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 12 zum Nachweis von Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß der analytspezifische Antikörper an fluorophorbeladene Dendrimere gebunden und mit der das Antigen zu dem Antikörper enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird und daß anschlie­ ßend an das Antigen gebundene Antikörper durch Anregung der Fluoreszenz des Fluorophors nach­ gewiesen werden.

14. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzphotometer und/oder einem Fluoreszenzmikroskop und/oder mit einem Fluores­ zenz-aktivierten Zellsortierer nachgewiesen wird.

15. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß farbstoffbelade­ ne Dendrimere als Nachweisreagens in einem Dip- Stick-Assay oder in der Immunchromatographie verwendet werden.

16. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 11, da­ durch gekennzeichnet, daß an die Oberflächen, an denen die Bindung des Analyten oder Rezeptors erfolgen soll, die Dendrimere gebunden sind.

17. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 16, da­ durch gekennzeichnet, daß die Dendrimere an Oberflächen von Immunoassays, beispielsweise Mikrotiterplatten, gebunden sind.

18. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 16, da­ durch gekennzeichnet, daß die Dendrimere an Oberflächen von Transduktoren von Biosensoren gebunden sind.

19. Verwendung von Dendrimeren nach Anspruch 18, da­ durch gekennzeichnet, daß die Dendrimere an die Oberflächen von dielektrischen Wellenleitern oder planaren oder faseroptischen Oberflächen- Plasmonen-Resonanz-Meßwertwandler gebunden sind.

20. Verwendung von Dendrimeren nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Dendrimere kovalent an die Oberflächen gebunden sind.

21. Verwendung von Dendrimeren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Gemische von Dendrimeren mit mehreren ver­ schiedenen Rezeptoren und/oder mehreren ver­ schiedenen Liganden und/oder mehreren verschie­ denen Farbstoffmolekülen oder Dendrimere, an die mehrere verschiedene Rezeptoren und/oder mehrere verschiedene Liganden und/oder mehrere verschie­ dene Farbstoffmoleküle gebunden sind, verwendet werden.

22. Verfahren zur Bindung von Dendrimeren an Ober­ flächen zur Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst unbeladene Dendrimere kovalent an die Oberfläche gebunden werden und anschließend die Rezeptoren und/oder Liganden und/oder Farbstoff­ moleküle an die Dendrimere kovalent gebunden werden.