JPS62116263A - 直線偏光の多重散乱を用いる免疫反応の測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原−抗体反応に塞く免疫反応を、微粒子に
よる多重散乱光を利用して測定する方法および装置に関
するも′のである。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の測定法として免疫反応の特巽的選択反応を利用した
免疫分析法があり、大別Ｊると酵素や放射性アイソトー
プを標識物質として用いる標識免疫分析法と、抗原・抗
体複合体を直接測定する非標識免疫分析法の２方法がよ
く知られている。

前者の標識免疫分析法としてはラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＴＡ）、螢光免疫分析（Ｆ
ＩＡ＞等がよく知られており、高感度であるがアイソト
ープの取り扱い、廃棄物処理等の種々の制限があり、又
測定に長時間を要づ−るうえに標識試薬が高価であるた
め検査］スｌ−が高い等の欠点がある。

後者の非標識免疫分析法には免疫電気泳動法、免疫拡散
法、沈降法等があり、簡便な分析法であるが感度、定量
性、再現性の点で精密測定としては不充分である。この
ような免疫分析法に関しては「臨床検査法提要」　（金
井泉原著、金井正光編著、金原出版）や、［臨床検査Ｊ
Ｖｏβ、２２゜Ｎｏ　、５　（１９７８）、第４７１〜
４８７頁に詳しくＭ１明されている。

また、ｒ　Ｔ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｖＪ　、　
Ｖｏ　Ｉｔ　、　１２゜Ｎｏ、４　（１９７５）、第３
４９〜３５１頁には、抗体または抗原を表面に担持させ
た粒子を抗原または抗体と反応させ、凝集粒子の大きさ
に比例して減少するブラウン運動の指標となる平均拡散
定数を、レーザ光の散乱光のスペクトル幅の変化から求
めることにより抗原または抗体を定量分析する３一 方法が開示されている。この分析方法では標識試薬を用
いない利点はあるが、粒子のブラウン運動によるドツプ
ラ効宋によって入射光のスペクトル幅ラ 装置が大形で高価となる欠点があると共に分光Ｍを機械
的に駆動する際に誤差が生じ、精度および再現性が悪く
なる欠点がある。また、この方法では光のスペクトル幅
から平均拡散定数を求めているだけであり、情報量が少
ないという欠点もある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述したように従来の免疫分析方法では、高価な標識試
薬を用いるため分析のランニングコストが高価となると
共に液体の取扱いおよび処理が面倒となったり、処理時
間が長くなる欠点があったり、高価で人形な分光計を必
要とすると共に精度や再現性も悪く、得られる情報量も
少ないという欠点があった。

本発明の目的は、直線偏光された光が微粒子により多重
散乱を受けると、散乱光の偏光状態が抗原−抗体反応と
密接な関係にあることを利用して抗原−抗体反応を測定
することにより、上述した従来の欠点を除去し、高価な
標識試薬や高価でかつ大形な分光側を用いずに、高い精
度および再現性をＬスって順次の試料の測定を能率良く
行なうことができ、しかも測定時間の短縮、抗原−抗体
反応測定の自動化が可能であると共に抗原−抗体反応に
ついて多くの有用な情報を得ることができる免疫反応測
定方法およびこのような方法を実施する装置を提供しよ
うとするものである。

〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明の免
疫反応測定方法は、少なくとも抗原および抗体を含む抗
原−抗体反応液に直線偏光された輻射線を投射し、抗原
−抗体反応により生成される微粒子による多重散乱光ま
たは反応液に加えた抗体または抗原を固定した微粒子の
抗原−抗体反応によって生ずる多重散乱光を前記直線偏
光された輻射線の偏光方向とは異なる偏光方向を有する
検光子を介して検知し、この検知出力に基いて抗原−抗
体反応を測定することを特徴とするものである。

さらに本発明は、少なくども抗原および抗体を含む反応
液に光を投射し、抗原−抗体反応により生成されるｍ粒
子による散乱光または反応液に加えた抗体または抗原を
固定した微粒子の抗原−抗体反応によって生ずる散乱光
を検知し、この検知出力の強度ゆらぎのパワースペクト
ル密度に基いて抗原−抗体反応を測定する装置において
、前記抗原−抗体反応液を収容するセルと、直線偏光さ
れた光を前記セルに入射させる光源装置と、 前記セルからの多重散乱光を、前記直線偏光された光の
偏光方向と直交する偏光方向を有する検光子を介して受
光する光検出装置ｄと、この光検出装置からの出力信号
を受け、その強度ゆらぎのパワースペクトル密度を求め
、それに基いて抗原−抗体反応を測定する手段とを貝え
ることを特徴とするものである。

第１図は本発明による免疫反応測定方法の基本的構成を
示す概念図である。光源１から放射される光をコリメー
タレンズ２により集光した後、偏光子３を経てセル４に
投射する。セル４内には試料中の測定すべき抗原または
抗体と特異的に抗原−抗体反応を起こす抗体または抗原
を表面に固相化したコロイド微粒子と試料とを混合した
反応液５を収容する。直線偏光された光は反応液５中の
微粒子により多重散乱されるが、その多重散乱光の偏光
状態は微粒子の凝集状態に応じて変化することになる。

互いに凝集していない微粒子は球形であるため、直線偏
光された入射光の電磁波の電場ベクトルの振動方向と同
一方向に分極する。

したがって微粒子による１回の散乱光はそのまま直線偏
光されたものとなる。しかし、本発明では多重散乱さ口
るため、散乱光が再び粒子によって散乱されるので、多
重散乱光の偏光状態は粒子が球形であっても変化するこ
とになる。一方、抗原−抗体反応が起こり、微粒子が互
いに凝集すると、粒子塊は球形とはならなくなるから光
学的に異方性を呈することになり、多重散乱光の偏光状
態は変化する。この場合の多重散乱光の偏光状態は、粒
子が球形の場合の多重散乱光の偏向状態とは有意の差が
あることを確認した。したがって多重散乱光をレンズ６
にＪ：り集光した後、偏光子３の偏光方向に対して異仕
る偏光方向を有する検光子７を経て光検出器８に入射さ
せると、その出力は反応液５中の微粒子の凝集状態すな
わち抗原−抗体反応の状態に応じて変化することになり
、この光検出器８の出力の変化を検出することにより免
疫反応を測定することができる。

一方、反応液中の微粒子はブラウン運動によりランダム
に運動しているため光検出器の出力強度はゆらいでいる
。一方、微粒子が凝集すると、その大きさや形状による
並進運動や回転運動が生じ、ブラウン運動が変化するの
で強度ゆらぎのパワースペクトル密度が変化する。この
変化は抗原−抗体反応に応じたものとなる。すなわち、
凝集した微粒子が散乱体積内をブラウン運動によって動
くことによる散乱光の強度ゆらぎ、また粒子の回転運動
による散乱光の強度ゆらぎのパワースペクトル密度は変
化する。このようにして微粒子のゆらぎによる散乱光強
度のパワースペクｉ・ル密度の変＝８− 化を検出して免疫反応を測定することができる。

上述した本発明の免疫反応測定方法においては、抗原−
抗体反応の結果として生成される微粒子または抗体また
は抗原を表面に固定した微粒子に直線偏光された光を入
射させると多重散乱光の偏光状態が微粒子の形状や大き
さに依存することに着目し、多重散乱光を入射光の偏光
方向とは異なる偏光方向を有する検光子を経て検知する
ことにより抗原−抗体反応の有無、抗原または抗体のＴ
ｌ、抗原−抗体反応による微粒子の凝集状態（粒径分布
）などの多くの有用な情報を得ることができる。

このように本発明では散乱光を光検出器で受光し、その
出力信号の変化を検知するものであるから、高価な標識
試薬を用いる必要はないと共に散乱光のスペクトル分析
を行なうものではないので大形で高価な分光計を用いる
必要もなく、高感度かつ再現性高く短時間で抗原−抗体
反応に関する多くの有用なデータを１ｑることかできる
。

また、本発明では多重散乱光を用いるため、ノイズの影
響は著しく軽減され、例えば試料中に不可避的に存在覆
るゴミ等の異物による影響を殆んど受けずに測定ができ
るので、試料の前処理が著しく簡単となる。さらに、こ
のようにＳ／Ｎが高くなるので、抗原または抗体温度が
低い場合でも短時間でかつ高感度で測定を行なうことが
できる。

〔実施例〕

第２図は本発明による免疫反応測定装置の一実施例の構
成を示す線図である。本例においては、コヒーレント光
を放出する光源として波長６３２．８ｎｉｌのＨｅ−Ｎ
ｅガスレー１ｒ１１を設置Ｊる。コヒーレント光を放射
する光源どしては、このにうなガスレーザの伯に半導体
レーザのような固体レーザ“を用いることもできる。光
源１１から放射されるレーザ光束１２を半透鏡１３によ
り光束１４と光束１５とに分離する。一方の光束１４を
集光レンズ１６により集光した後、例えばグラン１−ム
ソンプリズムより成る偏光子１１に通して直線偏光され
た光として、透明なセル１８に投射する。他方の光束１
５をシリコンフォトダイオードより成る光検出器１９に
入射させ、光源１１の出力光強度の変動を表わすモニタ
信号に変換する。

セル１８の中には、表面に抗体または抗原を結合した球
状の微粒子、例えば表面に免疫グロブリンＧ（ＩｑＧ＞
を固定したポリスチレンラテックス粒子を分散させた緩
衝液と、抗原または抗体を含む被検液との混合物である
抗原−抗体反応液２０を収容４る。したがってセル１８
中で抗原−抗体反応が起こり、微粒子間に相互作用が生
ずると、微粒子が相互に付着するため、多重散乱光の偏
光状態が変化するとともにブラウン運動の状態が変化す
ることになる。セル１８中の微粒子によって多重散乱さ
れた多重散乱光を、一対のピンホールを有するコリメー
タ２１に入射させ、前記偏光子１７の偏光面ど直交する
偏光面を有する検光子２２を経て光電子増倍管より成る
光検出器２３に入射させる。光検出器１９の出力モニタ
信号は低雑音増幅器２４を経てデータ処理装置２５に供
給する。また、光検出器２３の出力信号を低雑音増幅器
２６８よび低域通過フィルタ２１を経てデータ処理装置
２５に供給する。データ処理袋Ｎ２５では後述するよう
な信号処理を行ない、抗原−抗体反応の測定結束を出力
する。この測定結果は表示装置２８に供給して表示する
。検光子２２と光検出器２３との間にレンズ、ミラー、
プリズム等の光学素子を配置すると、検光子を透過した
光がさらに影響を受けるので測定誤差となる恐れがある
。したがって、本実施例のように検光子２２の出力を直
接光検出器２３に入射させるようにするのが好適である
。また、セル１８にキズ等があると偏光状態が変化する
ので好ましくない。

セル１８中には、表面に抗体または抗原を固定した球状
の微粒子を含む反応液２０が収容されているが、本発明
ではこのようなセル１８に直線偏光された光束を入射さ
せて多重散乱させる。今、Ｉｏを入射光強度、Ｉｓを散
乱光強度、ｐをセル１８の光軸方向に測った長さく光路
長）およびαを減衰定数とすると、一般にｌ５＝Ｉｏｅ
ＸＤ　　（Ｊ２／α）が成立する。ここで平均散乱回数
は上式のβ／αで与えられるので、本発明では！／α〉
１なる条件を満定するように粒子濃度および光路長を設
定する。この条件を満すようにすればセル１８を透過す
る散乱光は２重散乱以上の多重散乱光であると考えられ
る。このような多重散乱を用いると、粒子が球形ｅあっ
ても、すなわち抗原−抗体反応が行なわれず、粒子が凝
集しない場合でも散乱光が再び粒子に当って散乱される
ので散乱光の偏光状態は変化し、多重散乱光の一部は検
光子２２を通過することになる。勿論、抗原−抗体反応
が起こり、粒子が凝集すると散乱光の偏光状態は変化す
る。

この場合、多重散乱光の偏光状態は粒子の凝集状態と有
意な関係があることが確認されているので、多重散乱光
を検出することにより凝集の有無や凝集の程度などを検
出することができ、これから抗原または抗体の濃度を知
ることができる。また、多重散乱光の平均散乱回数は２
程度とするのが特に好適であることを実験により確めた
。すなわち、１〈β／α〈２とするのが特に好適である
。

すなわち、多重散乱光の偏光状態は凝集の程度によって
左右されるので、例えば光検出器２３の出力の平均値を
求めることにより試料中の抗原の定量を行なうことがで
きる。さらに、凝集した粒子は散乱体積内をブラウン運
動したり、回転したりすることになるが、これにより散
乱光の強度はゆらぐことになり、この強度ゆらぎのパワ
ースペクト密度を求めることにより凝集の程瘍を知るこ
とかできる。

第３図は第２図に示した］リメータ２１の詳細な構成を
示す図である。本例のコリメータ２１は空洞構造となっ
ており、空洞２１ａは外光の影響を除くために＠箱構造
となっており、その内面は反射防止構造となっている。

空胴２１ａの前後にはピンホール２１ｂおよび２１ｃを
形成する。今、これらピンホール２１ｂおよび２１ｃの
半径をそれぞれａｌおよびａ２．ピンホール間の距離を
し、空胴２１ａの内部媒体の屈折率を０．波長をλどす
るとさ、次式（１）を満足するように構成する。

４ｎ　ａｌ　ａ２ し≧ λ　　　　　　　・・・（１） 本発明の一実施例では、散乱光の強度ゆらぎのパワース
ペクトル密度を検出するが、このパワースペクトル密度
は、微粒子が波長程度の距離を拡散してゆくことによる
干渉成分のゆらぎによる項と、散乱体積への微粒子の出
入りによって生ずる粒子数のゆらぎによる項とから成っ
ている。この内、干渉による散乱光のゆらぎはスペック
ルパターンの空間的なゆらぎとして観測されるが、これ
をそのまま広い受光面を持った光検出器２６に入射させ
ると、受光面の面積に亘って空間的な平滑化が行なわれ
るので、検出されるゆらぎは小さくなってしまう。そこ
で上述したようなピンホールを有する］リメータ２１を
用いて光検出器２３の視野を限定することにより、ゆら
ぎを高感度で検出することができるようになる。本実施
例では上式（１）を満足させるには、空調２１ａ内の媒
体は屈折率０−１の空気で十分実用的である。すなわち
、直径０．３ｎ＋ｍのピンホール２１ｂ　、　２１ｃを
３０ＣＩＲ１ＩＬ、たコリメータ２１を用いれば上式（
１）は満足されることになる。

上述した実施例においては、セル１８に入射する光束１
４の方向と、コリメータ２１の光軸方向とを一致させ、
入射光束の一部を直接光検出器２３に入射させるヘテロ
ダイン法としたが、これらの方向を例えば４５°とし、
入射光束が直接光検出器２３に入射しないホモダイン法
を採用することもできる。

すなわち、本発明においては、第４図に示すようにセル
１８への入射光束１４とコリメータ２１の光軸との成す
角度θは任意にとることができる。ここでホモダイン的
に散乱光を検出する場合には、光電子増倍管より成る光
検出器２３の出力信号は、散乱光の電界強度をＥｓとづ
ると、その自乗の平均値Ｅζに比例したものとなり、散
乱光と入射光とを併わせて検出するヘテロダイン的検出
の場合には、直接の入射光の電界強度をＥｅとすると、
光検出器２３の出力信号は、 （Ｅｅ　十Ｅｓ　）　２−ＥＭ　＋２Ｅｅ−Ｅｓ　＋Ｅ
Ｍとなる。ここでＥｅはゆらぎがない（もしあったとし
ても散乱光のゆらぎに比べて緩つくりしている）ので、
光検出器２３の出力の変動成分は殆んど第２項Ｅｅ−Ｅ
ｓに等しい。つまり、散乱光の電界強度Ｅｓにほぼ比例
した出力信号が得られることになる。

また、コリメータ２１も上述した構成に限定されるもの
ではなく、光検出器２３の視野を１スペツクルパターン
以下に制限できるものであれば任意の構成とすることが
できる。

上述した装置を用い、光検出器２３の出力信号を低域通
過フィルタ２１を経てデータ処理装置２５へ供給し、光
検出器１９からのモニタ信号と共に処理をして散乱光の
強度ゆらぎのパワースペクトル密度を求めた結宋を次に
説明する。ここで定常確立過程×（［）のパワースペク
トル密度５（ｆ）は、次のように表わすことができる。

この（２）式をもとに高速フーリエ変換を用いてパワー
スペクトル密度の計算を行なう。すなわち、光検出器２
３からの出力信号を低雑音増幅器２６により、データ５
１１１理装置１２５におけるＡ／Ｄ変換の量子化レベル
を信号の値域ができるだけ広くおおうように増幅し、こ
の量子化したデータをマイクロプロセッサによって演算
処理してパワースペクトル密度を求める。このようにし
て求めたパワースペクトル帯電から後述するようにして
免疫反応の進行状況を求め、表示装置２８で数値的に表
示する。

本発明においては、このように多重散乱光の強度ゆらぎ
のパワースペクトル密度の変化から抗原−抗体反応を測
定する他に多重散乱光の強度そのものの変化から抗原−
抗体反応を測定することもでき、この場合にはデータ処
理装置ではフーリエ変換等の処理が不要となるので、短
時間で測定結束を得ることができる。

第５図は上述した装置を用い、抗原−抗体反応の前後に
おける多重散乱光の強度比を求めたものであり、試料抗
原としてアルファ・フェト・プロティンを用い、粒子と
して表面に抗体を感作させたものを４，４５　ｘ　１０
”　ｌ１ｌｉｌ／ｃｊの濃度で混入させた。

すなわち、多重散乱光の強ｔα比Ｐは、Ｐ＝反応直Ｉ散
乱光強度 反応前の散乱光強度 として求めたものでり、ここで反応直後とは反応開始後
３０秒経過したときの測定値である。このときの測定デ
ータを表１に示す。このデータは測定を数回性なってそ
れらの平均値をとったものである。

表１ 第５図から明らかなように、多重散乱光強度の反応前後
の比Ｐの値は抗原濃度がＩＱ−ｌｅｇ　／　ｉｌｌλか
ら１０−６０　／　ＩＩＩβまで変化するのに応じて徐
々に減少している。したがって、この比Ｐの値と抗原濃
度との関係を表わす検量線を予め求めておけば比Ｐの値
を求めることによって抗原濃度を測定することができる
。このＪ：うに多重散乱光強度の反応前後の比を求める
場合には反発後短時間で測定を行なうことができ、試料
の処理能力が著しく高くなる。勿論、反応後の多重散乱
光の強度は反応量始直後だけに限られるものではなく、
例えば数分後または数十分後の値を求めることもできる
。

次に多重散乱光の強度ゆらぎのパワースペクトル密度の
変化から抗原−抗体反応を測定する方法を説明する。こ
の方法には、相対ゆらぎ比を求める方法と、紐引周波数
の比を求める方法とがあるが、最初に相対ゆらぎ比を求
める方法について説明する。

第６図は、アルファ・フェルト・プロティンを１．３５
×１０−６ｇ／Ｉｌ１℃の濃度で含む試料に抗体を感作
したテラックス粒子を４，４５　ｘｌＯ”個／ｄの濃度
で混入した検波をセル１８に収容した場合に得られるパ
ワースペクトル密度を正規化して示したものであり、曲
線Ａは反応開始前のパワースペクトル密度を示し、曲線
Ｂは反応開始後１５分経過したときのパワースペクトル
密度を示すものである。

第６図に示すようにパワースペクトル密度は反応の前後
において大きく変化している。

光検出器２３の出力を増幅し、例えばカットオフ周波数
が１００Ｈｚの低域通過フィルタに通した後、データ処
理装置２５に供給する。このデータ処理装置にはＡ／Ｄ
変換器を設け、ディジタル信号に変換し、これを演算装
置に供給する。Ａ／Ｄ変換したディジタル値１ｓ＋　　
（ｆ　＝１．２．・・・Ｎ）から平均強同Ｉ　ｓを求め
る。すなわち、 より平均強度Ｉｓを求める。この場合相対ゆらぎγは、 から求めることかできる。この相対ゆらぎの反応前後に
おける比、 反応前の相対ゆらぎ を求めると、表２のようなデータが得られる。このデー
タも一１二連したところと同様にアルファ・フェ］・・
プロチンを試料とし、抗体感作ラテックスヲ４．４５　
ｘｌＯ”個／Ｃ＋♂の濃度で混入したもので、抗原導入
直後と、抗原導入後５分および３０分後の相対ゆらぎの
比を示寸ものである。

表２ 第７図は上述したデータに基いて作成した抗原濃度と相
対ゆらぎ比との関係を示すグラフであり、抗原濃度の増
大とともに相対ゆらぎ比が大きくなっている。したがっ
て、漕庶既知の標準試料を用いてこのような検品線を予
め作成しておけば、相対ゆらぎ比Ｑの値を求めることに
より試料中の未知抗原濃度を求めることができる。

第８図は、種々の抗原ｍ＋ｕにおける反応時間と相対ゆ
らぎ比との関係を示すグラフであり、この場合にはテラ
ックス粒子濃度は７．４１　ｘｌｏ”個／ｄとした。こ
のグラフから明らかなように反応開始後、はぼ５分経過
した後は相対ゆらぎ比はほぼ飽和値に達するのでこの時
点でエンドポイント法による測定を行なうことができる
ことがわかる。

また、反応開始後、相対ゆらぎ比はほぼ直線的に増大し
ているので、この間においてレイトアッセイ法による測
定を行なうこともできる。

第９図は抗原濃度と、反応５分後、１０分後および１５
分後の相対ゆらぎ比との関係を示すグラフであり、その
データを下記の表３に示す。本例では試別としてＣ−反
応性蛋白（ＣＲＰ）を用いたものである。

表　　３ 次に多重散乱光の強度ゆらぎのパワースペクトル密度の
緩和周波数の比から抗原−抗体反応を測定づる方法につ
いて説明する。第１０図ＡおよびＢは反応開始前および
後のパワースペクトル密Ｉ′ｆＳ（ｆ）を示すグラフで
あり、それぞれ成る特定の周波数において屈曲しており
、この屈曲点近傍の周波数ｒｒ　＋およびｆｒ２は反応
前後においてシフトしている。このように屈曲点の周波
数がシフトするのは、微粒子のブラウン運動が並進運動
の変化して表わることに基因するものであると推測され
る。また、この屈曲点の周波数のシフトは抗原−抗体反
応の程度、例えば抗原ＩＩ葭に応じて変化している。し
たがって、この屈曲点の周波数である緩和周波数の反応
前後における比Ｒ１Ｒ−反応後の緩和周波数 反応前の緩和周波数 を求めることにより抗原濃度を測定することができる。

第１１図は試別としてアルファ・フェト・プロティンを
用い、抗体感作ラテックス粒子を４．４５　ｘｌｏ”個
／　ｃＪの濃度で混入した場合の、反応前の緩和周波数
と反応後の緩和周波数との比Ｒと抗原濃度との関係を示
したものであり、そのデータを表４に示す。

表４ 第１１図から明らかなように抗原濃度の増大とともに反
応前後の緩和周波数の比はほぼ直線的に減少しており、
きわめて高い感度で抗原濃度を測定することができる。

一ト述したようにパワースペクトル密度の反応前後にお
ける緩和周波数の比から抗原濃度を測定することができ
るが、この緩和周波数を求める方法としては、 （１）方程式を用い、これに測定値を代入して求める方
法、 （２）第１２図に示づようにパワースペクトル密度の水
平部および傾斜部にそれぞれについて近似直線を求め、
これら近似直線の交点から３ｄＢ低下したところの周波
数として求める方法、（３）第１３図に示すように屈曲
部の曲率半径ｒが最小となる位置から３ｄＢ低下したと
ころの周波数を求める方法などがあるが、以下これにつ
いて説明する。

先ず、（１）の方程式を用いて緩和周波数を求める方法
について説明する。パワースペクトル密度を両対数グラ
フで描くと第１４図に示すようになる。第１４図におい
て、傾斜部Ｆを表わす方程式は次のようになる。

ｌｏｇ　Ｖ　＝Ａ／ｅＸｌｌ　　（ｘ　−ｘ　ｐ　）　
　・（３）ただし、×は周波数、×Ｐは屈曲点の周波数
、Ａは平坦部（ホワイト・レベル）の値、■はパワース
ペクトル密ｉｓ　（ｆ　）で・ある。したがって、この
式に基いて実測データから屈曲点の周波数×Ｐを求める
ことにより緩和周波数「１を求めることができる。

第１５図は一卜述した演算を行なって緩和周波数「ｒを
求める工程を示すフローチャートである。

先ずアナログ吊として与えられる測定データをＡ１０変
換し、得られるディジタル値ＸＩ、Ｘ２・・・×Ｐ・・
・×Ｎを順次に比較し、数個または土数個の所定数のデ
ータが連続して減少したとき最初に低下し始めたデータ
の１つ前のデータを以って屈曲／Ｐを算出し、これをＳ
とする。ざらにＸｐ〜×Ｎまでのデータの移動平均をと
る。この移動平均は、例えば異なる３点の移動平均Ｘは
、として求められるような値である。次に最小自乗法に
より近似直線を算出した後、（３）式に１点または２〜
３点のデータを代入してαの値を棹出し、この算出した
値αを（３）式に代入し、この式においてＶ＝Ａ、／２
としてＸを求める。このようにして求められた×の値を
緩和周波数［ｒとしで出力する。

第１６図は上式した（２）の方法により緩和周波数を求
める順次の工程を示すフローチャートである。この方式
では、測定データをＡ／ｎ変換した後、高速フーリエ変
換器に供給してパワースペクトル密度を求める。これは
Ｍ１７図Ａに示すように小さな変動分を多く含んでいる
。次にこれをフーリエ変換し第１７図Ｂに示すような信
号を得る。さらに、これを周波数ｆｃ以下の信号を通す
ディジタルフィルタより成るローパスフィルタに通した
後、逆フーリエ変換を施すと第１１図Ｃに示すように滑
らかなパワースペクトル密度が得られる。このような前
処理を行なった後、上述した方法（１）〜×Ｎのデーを
用いて移動平均をとり、最小自乗法により近似直線を締
出した後、Ｓ／２を算出し、この算出したＳ／２に対応
するデータ×１を求め、この×１を緩和周波数［ｒとし
て出力する。なお、上述した（１）および（２）の方法
において、−２８＝ ×１〜×Ｐの平均値Ｓはホワイトレベルの値を求めるも
のであり、最小自乗法により算出した近似直線は、傾斜
部の近似直線である。

本発明により緩和周波数を求める方法は上述した実施例
に限定されるものではなく、その他の方法も可能である
。例えば上述した例では、パワースペクトル密度が平坦
となるホワイトレベルから３ｄＢ低下するところの周波
数を緩和周波数と定義したが、屈曲点の周波数ｆＰその
ものを緩和周波数とすることもできる。さらに、第１８
図に示すように、平坦部の近似直線と、傾斜部の近似直
線との交点を示す周波数ｆｃを緩和周波数としたり、こ
れよりも３ｄｌｌ低下したところの周波数「ｅを緩和周
波数とすることもできる。さらに、屈曲点の周波数ｆＰ
を求めるに当って、実測データ×１〜ｘＮを１個ずつ順
番に比較しないで、数個置きのデータを比較してもよい
。また、（１）の方法において、実測データをＡ／Ｄ変
換した後、一度移動平均を求めてデータ列をある程度滑
らかにした後、屈曲点の周波数Ｘｐを求めてもよい。

本発明は上述した実施例にのみ限定されるものではなく
、幾多の変形や変更が可能である。上述した説明は免疫
グロブリンＧ　（１（ｌ　Ｇ　）について例示したが、
免疫グロブリンＡ（ＴｏＡ）。

１（ＩＭ、Ｉ（］　Ｄ、Ｉ（ｌ　Ｆ、オースト−７１，
Ｊ　７抗原、梅毒抗原、インシュリンなど抗原−抗体反
応によって凝集を生ずるすべての物質の測定に適用する
ことができる。また、上述した実施例では、微粒子の表
面に抗体を固定して、被検体中の抗原を検出するように
したが、微粒子の表面に抗原を固定し、被検体中の抗体
を検出することもできる。さらに、上述した実施例では
微粒子としてポリスチレンラテックス粒子を用いたが他
の有機物粒子や、ガラスなどの無機物粒子を用いること
もできる。

ざらに上述した実施例では抗原−抗体反応液の中には最
初から微粒子を存在させたが、このような微粒子を用い
ずに、抗原−抗体反応の結果として生ずる微粒子状生成
物による散乱光を利用することもできる。このような抗
原−抗体反応の実施例としては、抗原としてヒト絨毛ゴ
ナドトロピン（１−（ＣＧ　）を用い、抗体として抗ヒ
ト絨毛ゴナドトロピン（抗ＨＣＧ）を用いる反応があり
、この反応により生成される抗原−抗体複合体は微粒子
として扱うことができる。さらに抗原そのものを粒子と
して用いることもできる。このような抗原−抗体反応と
しては抗原としてカンディダ・アルピノ」ンス（酵母）
を用い、抗体として抗カンディダ・アルビカンスを用い
る例や、他に血球、細胞、微生物などを粒子として用い
ることもできる。また第１図および第２図に示す実施例
では抗原−抗体反応液をセルに収容して測定を行なうバ
ッチ方式としたが、抗原−抗体反応液を連続的に流しな
がら測定を行なうフロ一方式とすることも勿論可能であ
る。

さらに上述した実施例では、抗原としてコヒーレントな
光を放射するレーザ光源を用いたが、インコヒーレント
な光を放射する光源を用いることもできる。

（発明の効果） 上述した本発明の効果を要約すると以下の通りである。

（１）酵素ヤラジＡアイソ１ヘープのような標識試薬の
ような高価で、取扱いの面倒な試薬を用いる必要がない
ので、安価かつ容易に実施することができる。

（２）免疫電気泳動法、免疫拡散法、沈Ｒ法などの非標
識免疫分析法に比べ精度が高く、再現性が高いので信頼
性の高い測定結果を高精度で得ることができる。

（３）直線偏光の多重散乱を用いるため、ノイズ等に影
響されずに高感度の検出を行なうことができ、したがっ
て超微量の被検体で高精度の測定ができると共に測定時
間も短時間となり、さらに試料の前処理も簡単となる。

（４）平均拡散定数を散乱光のスペクトル幅の変化から
求めることにより抗原または抗体を定量する方法に比べ
分光計が不要であるので装置は小形かつ安価となると共
に精度および信頼性の高い測定結果が得られる。

（５）光ゆらぎのパワースペクトル密度に基いて測定を
行なう場合には、抗原−抗体反応についての多くの有用
な情報を得ることができる。

（６）特に多重散乱光の強度変化に基いて測定を行なう
場合には信号処理が簡単となり、短時間での測定が可能
となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による免疫反応測定方法の基本的構成お
よび作用を示す概念図、 第２図は本発明の免疫反応測定装置の一実施例の要部の
構成を示す線図、 第３図は同じくそのコリメータの詳細な構成を示す線図
、 第４図は本発明の免疫反応測定装置の他の実施例の構成
を示す線図、 第５図は反応前後における多重散乱光の強度比と抗原濃
度との関係を示すグラフ、 第６図は反応前後における多重散乱光強度ゆらぎのパワ
ースペクトル密度を示すグラフ、第７図は反応前後にお
ける相対ゆらぎ比と抗原′ｍ麿との関係を示すグラフ、 第８図は反応前後における相対ゆらぎ比と反応時間との
関係を抗原濃度をパラメータとして示すグラフ、 第９図は反応前後の相対ゆらぎ比と抗原ｍ度との関係を
示すグラフ、 第１０図ＡおよびＢは反応前後におけるパワースペクト
ル密度の緩和周波数の変化を示すグラフ、第１１図は反
応前後における緩和周波数の比と抗原濃度との関係を示
すグラフ、 第１２図、第１３図および第１４図は緩和周波数の求め
方を説明するためのグラフ、 第１５図は緩和周波数を求める一方法の順次の工程を示
すフローチャー１・、 第１６図は緩和周波数を求める他の方法の順次の工程を
示すフローチ１−−１−１ 第１７図Ａ、ｌ’３およびＣはパワースペクトル密度曲
線を滑らかとする方法を説明づるためのグラフ、第１８
図は緩和周波数を求めるさらに他の方法を説明するため
のグラフである。 １・・・光源　　　　　　２・・・レンズ３・・・偏光
子　　　　　４・・・セル５・・・反応液　　　　　６
・・・レンズ７・・・検光子　　　　　８・・・光検出
器１１・・・レーザ光源　　　１７・・・偏光子１８・
・・セル　　　　　　２０川反応液２１・・・コリメー
タ　　　２２・・・検光子２３・・・光検出器　　　　
２５・・・データ処理装置２６・・・低雑音増幅器　　
２１・・・低域通過フィルタ２８・・・表示装置 第３図 良 封 が 第４図　　　　　Σ 姦 遣− 第５図 第 Ａ １７図 フーリエ変Ｊ象イ麦 ｆ、　　　　　ｆｆ 第１８図 ｆ、ｆ、子

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも抗原および抗体を含む反応液に直線偏光
   された輻射線を投射し、抗原−抗体反応により生成され
   る微粒子による多重散乱光または反応液に加えた抗体ま
   たは抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によって生
   ずる多重散乱光を前記輻射線の偏光方向とは異なる偏光
   方向を有する検光子を介して検知し、この検知出力に基
   いて抗原−抗体反応を測定することを特徴とする免疫反
   応の測定方法。 ２、前記多重散乱光の平均散乱回数を２とすることを特
   徴とする特許請求の範囲１記載の免疫反応の測定方法。 ３、抗原−抗体反応による、前記検知出力の強度の変化
   に基いて抗原−抗体反応を測定することを特徴とする特
   許請求の範囲１記載の免疫反応測定方法。 ４、抗原−抗体反応による、前記検知出力の強度ゆらぎ
   のパワースペクトル密度の変化に基いて抗原−抗体反応
   を測定することを特徴とする特許請求の範囲１記載の免
   疫反応測定方法。 ５、少なくとも抗原および抗体を含む反応液に光を投射
   し、抗原−抗体反応により生成される微粒子による散乱
   光または反応液に加えた抗体または抗原を固定した微粒
   子の抗原−抗体反応によって生ずる散乱光を検知し、こ
   の検知出力の強度ゆらぎのパワースペクトル密度に基い
   て抗原−抗体反応を測定する装置において、 前記抗原−抗体反応を行なう反応液を収容 するセルと、 直線偏光された光を前記セルに入射させる 光源装置と、 前記セルからの多重散乱光を、前記直線偏 光された光の偏光方向と直交する偏光方向を有する検光
   子を介して受光する光検出装置と、この光検出装置から
   の出力信号を受け、そ の強度ゆらぎのパワースペクトル密度を求め、それに基
   いて抗原−抗体反応を測定する手段とを具えることを特
   徴とする直線偏光を用いる免疫反応測定装置。