FI93904B - Menetelmä spesifisesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisen reaktion yhden tai useamman komponentin määrittämiseksi koenäytteestä käyttäen ainakin yhtä leimattua komponenttia, menetelmä leimatun komponentin valmistamiseksi sekä koepakkaus....... - Google Patents

Description

93904

MENETELMÄ SPESIFISESTI SITOVAN PROTEIININ JA VASTAAVAN SIDOTTAVAN AINEEN VÄLISEN REAKTION YHDEN TAI USEAMMAN KOMPONENTIN MÄÄRITTÄMISEKSI KOENÄYTTEESTÄ KÄYTTÄEN AINAKIN YHTÄ LEIMATTUA KOMPONENTTIA, MENETELMÄ LEIMATUN 5 KOMPONENTIN VALMISTAMISEKSI SEKÄ KOEPAKKAUS IMMUNOKOM-PONENTTIEN MÄÄRITTÄMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää spesifisesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisen 10 reaktion yhden tai useamman komponentin määrittämiseksi koenäytteestä, jossa reaktiossa käytetään hyväksi tällaisten komponenttien ja ainakin yhden leimatun komponentin keskinäistä reaktiivisuuta, joka leimattu komponentti on saatu liittämällä tai adsorboimalla 15 leiman soolipartikkelit suoraan tai epäsuorasti komponenttiin, ja jossa menetelmässä reaktion aikana tai reaktion loputtua, valinnaisesti sidotun ja vapaan leimatun komponentin erotuksen jälkeen, määritetään mainitusta koenäytteestä, tai erotuksen jälkeen saadus-20 ta yhdestä fraktiosta, leiman läsnäolo ja/tai määrä sellaisella menetelmällä, jolla määritettävä komponentti on osoitettavissa kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti .

Edelleen keksintö koskee menetelmää spesifi-25 sesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisessä reaktiossa käytetyn leimatun komponentin valmistamiseksi- liittämällä tai adsorboimalla leiman soolipartikkelit suoraan tai epäsuorasti komponenttiin sekä koepakkausta, joka on tarkoitettu käytettäväksi 30 vesipitoisessa koenäytteessä olevan immunokomponentin määritykseen.

Tässä yhteydessä käytetyllä "spesifisesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisen reaktion komponentti" -termillä tarkoitetaan sel-35 laisia aineita tai näiden osia, kuten reseptoriproteii-neja ja antigeenisiä determinantteja, jotka voivat . sijaita solujen pinnalla, sekä immunokemiallisia ainei- 2 93904 ta, kuten hapteeneja, antigeenejä ja vasta-aineita, jotka voivat olla vesipitoisessa väliaineessa, erityisesti elimistön nesteissä, kuten veriplasmassa, seerumissa tai vastaavissa tai solujen kasvatusliuoksissa.

5 Keksintö liittyy siten laajasti histologian eri alueille, kuten kudos- ja soluvärjäyksiin, joissa tapahtuu immunokemiallisia reaktioita. Liittymisiä voi tapahtua myös kolloidisen leiman ja ei-immunokemiallisen komponentin välillä, kuten DNA ja/tai RNA välillä. Liit-10 tymiset kolloidisen leiman ja muiden makromolekyylira-kenteiden, kuten entsyymien, streptavidiinin jne., välillä ovat myös mahdollisia. Näiden alueiden lisäksi keksintö liittyy myös immunomääritysalueelle esim. diagnostisille alueille (vesipitoisissa koenäytteissä 15 olevien vasta-aineiden, antigeenien tai hapteenien määritykseen). Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa osassa keskittyen erityisesti keksinnön soveltamiseen ensiksi mainitulla alalla, so. diagnostisissa immunomäärityksissä, mutta keksintö ei ole 20 rajoitettu tähän sovellutukseen, vaan se on aivan yhtä käyttökelpoinen histologisissa ja histokemiallisissa tutkimusmenetelmissä.

Patenttihakemusjulkaisussa EP-A-0007654 on kartoitettu tunnettuja immunokemiallisia menetelmiä, 25 joissa annetun immunologisen komponentin olemassaolo * määritetään kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti käyttäen tällaisten komponenttien välisiä keskinäisiä reaktioita, kuten antigeenin ja tämän vasta-aineen reaktiota. Näissä tunnetuissa menetelmissä on tiettyjä 30 epäkohtia tai ongelmia, jotka, mainitun eurooppalaisen patenttihakemusjulkaisun mukaan, voidaan poistaa käyt-täen tämän johdantokappaleessa kuvatun menetelmän mukaista metalli-leimattua komponenttia, joka on saatu liittämällä tai adsorboimalla komponentti suoraan tai 35 epäsuorasti metallin tai metalliyhdisteen tai metallilla tai metalliyhdisteellä päällystetyn polymeeriytimen vesidispersion partikkeleihin, joiden koko on 6 - 100 nm.

3 93904

Kuvattu metalli-immunokemiallinen menetelmä on herkempi kuin tunnetut radio- ja entsyymi-im- munomenetelmät. Lisäksi erilaisten metallileimojen 5 käytön ansiosta menetelmällä on mahdollista osoittaa ja määrittää useampi kuin yksi immunologinen komponentti samasta koenäytteestä samanaikaisesti.

Metallisoolit voivat koostua metalleista tai metalliyhdisteistä, kuten metallioksideista, metalli-10 hydroksideista tai metallisuoloista. Esimerkkeinä mainitaan kulta, hopea, rauta, nikkeli, alumiini, kromi, lyijy# vanadiini, elohopea, mangaani ja näiden metallien yhdisteet, sekä yleisesti kaikki sellaiset metallit, jotka voidaan osoittaa helposti tunnetuilla menetel-15 millä.

Metallisooleja ovat esim. hopea-, kulta- ja platinasoolit. Metalliyhdisteiden sooleja ovat esim. hopeajodidi-, rautaoksidi-, alumiinihydroksidi-, kromi-hydroksidi-, vanadiinioksidi-, rautahydroksidi-, man-20 gaanihydroksidi- ja elohopeasulfidisoolit.

Edullisesti käytetään sellaisia metalleja tai metalliyhdisteitä, joita ei esiinny koenäytteessä, ja näistä erityisesti sellaisia, jotka voidaan osoittaa valitulla menetelmällä niin pienenä pitoisuutena kuin 25 mahdollista.

’ Patenttihakemusjulkaisussa EP-A-0032270 on kartoitettu immunokemiallisten komponenttien sellaisia kvalitatiivisia ja/tai kvantitatiivisia määritysmahdol-lisuuksia, joissa käytetään yhtä tai useampaa leimattua 30 komponenttia, jotka on saatu liittämällä tällainen komponentti tai komponentit suoraan tai epäsuorasti hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystetyn polymeerisen ytimen vesidispersion partikkeleihin.

35 Nyt on yllättäen havaittu, että epämetalleja tai näiden epäorgaanisia yhdisteitä, jotka eivät sisällä metalleja, voidaan myös käyttää leimana ja niillä on 4 93904 tiettyjä etuja metallia sisältävien leimojen käyttöön nähden.

Esillä oleven keksinnön menetelmälle on tunnusomaista, että leimaamiseen käytetään epämetallisen 5 alkuaineen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu alku-aineseleeni, alkuainetelluuri, alkuainerikki, alkuaine-fosfori, alkuainehiili ja alkuainepii, tai tällaisen epämetallisen alkuaineen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen soolia.

10 Tällaiset epämetallisoolit voidaan valmistaa lukuisilla tunnetuilla menetelmillä.

Esim. seleenisoolin valmistamiseksi voidaan viitata julkaisuun Gotbier, Z. fiir Anorg. Chemie 31, 448-450, 1902; telluurisoolin valmistamiseksi voidaan 15 viitata julkaisuun Brintzinger, Kolloid Zeitschrift 78, 22-23, 1936; fosforisoolin valmistamiseksi teokseen

Berichte 37, 14 (1904); piisoolin valmistamiseksi julkaisuun G. Wegelin, Kolloid Z. 14, 65-69, 1914; ja piioksidisoolin valmistamiseksi julkaisuun J. of Col-20 loid and Interface Science 26, 62-69, 1968.

Eräiden edellämainittujen soolien valmistamiseksi kehitettiin uusi menetelmä, jossa käytetään boo-rihydridisuoloja epämetallioksidien pelkistämiseksi. Menetelmä on kuvattu esimerkeissä.

25 Epämetallien soolipartikkelit omaavat varauk- . sen, mikä aiheuttaa stabiloivan vaikutuksen keskinäisen repulsion johdosta. Kun lisätään pääasiassa vahvoja elektrolyyttejä, niin varausjoukko muuttuu, mikä aiheuttaa agglutinaation (yhteenliimautuminen) ja flokku-30 laation (sakkautuminen). Tämä voidaan estää ympäröimällä partikkelit makromolekyyleillä, jotka sisältävät polaarisia ryhmiä, kuten proteiineilla, polyetyleenig-lykoleilla, polymeerisillä hiilihydraateilla, poly-vinyylialkoholeilla ja vastaavilla. Sopivia suojaavia

II

5 93904 proteiineja ovat antigeenit, vasta-aineet ja anti-vas-ta-aineet tai näiden immunokemiallisesti aktiiviset fragmentit, tai hapteenit; jotka on liitetty immunokemiallisesti inertteihin suojaaviin makromolekyyleihin, 5 mikä tuottaa suoraan epämetallien soolipartikkeleilla leimattuja immunokomponentteja.

Kuitenkin on edullista, että epämetallien soolipartikkeleiden ympäröimiseen ei käytetä yksinomaan immunokomponentteja, sillä vaikka tämä aikaansaa stabi-10 loivan vaikutuksen, immunokemiallinen reaktiivisuus on odotettua vähäisempi , mikä johtuu ehkä steerisistä esteistä. Kuitenkin on havaittu, että ympäröinti on edullista suorittaa vain osaksi immunokomponentilla, jonka jälkeen ympäröinti saatetaan loppuun erilaisella 15 suojaavalla, mutta immunokemiallisesti inertillä materiaalilla, kuten inerteillä proteiineilla, esim. albumiinilla, polyetyleeniglykolilla tai muulla polaarisella makromolekyylillä. Eräs toinen ympäröintiin sopiva materiaali on proteiini A tai vastaavat proteiinit, 20 jotka omaavat reaktiivisuutta vasta-aineiden FC-osaan. Proteiinilla A suoritetun epämetallien soolipartikkeleiden ympäröinnin jälkeen ympäröinti saatetaan loppuun halutulla vasta-aineella.

Toinen mahdollisuus on, että epämetallien . 25 soolipartikkelit ympäröidään ensin inertillä hydrofii- lisellä polymeerillä tai kopolymeerillä, jonka jälkeen immunologinen komponentti liitetään ympäröivään materiaaliin adsorption tai kovalenttisten sidosten avulla.

Ympäröinnin tuloksena saadut palloset voivat 30 sisältää yhden soolipartikkelin, mutta polymeeri voi ,,, mahdollisesti ympäröidä useamman kuin yhden soolipar tikkelin.

Soolipartikkeleiden ympäröinti inertillä polymeerillä voidaan toteuttaa eri tavoin, esim. kuten on 35 kuvattu edellämainitussa julkaisussa EP-A-0007654.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti käytettä-. villä epämetallisoolipartikkeleilla on lukuisia etuja 6 93904 ( edellämainitussa patenttihakemusjulkaisussa kuvattuihin metallisoolipartikkeleihin nähden. Esimerkkeinä tällaisista eduista ovat: 1. Esim. seleeni on hinnaltaan edullisempi 5 kuin kulta.

2. Esim. seleenisoolien valmistusmenetelmä on yksinkertaisempi ja nopeampi kuin kultasoolien valmistusmenetelmä .

3. Kultasoolipartikkelit ovat joko pieniä ja 10 monodisperssejä tai suuria, jolloin ne eivät ole mono- disperssejä (J.H.W. Leuvering, Thesis 1984), kun taas näin ei ole asian laita, tai ainakin huomattavasti vähemmässä määrin, seleenisoolien tapauksessa (A. Wa-tillon, J. Colloid and Interface Science 27 (3) 505-15 15 1968). Nämä partikkelit ovat monodisperssejä käytän nöllisesti katsoen minkä tahansa kokoisina.

4. Esim. seleenisoolit voivat omata negatiivisen ja positiivisen varauksen riippuen valmistusmenetelmästä (Gmelings Handbuch Anorg. Chemie 1953 A pp.

20 26-27), mikä ei ole asian laita esim. kultasoolien tapauksessa.

5. Käytettäessä epäorgaanisia epämetallien kolloidipartikkeleita leimana herkissä koejärjestelmissä, kuten agglutinaatio- (tai agglutinaation inhibi- 25 tio) menetelmissä, koeliuskametodologiassa ja pis-' te/täplä (spot/blot) menetelmissä, epäorgaanisten epä metallisten kolloidipartikkeleiden, joilla on suhteellisen alhainen spesifinen massa, etuna on suurempi liuosstabiilisuus suuremmilla partikkelikoilla verrat-30 tuna epäorgaanisiin metalleihin, joilla on paljon suurempi spesifinen massa. Suuremmat partikkelikoot ovat yleisesti edullisempia, sillä ne parantavat kokeen herkkyyttä: immunokemiallisessa reaktiossa muodostuneiden vasta-aine-koiloidipartikkeli-antigeenikompleksien 35 määritys on helpompaa, kun määritettävän leiman osuus kompleksissa on suurempi. Lisäksi käytettäessä suurempia partikkeleita kokeen herkkyys paranee liitettäessä » 7 93904 suuri määrä immunokemiallisesti inertiä proteiinia kolloidisiin partikkeleihin mainittuihin partikkeleihin liitettävän spesifisesti sitovan proteiinimäärän kustannuksella. Tällainen mittaus aikaansaa leimakonjugaa-5 tin kokonaissitomiskapasiteetin pienemiseen.

Patenttihakemusjulkaisussa US-A-4,341,757 on kuvattu menetelmä, jossa seleeni on leiman osa. Se-leeniyhdiste on ensin liitetty orgaaniseen yhdisteeseen, jonka jälkeen saatu yhdiste on sidottu immunoke-10 mialliseen komponenttiin. Eri spesifisen immunokemial-lisen komponentin kanssa muodostetun kompleksin jälkeen tämä kompleksi eristetään ja kompleksissa oleva seleeni määritetään esim. atomiadsorption avulla. Julkaisussa ei ole käytetty esillä olevan keksinnön mukaista pu-15 naista seleenisoolia.

Patenttihakemusjulkaisussa EP-A-0032270 on kuvattu menetelmä, jossa käytetään merkkiainetta (tracer), joka koostuu hydrofobisen väriaineen tai pigmentin ja immunokemiallisen komponentin, joka on sidottu edel-20 liseen kemiallisen reaktion kautta, vesidispersiosta. Saatu kompleksi kykenee reagoimaan spesifisesti erilaisen immunokemiallisen komponentin kanssa. Käytetty väriaine ja/tai pigmentti antavat leimajärjestelmälle värin. Tämä menetelmä ei ole spesifinen, sillä ei voida 25 olla etukäteen huomioimatta, että järjestelmän väriain-eosa - joka itsessään on orgaaninen komponentti - reagoi koeliuoksessa läsnäolevien muiden tuotteiden kanssa .

Immunokomponentteja, jotka on leimattu epä-30 metallien soolipartikkeleilla, käytetään reagensseinä, tavallisesti yhdessä muiden reagenssien kanssa, osoittamaan ja kvantitatiivisesti määrittämään vesipitoisessa koenäytteessä olevia hapteeneja, antigeenejä ja vasta-aineita, ja näille soveltuvat kaikki vastaavat 35 immunokemialliset menetelmät, joita käytetään radioim-munomäärityksissä ja entsyymi-immunomäärityksissä.

.. Edelleen keksintö koskee koepakkauksia, jotka 8 93904 on tarkoitettu käytettäväksi tällaisissa immunokemial-lisissa määritysmenetelmissä ja jotka sisältävät kaikkein tärkeimpänä osanaan immunokomponentin, joka on leimattu epämetallilla tai sen orgaanisella yhdisteel-5 lä, joka ei sisällä metalleja, joka leimattu immunokom-ponentti koostuu epämetallisoolista, jonka partikkelit ovat joko suoraan ympäröity halutulla immunokomponen-tilla tai inertillä polymeerillä, johon immunokom-ponentti on liitetty tai adsorboitu.

10 Eräs konventionaalinen immunokemiallinen mene telmä on kompetetiivinen immunomääritys, jota voidaan käyttää immunokomponenttien osoittamiseksi ja määrittämiseksi. Osoitettaessa esim. tietty antigeeni tällä menetelmällä koenäyte, joka sisältää tuntemattoman mää-15 rän antigeeniä, saatetaan kosketuksiin joko kyseessä olevan ennalta määritetyn, epämetallilla leimatun anti-geenimäärän ja tämän antigeenin vastaisen liukenemattomaksi saatetun vasta-ainemäärän kanssa, tai ennalta määritetyn, liukenemattomaksi saatetun antigeenimäärän 20 ja tämän antigeenin vastaisen vasta-ainemäärän kanssa, joka on leimattu epämetallilla tai sen yhdisteellä.

Reaktion loputtua määritetään epämetallin luonne ja/tai määrä sidotussa tai vapaassa fraktiossa, mistä saadaan määritettävän antigeenin vastaava kvali-25 tatiivinen ja kvantitatiivinen tulos. Mutatis mutandis, sama menetelmä soveltuu muiden immunokomponenttien määritykseen.

Muita viime aikoina käytettyjä menetelmiä ovat ns. Sandwich-menetelmät, joissa myös voidaan käyttää 30 menestyksellisesti esillä olevan keksinnön mukaista epämetallilla leimattua komponenttia. Näissä menetelmissä immunologinen komponentti, esim. antigeeniä määritettäessä vasta-aine, on tehty liukenemattomaksi liittämällä se kiinteään kantajaan.

35 Kiinteä kantaja on esim. reaktioastian, jossa immunokemiallinen reaktio suoritetaan, sisäpinta. Ensimmäisen inkuboinnin jälkeen, jota mahdollisesti seu- li 9 93904 raa pesuvaihe, suoritetaan toinen inkubointi epämetal-lilla leimatun vasta-aineen kanssa, jonka jälkeen epä-metalli tai sen yhdiste määritetään sidotusta tai vapaasta faasista.

5 Epämetallilla leimatut immunökomponentit so veltuvat hyvin myös käytettäviksi ns. homogeeniisissä immunomäärityksissä, so. immunomäärityksissä, joissa immunokemialliseen reaktioon sidotun ja vapaaksi jäävän leimatun immunologisen komponentin erotus toisistaan ei 10 ole välttämätöntä.

Tällaisten määrityksien etuna on, että niiden toteutus on helppoa, ne tuottavat halutun informaation suhteellisen nopeasti ja soveltuvat erinomaisesti automaatioon.

15 Nykyisessä määrityksessä esim. koenäytettä (tai standardi1iuosta), joka sisältää määritettävää antigeeniä, inkuboidaan yhdessä leimatun vasta-aineen kanssa mikrotiitterilevyn kuopissa. Antigeenin ja (leimatun) vasta-aineen välinen immunokemiallinen reaktio 20 johtaa agglutinaatioon. Näin indusoitu partikkeleiden agglutinaatio epämetallisoolissa aiheuttaa värimuutoksen, joka voidaan havaita esim. spektrofotometrisesti tai paljain silmin.

Pienten antigeenien, jotka ovat immunokemial-25 lisesti tarkasteltuna yksiarvoisia, määrittämiseksi . käytetään agglutinaatio-inhibitioreaktiota, joka perus tuu samaan periaatteeseen.

Edellä mainittujen menetelmien lisäksi on olemassa lukuisia muita immunokemiallisia menetelmiä, 30 joissa epämetallilla leimattua immunokomponenttia voidaan käyttää reagenssina. Esillä oleva keksintö mahdol-.·: listaa myös erilaisten hapteenien, antigeenien, vasta- aineiden tai näiden yhdistelmien osoittamisen testi-näytteestä samanaikaisesti, jolloin jokaiselle osoi-35 tettavalle komponentille käytetään reagenssina omaa immunokomponenttia,joka on leimattu erilaisella epäme-tallisoolipartikkelilla.

10 93904

Reaktioseoksen tietyssä faasissa olevan epäme-tallin luonteen ja/tai pitoisuuden mittaus voidaan suorittaa lukuisilla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkkinä voidaan mainita kolorimetrinen määritys, jossa 5 käytetään hyväksi ominaisuutta, että tietyt epämetal-lien soolit ovat erittäin värikkäitä dispersioita: seleeni = punainen --> sininen, telluuri = ruskea --> sininen, pii = ruskea --> keltainen, fosfori = fluoresoiva sininen, jotka lisäksi vaihtavat väriä fysikoke-10 miallisten muutoksien tapahtuessa; visuaalinen menetelmä, joka toisinaan riittää kvalitatiivisiin määrityksiin, koska edellä esitetyn mukaisesti tietyt epämetal-lien soolit ovat värillisiä; liekkiemissiospektrofoto-metrin käyttö tai mikä tahansa muu plasmaemissiospekt-15 rofotometrinen menetelmä,· joka mahdollistaa samanaikaisen määrityksen; sekä erittäin herkkä liekitön atomiab-sorptiospektrofotometrimenetelmä.

Patenttihakemusjulkaisussa EP-A-0158746 on kuvattu menetelmä, jossa kolloidiset metallipartikkelit 20 voidaan tehdä (paremmin) näkyviksi käyttämällä fysikaalista kehitintä (developer). Tämä fysikaalinen kehitin on hopeaa sisältävä yhdiste. On yllättäen havaittu, että epämetalleja sisältävien kolloidisten partikkelei-den näkyvyyden voimakkuutta voidaan myös lisätä 3-10 25 - kertaisesti. Jopa käytännöllisesti katsoen värittömät ( soolit tai soolien kanssa muodostetut yhdisteet, jotka tällöin ovat erittäin heikosti nähtävissä, voidaan siten muuttaa näkyviksi seuraavassa kuvattujen esimerkkien mukaisesti.

30 Keksintöä havainnollistetaan seuraavien esi merkkien avulla.

Kirjallisuudesta tunnettujen ohjeiden pohjalta on mahdollista valmistaa esim. voimakkaasti värillisiä monodisperssejä kolloidiliuoksia, jotka sisältävät: 35 1. joko pallomaisia Se-partikkeleita, joilla on seuraava kokojakauma ja tätä vastaava värispektri.

11 11 93904

Partikkelikoko, nm Väri halkaisija 40-500 sininen --> punainen 2. tai pitkänomaisia Te-partikkeleita, joilla on seuraava kokojakauma ja värispektri: 5 Partikkelikoko, nm Väri pituus 30-180 ruskea —> sininen leveys 12-25

Valmistusmenetelmää modifioimalla kolloidi-partikkeleiden koko voidaan saada välille 1 - 1000 nm. 10 Te-soolivalmistusohjetta muuttamalla voidaan aikaansaada kolloidisia Te-partikkeleita, jotka ovat muodoltaan pallomaisia.

Esimerkki 1;

Anti-solanidiiniglykosidi IgG kanssa yhdis-15 tetyt Se-partikkelit perunan solanidiiniglykosidien kvantitatiivista määritystä varten.

Johdanto:

Konjugaatit, jotka on saatu puhdistettujen vasta-aineiden ja kolloidisten Se-partikkeleiden väli-20 sellä kemiallisella tai fysikaalisella sidonnalla, käytetään homogeenisessä immunomäärityksessä määrittämään perunauutteiden solanidiiniglykosideja.

Määritys perustuu reaktioseoksen agglutinaa-tioprosessin inhibitioon näytteessä olevilla vapailla 25 solanidiiniglykosideilla. Tämä reaktioseos sisältää * määritettävän näytteen (tai standardiliuoksen), Se-partikkeli- ja .anti-solanidiiniglykosidi igG-konjugaat-tia sekä solanidiiniglykosidityroglobuliinikonjugaattia sellaisen määrän, joka tarvitaan vaadittavaan määritys-30 herkkyyteen. (Liittämällä yksiarvoisia hapteeneja (so-lanidiiniglykosidimolekyylejä) kantajaproteiiniin (ty-roglobuliini) saadaan sellainen immunokemiallisesti moniarvoinen hapteenikompleksi, joka kykenee aggluti-noimaan Se-partikkeli/antisolanidiiniglykosidikonjugaa-35 tin. Tätä solanidiiniglykosidityroglobuliinikompleksin aikaansaamaa Se-partikkeli/anti-solanidiiniglykosidi-konjugaatin agglutinaatiota voidaan inhiboida näyttees- » 12 93904 sä (tai standardiliuoksessa) olevalla vapaalla solani-diiniglykosidilla).

1. Se-soolin valmistus 5 0.5073 g Se02 lisätään varovasti, jatkuvasti sekoittaen, 6 ml kylmään 80 % hydratsiinihydraattiin: muodostuu väriltään verenpunainen öljynen seos, jota sekoitetaan jäähauteessa 30 min ajan.

Tämän jälkeen lisätään seosta 1 ml hyvin nope-10 asti ja voimakkaasti sekoittaen 999 ml kiehuvaan tislattuun veteen. Se-soolia keitetään 15 min ajan.

Siten muodostuu hieman samea, oranssin punertava Se-sooli, joka sisältää (pallomaisia) Se-partik-keleita, joiden keskimääräinen halkaisija on (100 nm) 15 (Watillon, Van Grunderbeeck, 1956).

lcm

Soolin pH on 9.4 ja A =1.35 400 nm 20 2. Solanidiiniglykosidiproteiinikonjugaatin valmistus

Sekä solanidiiniglykosidi BSA-konjugaatti (antigeeni) ja solanidiiniglykosidityroglobuliinikon-jugaatti syntetisoidaan perjodaattimenetelmällä (But-25 ler, V.P; Chen., J.P.Digoxin-specific antibodies. Proc.

Nat. Acad. Sei. USA 1967; 57, 71-78).

3. Kaniinin solanidiiniqlykosidiantiseerumin valmistus

Solanidiiniglykosidiantiseerumi valmistetaan 30 immunisoimalla kaniinit solaniini-BSA-konjugaatilla seuraavan ohjeen mukaisesti.

Tätä tarkoitusta varten liuotetaan 5 mg sola-niini-BSA (kylmäkuivattu) 5 ml liuokseen, joka sisältää : 35 1 osa (steriiliä) suolaliuosta (9 mg/ml NaCl) 1 osa Freundin täydellistä adjuvanttia 1 osa Tween-80 (10 mg/ml) 13 93904

Injektiot: 4 x (1 x per kuukausi) 0.25 ml subkutaanisesti selkään 1 x ml intramuskulaarisesti takakäpälään 5 Tämä injektiokaavio (mahdollisesti) toistetaan kunnes antiseerumitiitteri on riittävän korkea.

Raakaseerumi otetaan talteen kaniinista.

4. Raa'asta kaniinin seerumista saadun IqG-fraktion 10 puhdistus C10/10 pylväs täytetään 1 ml proteiini A-sefa-roosi C1-4B. Pylvään läpivirtausnopeus on 0.8 ml/min. Pylväs tasapainotetaan 5 ml sitovalla puskurilla (katso alle).

15 5 ml seerumia, joka on laimenettu samalla tilavuusmäärällä lähtöpuskuria, saatetaan pylvääseen. Tämän jälkeen täytettyä pylvästä eluoidaan vaiheittain alenevan pH-arvon omaavien puskureiden avulla.

Eluoidut fraktiot dialysoidaan 24 h ajan 5 20 mmoolia NaCl vastaan, pH 7.0 (4°C) ja tämän jälkeen sentrifugoidaan 20,000 x g (4°C) 30 min ajan.

Lopuksi supernatantti analysoidaan SDS-PAGE ja ELISA avulla (haluttaessa anti-BSA IgG fraktio voidaan ravistaa ulos BSA -liuoksen avulla).

. 25 IgG pitoisuus määritetään spektrofotometri- sesti mittaamalla 1 cm 1 cm A ja A eri fraktioiden 10-kertaisesti 30 280 nm 260 nm laimennetuista liuoksista.

- Pitoisuus G (mg/ml) lasketaan seuraavasta kaavasta 35 1 cm 1 cm G = 10 x (1.45 x A ) - (0.75 x A ) 280 nm 260 nm 14 93904

Puskureiden ainekokoomus:

Sitova puskuri: 1.5 M glysiini, 3 M NaCl pH 8.9 sovitetaan 5 M NaOH avulla Eluointipuskurit: 100 mmoolia sitruunahappo 5 pH 4.0; 5.0 tai 6.0 sovitetaan 5 M NaOH

avulla

Regenerointipuskuri: 100 mmoolia sitruunahappo pH sovitetaan arvoon 3.0 5 M NaOH avulla 10 5. Se-partikkeli-anti-solanidiiniglykosidikonjugaatin valmistus (Seuraavassa kaikki toimenpiteet suoritetaan huoneenlämpötilassa ellei toisin mainita).

500 ml Se-soolin (valmistusmenetelmä ks. kohta 15 1) pH sovitetaan arvoon 7.0 10 % ja 0.1 % HCl-liuoksien avulla.

1.5 ml puhdistettua kaniinin anti-solanidii-niglykosidi-immunoglobuliiniiiuosta,jonka pitoisuus on 20 μg/ml/ lisätään tipoittain, voimakkaasti sekoittaen 20 25 ml neutraloituun Se-sooliin.

1 ml 25 g/1 normaalia kaniinin IgG liuosta 5 mmooli NaCl-liuoksessa, pH 7.0, lisätään tämän jälkeen samalla tavoin.

Saatu Se-partikkeli - kaniinin anti-solanidii-25 niglykosidi-immunoglobuliinikonjugaatti sentrifugoidaan : 30,000 x g 10 min ajan. Supernatantti kerätään imu-

suodatuksella ja pelletti, joka koostuu konjugaatista, uudelleensuspendoidaan niin suureen tilavuuteen 0.1 M

Tris/HCl puskuria pH 7.6 (katso kohta 6), että 30 1 cm A = 1.0 400 nm 35 6. Tris-puskurin ainekokoomus 0.1 mooli/1 Tris/HCl 30 g/1 sakkaroosi 0.1 g/1 timerosaali 15 93904 0.25 mooli/1 NaCl 1.5 g/1 PEG 6000 pH 7.6 5 7. Määritysraja

Solanidllniglykosidin määritysraja määritetään solanidiiniglykosidin konsentraation, jolloin määrityksessä saadaan 10 1 cm A -arvo, joka vastaa kontrollin keskimääräistä max 1 cm 1 cm

15 A -arvoa kerrottuna 3 kertaa kontrollien A

max max standardipoikkeama-arvolla.

8. Kokeen suoritus 20 (Tästä eteenpäin esitetyt menetelmät voidaan suorittaa huoneenlämpötilassa) 50 μΐ puskuroitua solanidiiniglykosidistan-dardiliuosta tai 50 μΐ näytettä pipetoidaan päällystämättömän 96-kuoppaisen mikrotiitteri ELISA-levyn kuop-25 piin.

Vähintään 5 min kuluttua lisätään kuhunkin kuoppaan 100 μΐ puskuroitua Se-(anti-solanidiinigly osidi) konjugaattia, jonka 1 cm 30 A 1.0.

max

Toisen vähintään 5 min pituisen aikajakson kuluttua pipetoidaan 50 μΐ puskuroitua solanidiinigly-kosidityroglobuliiniliuosta jokaiseen kuoppaan (kon-35 sentraatio riippuu halutusta määritysherkkyydestä).

2 h inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa A mitataan mikro-ELISA lukijan avulla.

max J

16 93904

Esimerkki 2: Tässä esimerkissä käytetään Te-sooleja.

1. Te-soolin valmistus 5 100 ml 0.5 % (w/v) H TeOe sekoitetaan 30 ml 0.1 6 6 N K2C03 kanssa ja seosta keitetään 15 min ajan.

Tämän jälkeen 5 ml 0.65 - 0.85 % (w/v) askor-biinihappoa lisätään nopeasti ja voimakkaasti sekoittaen. Seoksen annetaan kiehua jälleen 15 min ajan.

10 Muodostuu kirkas, ruskeanpunainen Te-sooli, joka sisältää pitkänomaisia Te-partikkeleita, joiden keskimääräinen pituussuuntainen akseli on (31 nm) ja keskimääräinen poikittaissuuntainen akseli on (12 nm; Johnson, 1953).

15 1 cm

Soolin pH on 9.1; A =1.0 265nm

Jatkomenetelmät ovat identtisiä esimerkin 1 kanssa.

20

Esimerkit 3 ja 4

Leimattujen kolloidisten Se-soolin ja Te-soolin valmistus ja puhdistus, jotka molemmat soolit on tarkoitettu elektronimikroskooppisiin ja optisiin mik-25 roskooppisovellutuksiin immunohisto- ja immunosytokemi-assa.

: 25 ml Se-sooliin, ja vastaavasti Te-sooliin, jotka sisältävät keskimääräiseltä halkaisijaltaan 5 nm, 10 nm, 15 nm, tai 20 nm suuruisia partikkeleita ja 30 joiden pH on sovitettu vastikään arvoon 7.0, lisätään tipoittain 1.0 ml puhdistettua kaniinin anti-solanidii-niglykosidi-immunoglobuliiniliuosta, jonka pitoisuus on 100 pg/ml, ja seosta sekoitetaan samalla voimakkaasti.

(N.B.: IgG fraktiota pitäisi ravistaa BSA-liuoksella).

35 Tätä seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 2 min ajan.

Tämän jälkeen lisätään 10 % (w/v) BSA vesi- * · « 17 93904 liuosta (pH 7.0), kunnes lopulliseksi konsentraatioksi saadaan 1 % (w/v).

Tämän jälkeen seos sentrifugoidaan 4°C seuraavasti : 5 Halkaisija (nm) 5 45,000 x g 45 min ajan 10 45,000 x g 30 min ajan 15 12,000 x g 45 min ajan 20 12,000 x g 30 min ajan 10 Supernatantin määrä vähennetään 10 %:iin alku peräisestä tilavuudesta.

(Pehmeä) pelletti uudelleensuspendoidaan jäljellejääneeseen supernatanttiin.

10.5 ml sentrifugiputkiin valmistetaan 15 10 - 30 % glyseroligradientti 1 % (w/v) BSA-Tris pus kurissa, pH 8.2, putken pituudelle 8 cm.

Puskuri: 20 mM Tris

150 mM NaCl 1 % (w/v) BSA

20 pH 8.2, sovitetaan 1 N HC1 avulla

Gradienttiin lisätään 2 ml uudelleensuspen-doitu pelletti ja sentrifugoidaan SW41 roottorilla 18°C seuraavasti

Esimerkki 3 Esimerkki 4 25 Esimerkki 4 <

Halkaisija (nm) Se Te 5 125,000 x g 200 min 135 min 10 50,000 x g 200 min 135 min 15 15,000 x g 200 min 135 min 30 20 15,000 x g 135 min 90 min *... Gradienttia otetaan talteen 3 cm yläosasta.

Glyseroli poistetaan dialyysillä (24 h huoneenlämpötila) 1% (W/v) BSA-Tris puskuria, pH 8.2, vasten.

35 1 cm Näytteiden A mitataan ja laimennetaan seuraavasti: max 18 93904 lcm

Halkaisija (nm) A

max 5 2.5 5 10 2.5 15 3.5 20 5.0 E.M.- ja L.M.-valmisteiden valmistamiseksi viitataan 10 julkaisuihin

Bullock, G.R. Petrusz, P. (toim.). Techniques in im-munocytochemistry, 2 Academic Press, Lontoo, ss. 217-284 (1983)

Geuze, H.J., Slot, J.W., Ley, P.A., Scheffer, R.C.T. ja 15 Griffith, J.M. The Journal of Cell Biology. Voi. 89 ss.

653-665 (1981).

Horrisberger, M. ja Rosset J.J. Histochem. Cytochem.

25: 295-305 (1977) 20 Esimerkki 5: Monodisperssin seleenisoolin valmistus

Suodatettu liuos (0.22 pm suodatin) 0.2 g Se02 (Baker Chem. Co.) 10 ml:ssa demineralisoitua vettä lisätään 985 ml demineralisoituun veteen. Vähintään 10 min sekoituksen jälkeen lisätään liuos 0.25 g NaBH4 25 (Chemetal) 5 ml:ssa demineralisoitua vettä nopeasti ja erittäin voimakkaasti sekoittaen. Kun seoksen on annet- » tu reagoida 30 min ajan huoneenlämpötilassa, niin sooli voidaan puhdistaa dialyysin avulla. Tämäntyyppisen Se-soolin elektronimikroskopia osoitti, että keskimääräi-30 nenhalkaisija oli 35.2 nm + 4.12 nm (S.D.). Aallonpi-tuusabsorptiospektri osoitti, että 10 % NaCl liuoksella : flokkulaation jälkeen soolilla oli absorption maksimi- erot arvossa λ = 550 nm.

35 Esimerkki 6: Multidisperssin telluurisoolin valmistus Liuos A: 0.10 g H6'Te06 (Merck) per ml demineralisoitua vettä, puhdistettu suodattamalla 0.22 pm » · 19 93904 suodattimen läpi.

Liuos B: 0.10 g NaBH4 (Chemetal) per ml demine-ralisoitua vettä.

1 1 demineralisoituun veteen lisätään 800 μΐ 5 liuos A ja 10 min kuluttua 2 ml liuos B (erittäin voimakkaasti sekoittaen).

Kokonaisreaktioaika on 30 min (huoneenlämpö-tila) . Tämän jälkeen sooli voidaan puhdistaa dialyysillä. Te-soolille havaittiin maksimiabsorptioarvo arvossa 10 λ = 560 nm.

Esimerkki 7: "Värjättyjen"/ monodisperssien piidioksi-dl-soolien valmistus (a) Johdanto 15 Kolloidiset Si02 partikkelit saadaan hydroly soimalla tetra-alkyylisilikaattiestereitä seoksessa, joka sisältää alkoholia, vettä ja ammoniakkia. Tässä menetelmässä, on kaksi tärkeää reaktiota: 1. tetra-alkyyliesterihydrolyysi reaktiivisten silano- 20 lien muodostamiseksi; tässä menetelmässä ammoniakki toimii katalyyttinä.

2. muodostuneiden silanolien transformointi Si02-yhdis-teiksi kondensointireaktion kautta.

Näin muodostuneiden kolloidisten Si02~partik-25 keleiden halkaisija määräytyy reaktioseoksessa olevan veden ja ammoniakin alkukonsentraatiosta. Edellämaini-tulla menetelmällä saadut silikaattisoolit ovat opaa-linhohtoisia ja niillä on maidonvalkoinen väri.

Kolloidisten silikapartikkeleiden "värjäys" on 30 mahdollista, kun tetra-alkyylisilikaattiestereiden hydrolyysin ja tätä seuraavan konsentraatio-/polyme-rointireaktioiden annetaan tapahtua reaktioastiassa, joka sisältää määriteltyjen komponenttien lisäksi väriainetta.

35 Tällaisen väriaineen liukoisuus sekä alkoho liin että veteen pitäisi olla hyvä. Varausvaikutuksen johdosta sellaiset väriaineet, joilla on aikalisiä > « 20 93904 ominaisuuksia, soveltuvat erinomaisesti "värjäämään" (netto(nett)) negatiivisesti varatut Si02-partikkelit.

Mikäli valitulla väriaineella on fluoresoivia ominaisuuksia, niin immunomäärityksistä, joissa "värjä-5 tyt" Si02~partikkelit toimivat leimana, saadut koetulokset on mahdollista lukea UV-alueella. Fluoresoivien Si02~leimojen käyttö immunomäärityksissä lisää yleensä tällaisten koejärjestelmien herkkyyttä.

Tällaisten Si02-leimojen, jotka on "värjätty" 10 selvästi toisistaan erotettavilla väriaineilla ja jotka on varustettu vaaditun spesifisyyden omaavilla vasta-aineilla mahdollistavat erilaisten antigeenien (antigeeniset determinantit) osoittamisen (tai kvantitatiivisen määrittämisen) samasta koenäytteestä nopeasti ja 15 tarkasti.

(b) "Värjätyn" SiO.-soolin valmistus 862 ml absoluuttiseen etanoliin (Merck), liuotetaan 100 mg rodamiini-isotiosyanaattia (RITC) (Sigma) .

20 Tähän liuokseen lisätään 74 ml 25 % NH3-vesi- liuosta (Merck) samalla kun käytetään magneettisekoi-tusta liuoksien sekoittamiseksi keskenään. Tämän jälkeen lisätään 64 ml tetraetyyliortosilikaatti (Merck) nopeasti voimakkaalla sekoituksella. Alussa kirkkaan 25 purppura/punainen liuos muuttuu näkyvästi opaalinhoh-toiseksi n. 7 min kuluttua.

120 min kuluttua sooli puhdistetaan dialyysillä (keinomunuaisen avulla). Dialyysin aikana soolin pH lasketaan arvosta pH 10.0 arvoon pH 6.5. Dialyysi 30 lopetetaan heti, kun dialysaatti ei enää sisällä spekt-rofofotokemiallisesti 1 cm mitattavaa (A = 0) määrää RITC.

560 nm 35 Siten saadaan opaalinhohtoinen, purppura Si02- soolin vesiliuos.

Pallomaisten Si02-partikkeleiden keskimääräinen « 21 93904 halkaisija on 156 nm + 8 nm.

Sooli laimennetaan A (λ = 560 nm) = 1.0 ennen käyttöä.

N.B.

5 I. Suojaamaton sooli flokkuloidaan nopeasti yksiarvoisten kationien (esim. Na+) vaikutuksella. Asianmukaisissa olosuhteissa (ks. esimerkki 8 kohta (a)) proteiinien fysikaalinen adsorptio kolloidisiin silikapartikkeleihin suojaa riittävästi soolia elektro-10 lyytti-indusoidulta flokkulaatiolta.

Ohjeen mukaisesti valmistetussa suspensiossa/ johon on lisätty 64 ml vettä 64 ml tetraetyyliortosili-kaatin sijasta, ei näy havaittavia merkkejä flokkulaa-tiosta elektrolyytin lisäyksen jälkeen.

15 Tämän suspension dialyysi aiheuttaa dramaat tisen värin katoamisen. Kaikki tämä viittaa siihen, että edellämainitun menetelmän mukaisesti valmistettu värjätty sooli ei sisällä kolloidisia RITC-partikkelei-ta ja se sisältää "värjättyjä" Si02-partikkeleita.

20 II. Proteiinin fysikaalinen adsorptio RITC- "värjättyihin" Si02-partikkeleihin alkalisessa väliaineessa (pH 9.5) mahdollistaa teoreettisesti proteiinin sitoutumisen kovalenttisesti additioreaktion kautta, jolloin -NH2 ja/tai -SH-ryhmät proteiinissa liittyvät 25 RITC isotiosyanaattiryhmiin, mikäli nämä CNS-ryhmät ovat proteiinin saatavilla. Proteiinin oletetun sitoutumisen Si02:iin lisäksi voi tapahtua myös ei-toivot-tavaa proteiinin sitoutumista RITCthin. Alhaisessa (alhaisemmassa) pH-olosuhteissa viitattu additioreaktio 30 vaikeutuu.

Myös RITC-Si02-leimatun immunoglobuliinin ja (proteiini) antigeenin välisen reaktion spesifisyyden kannalta on additioreaktion poissulkeminen tärkeää, c) Monoklonaalisen hiiren IqG adsorptio kolloidiseen 35 RITC/Si02 (Kaikki seuraavat operaatiot suoritetaan huoneenlämpötilassa ellei toisin mainita).

22 93904 5 ml RITC/Si02-sooli sovitetaan pH arvoon 7.0 0.1 M K2C03 avulla.

50 μΐ hiiren askitesnestettä lisätään huolellisesti sekoittaen neutraloituun RITC/Si02~sooliin. 15 5 min inkuboinnin jälkeen seos saatetaan vedellä tilavuuteen 15 ml.

Muodostunut RlTC/Si02~IgG (askitesneste) -kon-jugaatti sentrifugoidaan 1300 x g (4°C) 5 min ajan. Su-pernatantti kerätään suodattamalla imun kanssa ja peh-10 meä pelletti, joka koostuu konjugaatista, uudelleen-suspendoidaan 500 μΐ 5 mM NaCl -liuokseen.

Koejärjestelmä ja tulokset

Nitroselluloosakoeliuskat: ks. esimerkki 8 kohta (e) 1.

15 Muodostetaan täplät vuohi-anti-hiiripolyklo- naali IgG (1280 ng - 2.5 pg) laimennussarjasta. Negatiiviseksi kontrolliksi otetaan β-galaktosidaasin (1500 ng - 2.0 pg) laimennussarja.

Eri liuskojen risti-inkubointi suoritetaan 20 sekä RITC/Si02-IgG (askitesneste) konjugaatilla sekä suojaamattomalla RITC/Si02 soolilla. Inkubointiolosuh-teeet ovat esimerkin 8, kohta (e) 2 mukaisia.

Vuohi-anti-hiiritäplät värjäytyvät spesifisesti RITC/Si02-IgG (askitesneste) konjugaatilla 40 ng 25 saakka. Vuohi-anti-hiiritäplät eivät värjäydy spesifisesti suojaamattomalla RITC/Si02 soolilla.

β-galaktosidaasitäplät eivät värjäydy spesifisesti RITC/Si02~IgG (askitesneste) konjugaatilla eikä suojaamattomalla RITC/Si02 soolilla.

30

Esimerkki 8: Proteiinien adsorptio kolloidipartikkelel hin a) Johdanto

Proteiinien liittyminen kolloidipartikkeleihin 35 perustuu kolloidin fysikaalisiin ominaisuuksiin. Proteiinien ja muiden makromolekyylien ansiosta sooli säilyy . stabiilina elektrolyytti-indusoidulta flokkulaatiolta.

• · 23 93904

Proteiiniadsorptioon vaikuttaa: partikkeli- koko, ionikonsentraatio (adsorption aikana niin alhainen kuin mahdollista) sekä kyseessä olevan proteiinin tyyppi; määrä ja molekyylipaino. Tässä yhteydessä kaik-5 kein tärkein parametri on kuitenkin pH. Soolien pH vaikuttaa suoraan proteiinin kokonaissähkövaraukseen (emäs:proteiini varautunut negatiivisemmin; happo: proteiini varautunut positiivisemmin).

Proteiinien adsorptio soolipartikkeleihin 10 tapahtuu parhaiten sellaisissa olosuhteissa, jotka mahdollistavat maksimi "monikohtaisen kosketuksen" toisaalta proteiinien ja toisaalta partikkelipinnan välillä. Tällainen monikohtainen kosketus tuottaa irreversiibelin sidoksen. Tällaiset olosuhteet saavute-15 taan parhaiten käyttämällä minimisuojaavaa (= stabiloivaa) proteiinimäärää (MPA = minimum protective amount) adsorptioprosessin aikana liittymisen kannalta optimi pH arvossa (määritetään empiirisesti).

Proteiini A (ja myös proteiini G) ovat suh-20 teellisen pieniä proteiineja, jotka sitoutuvat lukuisiin immunoglobuliineihin suhteessa 1:1 (ks. taulukko 1). Tämän ominaisuuden vuoksi molemmat proteiinit sopivat erinomaisesti leimaksi/kantajaksi. Vastaavasti visuaalisesti tai muuten havaittavan leiman, kuten 25 värillisen kolloidipartikkelin, liittäminen tällaisiin ·. . proteiineihin mahdollistaa spesifisten määritysmenetel mien suorittamisen.

(b) Kolloidiseen seleeniin tai telluuriin adsorptioon sopivan proteiini A liuoksen valmistus 30 Proteiinin A (vesiliukoinen Sigma Chem.Co.) vakioliuokset (1 mg/ml) valmistetaan demineralisoidun veden avulla ja suodatetaan milliporesuodattimen läpi (0.22 pm).

Näiden liuosten lisäpuhdistus ei ole tarpeel-35 lista, sillä kylmäkuivattu proteiini A toimitetaan suolattomana ja se liukenee täysin elektrolyytittömään veteen.

• k 24 93904

Suodatettuja proteiini A liuoksia pidetään 20°C lämpötilassa ja ne ovat käyttövalmiita sulatuksen ja homogenoinnin jälkeen.

(c) Proteiinin A adsorptio kolloidiseen seleeniin 5 1. Optimistabiloivan proteiini A pitoisuuden määritys Tämä suoritetaan muodostamalla konsentraati-osta riippuva adsorptioisotermi. Proteiini A liuoksen pH sovitetaan 0.01 M K2C03 avulla arvoon 6.1 (proteiinin 10 pl on 5.1) ja soolin pH on sama. Sooli sentrifugoidaan nopeasti (5 min) 500 g ennen käyttöä mahdollisten aggregaattien poistamiseksi.

Proteiini A laimennussarja on seuraava: 50-45-40-35-30-25-20-15-10-5 ja O μg per ml demineralisoitua 15 vettä.

Jokaiseen laimennokseen lisätään 5 ml soolia.

Tämä on sekoitettu aikaisemmin, jonka jälkeen 10 min kuluttua lisätään 1 ml 10 % NaCl. Jälleen 5 min kuluttua mitataan optinen tiheys (O.D.) 550 nm aallonpituu-20 della. Havaituista arvoista muodostetaan kuvaaja vastaavien proteiinipitoisuuksien funktiona. Proteiinin minimi suojaava määrä määritetään kohtana, jossa O.D. tulee vakioksi. Proteiini A ja seleenisoolin konsent-raatiosta riippuva adsorptioisotermi osoittaa, että MPA 25 oli 35 ^g/5 ml (so. 7 pg/ml sooli).

2. Liittymisen kannalta optimi pH määritys 1

Kohdassa A havaittua optimistabiloivaa prote-iinikonsentraatiota käytetään pH ja soolin stabiilisuu-den välisen yhteyden määrittämiseen. Tätä tarkoitusta 30 varten valmistettiin lukuisia proteiiniliuoksia (näiden proteiinipitoisuus oli MPA), joiden pH vaihteli välillä 4 - 10 (0.5 pH -yksikkövälein). Jokaiseen liuokseen (1 ml) lisätään 5 ml vastaavaa pH omaavaa Se-soolia. 10 min kuluttua yritetään aiheuttaa flokkulaatio 1 ml 10 % 35 NaCl-liuoksen avulla ja tämän jälkeen 5 min kuluttua mitataan absorptio arvossa λ = 550 nm. Saaduista arvoista muodostetaan kuvaaja niiden vastaavien pH-arvo- t ·

II

25 93904 jen funktiona. Optimi pH on pH (tai pH väli), jossa sooliproteiiniseoksella on alhaisin absorptioarvo.

(d) Proteiinilla A leimatun seleenisoolin valmistus

Optimistabiloivaa protei inikonsentraatiota 5 nostetaan 10 %. Koeolosuhteissa lähtökohtana on 50 ml Se-sooli (pH 6.1; O.D. 550 nm:0.5). Tähän lisätään 385 μg proteiini A huoneenlämpötilassa ja voimakkaalla sekoituksella. Kokonaisliittymisaika on 10 min. Tämän jälkeen proteiini A-Se-konjugaatti sentrifugoidaan 15 min 10 ajan 4600 g (4°C). Pehmeän pelletin yläpuolella oleva supernatantti poistetaan imemällä, jonka jälkeen pelletti suspendoidaan 5 mM NaCl -liuokseen (1/20 osaa alkuperäisestä tilavuudesta). Lisästabiloivia aineita ei lisätä.

15 (e) Proteiini A-seleenikoettimen herkkyyden ja spesifi syyden määritys 1. Nitroselluloosakoeliuskojen valmistus Nitroselluloosapaperi (huokosten halkaisija 0.45 pm) leikataan 1.2 x 5.5 cm kokoisiksi liuskoiksi.

20 Näihin liuskoihin saatetaan 1 μΐ täplät määritettävää proteiinikonsentraatiota (esim. proteiini A omaa korkean affiniteetin kaniinin IgG (ks. taulukko 1)). Laimen-nussarjan, joka tavallisesti vaihtelee välillä 1280 ng - 2.5 pg, täplien muodostamisen jälkeen liuskat kuiva-25 taan 37°C 20 min ajan.

. Tämän jälkeen blokataan välittömästi ne osat liuskoja, jotka eivät ole peittyneet proteiinilla, 3 % härän seerumialbumiini (BSA) -liuoksella, joka on fos-faattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 37°C lämpöti-30 lassa. 20 min kuluttua liuskat kuivataan 37°C ja ne ovat tämän jälkeen käyttövalmiita.

. 2. Koeliuskojen inkubointi proteiini A-selee nikoettimen kanssa

Koeliuskoja inkuboidaan 1:50 laimennoksena 35 proteiini A-seleenikoettimen ja PBS liuoksessa + 1 % BSA alle 2 h ajan. Inkuboinnin aikana liuoskoja sekä inkubointiseosta sekoitetaan polyproteeniputkissa ra- • · 26 93904 vistimessa. Koettimen herkkyys määritetään tavallisesti alhaisimpina visuaalisesti määritettävinä täplitetyn (immobilisoidun) proteiinin konsentraatioina ei-opti-moiduissa järjestelmissä. Koetulokset on esitetty tau-5 lukossa 2. Määritysraja voidaan nostaa '2-4 kertaisesti käyttämällä hopeavahvistusmenetelmää.

(f) Proteiinin A adsorptio kolloidiseen telluuriin

Te-sooleille pätee periaatteessa samat liit-tämisohjeet kuin Se-sooleille. Proteiini A vakioliu-10 okset ovat identtisiä kohdassa B määriteltyjen liuoksien kanssa.

1. Optimistabiloivan proteiinikonsentraation määritys

Samalla tavoin kuin Se-sooleille Te-sooleille 15 muodostetaan konsentraatiosta riippuva adsorptioisoter-mi (ks. kohta (c) 1). Telluurin tapauksessa saadaan kuitenkin O.D. „ = 1.0 ja pH = 6.1.

Konsentraatiosta riippuvan absorptioisotermin mukaan minimistabiloiva proteiinipitoisuus (MPA) on 30 20 μς/5 ml Te-sooli (so. 6 μς/ml telluurisooli).

2. Optimi liittymis pH määritys PH-riippuva adsorptioisotermi Te-sooleja varten muodostetaan identtisesti vastaavan Se-soolien kuvauksen kanssa (ks. kohta (c) 2). Optimi pH, jossa 25 proteiini A liittyy Te-sooliin on pH 6.1 arvossa O.D..„ = 1.0.

560 nm (g) Proteiinilla A leimatun telluurikoettimen valmistus

Optimistabiloivaa proteiinikonsentraatiota nostetaan 10 % (6.6 μς/ml Te-sooli). Te-soolin pH sovi-30 tetaan 0.01 M K2C03 avulla arvoon 6.1. Haluttu soolimää-rä (käytännössä 50 ml) sekoitetaan proteiinin kanssa . huoneenlämpötilassa. 10 min reaktioajan kuluttua seos sentrifugoidaan 10 min ajan 18,000 g ja 4°C. Pehmeän pelletin yläpuolella oleva supernatantti poistetaan 35 imemällä, jonka jälkeen pelletti suspendoidaan 5 mM NaCl-liuokseen (1/20 osaa alkuperäisestä tilavuudesta).

Suspensioon ei lisätä lisästabiloivia aineita.

27 93904 (h) Proteiini A telluurikoettimen herkkyyden ja spesifisyyden kokeileminen

Nitroselluloosaliuskat valmistetaan ja käsitellään kohdassa (e) kuvatun mukaisesti. Te-sooli-pro-5 teiini A koettimien inkuboinnit vastaavat Se-sooli-proteiini A koettimien inkubointeja. Te-koettimilla värjätyt liuskat luetaan 2 h sisällä. Alhaisimmat visuaalisesti havaittavat konsentraatiot järjestelmässä, jota ei ole vielä optimoitu, on annettu taulukossa 2.

10 (i) Anti-beta-qalaktosidaasi IqG (askitesnesteestä) adsorptio kolloidiseen seleeniin

Sama menetelmä soveltuu periaatteessa kuin muiden proteiinien tapauksessa. Anti-B-galaktosidaasi IgG pitoisuutta ei tiedetä. Tämän vuoksi määrät indi-15 koidaan yksikkötilavuuksina. Muodostettaessa konsent-raatiosta riippuva adsorptioisotermi ja pH-riippuva adsorptioisotermi saatiin MPA arvoksi 0.8 μΐ/ml sooli ja optimi liittymis pH saatiin arvoksi 7.5.

(j) Anti-fl-qalaktosidaasi IqG (askitesnesteestä) leima-20 tun seleenikoettimen valmistus 50 ml soolin pH sovitetaan arvoon 7.5 0.01 M K2C03 avulla. Joukkoon lisätään 80 μΐ anti-β-galaktosidaasi IgG (askitesnesteestä). Liittyminen tapahtuu huoneen lämpötilassa 10 min aikana. Tämän 25 jälkeen seos sentrifugoidaan 4600 g ja 4°C 10 min ajan. Pehmeän pelletin yläpuolella oleva supernatantti poistetaan imemällä ja pelletti suspendoidaan 5 mM NaCl (1/20 osaa alkuperäisestä tilavuudesta). Suspensioon ei lisätä lisästabiloivia aineita. Näin saatua anti-B-30 galaktosidaasi IgG (askites) seleenikoetinta käytetään määrityksiin.

(k) Anti-fl-qalaktosidaasi IqG (askitesnesteestä) leimatun seleenikoettimen herkkyyden ja spesifisyyden määritys 35 Nitroselluloosakoeliuskat: katso kohta (e) 1.

Muodostetaan täplät vuohi-anti-hiiren IgG : (polyklonaalinen 1280 ng - 2.5 pg), β-galaktosidaasin 28 93904 (1500 ng - 2.0 pg) sekä negatiivisena kontrollina toimivan α-galaktosidaasin (1500 ng - 2.0 pg) laimennus-sarjoista.

Se-soolikoettimella suoritettu inkubointi on 5 kohdan (e) 2 mukainen. Koetulokset oh annettu taulu kossa 2.

(1) Anti-fi-qalaktosidaasi IqG (askitesnesteestä) adsorptio kolloidiseen telluuriin ja koe immobilisoidulla β-qalaktosideasi11a 10 Kaikki muut seuraavat vaiheet ovat identtisiä seleenin liitäntävaiheiden kanssa, paitsi että Te-soo-lin absorptioarvo liittymistä varten on 1.0 ja MPA on 1 μΐ/ml Te-sooli.

Anti-fi-galaktosidaasitelluurikoettimen val- 15 mistuksen, puhdistuksen sekä konsentraation osalta ks. kohta (g) edellä. Nitroselluloosaliuskoihin muodostetaan täplät vuohi-anti-hiiri IgG , β-galaktosidaasin ja α-galaktosidaasin (ks. kohta (k) edellä) laimennossar-joista. Testitulokset on esitetty taulukossa 2.

20 (m) Anti-tomatiini IqG (askitesnesteestä) adsorptio kolloidiseen seleeniin ja koe immobilisoidulla tomatii-ni- ja solaniini- ‘konjuqaatilla

Menetelmävaiheet ovat edellä esitetyn kohdan (j) mukaisia. Parametrit ovat: optimi pH: 7.5; MPA = 25 1.8 μΐ/ml sooli.

Täplät voidaan muodostaa koeliuskoille ainoastaan tomatiinin tai solaniinin ja Keyhole Limpett Hae-mocyanine (KLH) kantajanproteiinin konjugaatin avulla. Anti-tomatiini IgG on ristireaktiivinen solaniinin 30 kanssa.

Koetulokset on esitetty taulukossa 2.

(n) Anti-tomatiini IqG (askitesnesteestä) adsorptio kolloidiseen telluuriin ja koe immobilisoidulla KLH-tomatiinilla 35 Eri menetelmävaiheet konsentraatioriippuvan adsorptioisotermin saamiseksi on kuvattu edellä kohdassa (1) ja näitä voidaan suoraan soveltaa askiitista * . m

II

29 93904 saatavaan anti-tomatiini IgG.

Parametrit ovat: optimi pH: 7.5; MPA = 1 μΐ/ml sooli.

Liittämisvaihe on edellä kuvatun kohdan (g) 5 mukainen.

Nitroselluloosaliuskoille (ks. kohta (e) edellä) muodostettiin täplät KLH-tomatiinistä (1500 ng - 2.0 pg), KLH-solaniinista (1500 ng - 2.0 pg) ja vuohi-anti-hiirestä (1280 ng - 2.5 ng).

10 Koetulokset on esitetty taulukossa 2.

(o) Puhdistetun (proteiini A pylväs) monoklonaalisen anti-qamma-interferonin (MD-2) adsorbtio kolloidiseen seleeniin ja koe immobilisoidulla vuohi-anti-hiiri IgG

1. Optimi stabiloivan MD-2 konsentraation 15 (MPA) ja optimiliittymis-pH määritys

Konsentraatiosta riippuva adsorptioisotermi osoittaa, että MPA MD-2:lie on 22 jjg per ml sooli (pH 7.4). Tässä konsentraatiossa tehtiin pH-riippuva adsorptioisotermi. Optimiliittymis-pH on välillä 20 8.0 - 9.0.

2. MD-2-leimatun seleenisoolin valmistaminen Parametrit: 1100 μg MD-2 per 50 ml Se-sooli, pH 8.5; O.D. 550 e = 0.5.

Puhdistus ja konsentrointi suoritetaan edellä 25 esitetyn kohdan (d) mukaisesti.

Nitroselluloosaliuskoille (ks. kohta (e) edellä) muodostetaan täplät vuohi-anti-hiiri IgG laimen-nossarjasta (1280 ng - 2.5 pg).

Koetulokset on esitetty taulukossa 2.

30 (p) Streptavidiinin adsorptio kolloidiseen seleeniin ja koe immobilisoidulla biotiinikonjugaatilla ____ Parametrit: 12.5 μg streptavidiini ml sooli; pH: 6.5.

Puhdistus jne. ks. kohta (d) edellä.

35 Nitroselluloosaliuskoille muodostetaan täplät biotinyloidun hiiren monoklonaalisen anti-gamma-inter-feroni IgG ja ei-biotinyloidun hiiren monoklonaalisen 30 93904 anti-gamma-interferonin negatiivisen kontrollin laimen-nossarjoista.

Koetulokset ks. taulukko 2.

• « w «. · m

II

31 93904

Taulukko 1:

Proteiinin G ja proteiinin A reaktiivisuus eri laji-luokkien ja -alaluokkien kanssa

Sitoutuminen (neutraali pH)

5 Laji Ig (ala)luokka Proteiini G Proteiini A

Ihminen igGl +++ +++

IgG2 +++ +++

IgG3 +++ +/-

IgG4 +++ +++ 10 IgA . +/-

IgM . +

IgD

Hiiri IgGl ++ +/-

IgG2a ++ ++ 15 IgG2b ++ ++

IgG3 +++ ++

IgA ?

IgM ? +/-

Rotta IgGl ? +/- 20 IgG2a +++ +/-

IgG2b ++ +/-

IgG2c ++ +

IgM ? +/-

Vuohi Ig +++ +/- 25 Lammas Ig ++

Marsu Ig + ++

Kaniini Ig +++ +++

Koira Ig + ++

Lehmä Ig +++ ++ 30 Kana Ig +/- +/-

Sika Ig ++ +++

Hevonen Ig +++ +++ vahva sitoutuminen ++ hyväksyttävä sitoutuminen + heikko sitoutuminen +/- erittäin heikko sitoutuminen -35 ei sitoudu ? ei tietoa 32 93904

TAULUKKO 2 KOETULOKSET

Erilaisille seleeni-, telluuri- ja Si02~liitetyille 5 koettimille määritetyt alemmat visuaaliset havaintorajat : sooli liitetty täplät havainto- muodostettu raja 10 1. Seleeni proteiini A kaniini IgG 1.5 ng 2. Seleeni anti-fi-gal vuohi-anti-hiiri 80 pg (20 pg+Ag) 3. Seleeni anti-O-gal β-galaktosidaasi 20 ng 4. Seleeni anti-tomatiini* KLH-tomatiini 240 pg 15 5. Seleeni anti-tomatiini* KLH-solaniini 240 pg 6. Seleeni streptavidiini biotinyloitu 160 ng MD-2 7. Seleeni MD-2 vuohi-anti-hiiri 2.5 ng 8. Telluuri proteiini A kaniini IgG 1.5 ng 20 (600 pg+Ag) 9. Telluuri anti-fl-gal fl-galaktosidaasi 20 ng 10. Telluuri anti-tomatiini KLH-tomatiini 1.5 ng 11. RITC/SiOz hiiri IgG vuohi-anti-hiiri 40 ng monoklonaalinen 25 *:anti-tomatiini IgG (askitesnesteestä) on ristireak- ·. tiivinen solaniinin kanssa KLH: Keyhole Limpett Carrier Protein (keskimääräinen molekyylipaino 5,500,000).

MD-2: anti-gamma-interferonivasta-aine (hiiri monok-30 lonaalinen, puhdistettu proteiini A pylväällä) Määrityksissä käytetyt kontrollit olivat negatiivisia j* (tai positiivisia silloin, kun niiden piti teorian mukaan olla).

Havaintoraja määritettiin kokeilla, joissa havainnointi 35 suoritettiin paljain silmin.

♦ • · «

Claims (10)

1. 33 93904
2. 1. Menetelmä spesifisesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisen reaktion yhden tai 5 useamman komponentin määrittämiseksi koenäytteestä, jossa reaktiossa käytetään hyväksi tällaisten komponenttien ja ainakin yhden leimatun komponentin keskinäistä reaktiivisuuta, joka leimattu komponentti on saatu liittämällä tai adsorboimalla leiman soolipartik-10 kelit suoraan tai epäsuorasti komponenttiin, ja jossa menetelmässä reaktion aikana tai reaktion loputtua, valinnaisesti sidotun ja vapaan leimatun komponentin erotuksen jälkeen, määritetään mainitusta koenäyttees-tä, tai erotuksen jälkeen saadusta yhdestä fraktiosta, 15 leiman läsnäolo ja/tai määrä sellaisella menetelmällä, jolla määritettävä komponentti on osoitettavissa kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti, tunnettu siitä, että leimaamiseen käytetään epämetallisen alkuaineen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu alku-20 aineseleeni, alkuainetelluuri, alkuainerikki, alkuaine-fosfori, alkuainehiili ja alkuainepii, tai tällaisen epämetallisen alkuaineen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen soolia.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, : 25 tunnettu siitä, että leimattu komponentti val- ‘ mistetaan lisäämällä epämetallin tai sen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen sooliin leimattavaa komponenttia ennalta määrätty määrä, joka viimeksi mainittu komponentti ympäröi soolipartikkelit täy-30 dellisesti tai osittain, jonka jälkeen, valinnaisesti, soolipartikkeleiden ympäröinti täydennetään inertillä •« : polaarisella makromolekyylillä.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimattu komponentti val- 35 mistetaan lisäämällä epämetallin tai sen metallia sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen sooliin yhtä tai : useampaa inerttiä hydrofiilistä makromolekyyliä ympä- 34 93904 röimään epämetallipartikkeleita, jonka jälkeen komponentti liitetään ympäröivään materiaaliin adsorption tai kovalenttisten sidosten avulla.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että leimattu yhdiste valmistetaan saattamalla epämetallin tai sen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen sooli monomeeriväli-aineeseen, jolloin mainitut monomeerit polymeroituvat tai kopolymeroituvat in situ siten, että tapahtuu epä- 10 metallin tai sen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen soolipartikkeleiden ympäröinti, jonka jälkeen komponentti adsorboidaan tai liitetään kova-lenttisesti polymeerimateriaaliin.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että epämetallin tai sen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen soolipar-tikkelit suojataan ensin hydrofiilisillä makromolekyyleillä, jonka jälkeen suoritetaan (ko)polymerointi epäorgaanisen initiaattorin avulla.
7. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritettä- vä/määritettävät komponentti/komponentit koostuu/koos-tuvat yhdestä tai useammasta reseptoriproteiinista ja/tai antigeenisistä determinanteista, jotka sijait-: 25 sevat solujen pinnalla. * 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritettä- vä/määritettävät komponentti/komponentit koostuu/koos-tuvat yhdestä tai useammasta immunologisesta komponen-30 tista, kuten hapteeneista, antigeeneistä tai vasta- aineista, jotka ovat läsnä vesipitoisessa näyteliuok-sessa.
8. 8. Menetelmä spesifisesti sitovan proteiinin ja vastaavan sidottavan aineen välisessä reaktiossa 35 käytetyn leimatun komponentin valmistamiseksi, jossa menetelmässä leiman soolipartikkelit liitetään tai ·· adsorboidaan suoraan tai epäsuorasti komponenttiin, II 35 93904 tunnettu siitä, että leimaamiseen käytetään epämetallisen alkuaineen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu alkuaineseleeni, alkuainetelluuri, alkuainerik-ki, alkuainefosfori, alkuainehiili ja alkuainepii, tai 5 tällaisen epämetallisen alkuaineen metalleja sisältämättömän epäorgaanisen yhdisteen soolia.
9. 9. Koepakkaus käytettäväksi immunokomponentin määritykseen vesipitoisesta näyteliuoksesta tunnettu siitä, että pakkaus sisältää 10 (a) leimatun immunokomponentin, jossa leimana on epä metallisen alkuaineen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu alkuaineseleeni, alkuainetelluuri, alkuainerik-ki, alkuainefosfori, alkuainehiili ja alkuainepii, tai tällaisen epämetallisen alkuaineen metalleja sisältä- 15 mättämän epäorgaanisen yhdisteen soolipartikkeleita, ja (b) muita reagenssejä.
10. 10. Leimattu materiaali, joka koostuu immuno-komponentista, esim. immunoglobuliinista, proteiinista, hapteenista tai muusta makromolekulaarisesta orgaani- 20 sesta materiaalista, kuten DNA, RNA, jossa leimana on epämetallisen alkuaineen, joka valitaan ryhmästä, johon kuuluu alkuaineseleeni, alkuainetelluuri, alkuainerik-ki, alkuainefosfori, alkuainehiili ja alkuainepii, tai tällaisen epämetallisen alkuaineen metalleja sisältä-: 25 mättömän epäorgaanisen yhdisteen soolipartikkeleita t 36 93904