JPS61173139A - 光強度ゆらぎによる免疫反応測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、抗原−抗体反応に基く免疫反応を、微粒子に
よる散乱光の強度ゆらぎを利用して測定する方法に関す
るものである。

（従来技術） 免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の測定法として免疫反応の特異的選択反応を利用した
免疫分析法があり、大別すると酵素や放射性アイソトー
プを標識物質として用いる標識免疫分析法と、抗原・抗
体複合体を直接測定する非標識免疫分析法との２つの方
法がよ（知られている。

前者の標識免疫分析法としてはラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）、酵母免疫分析（ＥＩＡ）、螢光免疫分析（Ｆ
ＩＡ）等がよく知られており、高感度であるがアイソト
ープの取り扱い、廃棄物処理等の種々の制限があり、ま
た測定に長時間を要するうえに標識試薬が高価であるた
め検査コストが高い等の欠点がある。

後者の非標識免疫分析法には免疫電気泳動法、免疫拡散
法、沈降法等があり、簡便な分析法であるが感度、定量
法、再現性の点で精密測定としては不充分であるととも
に測定時間が長くなる欠点がある。このような免疫分析
法に関しては「臨床検査法提要」（金井泉原著、金井正
光編著、金属出版）や、「臨床検査Ｊ　Ｖｏｌ、２２．
Ｎｏ　５（１９７Ｂ）、第４７１〜４８７頁に詳しく説
明されている。

また％　　ｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　Ｊ　
＋Ｖｏ１．１２＋Ｎｏ　４（１９７５）、第３４９〜３
５１頁には、抗体または抗原を表面に担持させた粒子を
被測定液中の抗原または抗体と反応させ、凝集粒子の大
きさに比例して減少するブラウン運動の指標となる平均
拡散定数を、レーザ光の散乱光のスペクトル幅の変化か
ら求めることにより抗原または抗体を定量分析する方法
が開示されている。この分析方法では標識試薬を用いな
い利点はあるが、粒子のブラウン運動によるドツプラ効
果によって入射光のスペクトルが広がるのを分光計を用
いて検出しているため、装置が大形で高価となる欠点が
あると共に分光計を機械的に駆動する際に誤差が生じ、
精度および再現性が悪くなる欠点がある。また、この方
法では光のスペクトル幅から平均拡散定数を求めている
だけであり、情報量が少ないという欠点もある。

上述したように従来の免疫分析方法では、高価な標識試
薬を用いるため分析のランニングコストが高価上なると
共に液体の取扱いおよび処理が面倒となったり、処理時
間か長くなる欠点があったり、高価で大形な分光計を必
要とすると共に精度や再現性も悪く、得られる情報量も
少ないという欠点があった。

このような欠点を克服するために、微粒子による散乱光
の強度ゆらぎが抗原−抗体反応と密接な関係にあること
を利用して抗原−抗体反応を測定することにより、高価
な標識試薬や高価でかつ大形な分光計を用いずに、高い
精度および再現性を以って測定を行なうことができ、し
かも測定時間の短縮、抗原−抗体反応測定の自動化が可
能であると共に抗原−抗体反応について多くの有用な情
報を得ることができる免疫反応測定方法が特願昭５９−
１４８８７８号において提案されている。

この免疫反応測定方法は、少な（とも抗原および抗体を
含む抗原−抗体反応液にコヒーレントまたはインコヒー
レントな輻射線を投射し、抗原−抗体反応により生成さ
れる微粒子による散乱光または反応液に加えた抗体また
は抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によって生ず
る散乱光をホモダイン的にまたはヘテロダイン的に検知
し、この検知出力の強度ゆらぎのパワースペクトル密度
に基いて抗原−抗体反応を測定するものである。

このような免疫反応測定方法においては、抗原−抗体反
応の結果として生成される微粒子による散乱光または抗
体または抗原を表面に固定した微粒子の抗原−抗体反応
によって生ずる散乱光の強度が、光の干渉によりゆらぐ
ため、この強度ゆらぎのパワースペクトル密度に粒子の
形状や大きさの依存性があることに着目し、強度ゆらぎ
のパワースペクトル密度を検知することにより抗原−抗
体反応の有無、抗原または抗体の定量、抗原−抗体反応
による微粒子の凝集状Ｂ（粒径分布）などの多くの有用
な情報を得ることができる。また、散乱光を光検出器で
受光し、その出力信号強度のゆらぎを検知するものであ
るから、標識試薬を用いる必要はないと共に散乱光のベ
クトル分析を行なうものではないので分光計を用いる必
要もない。

具体的に抗体または抗原濃度を検出する方法としては、
散乱光をホモダイン的に検知し、その強度ゆらぎのパワ
ースペクトル密度の緩和周波数が粒子の大きさに依存す
ることを利用して、抗原−抗体反応の前後における緩和
周波数の比を求め、この比の値から抗原−抗体反応を測
定する方法が提案されている。

上述した光強度ゆらぎによる免疫反応測定方法では、反
応セルに向けて投射した輻射線の入射光方向に対して直
角に光検出器を配置してホモダイン的に散乱光を検知し
ている。しかしながら、散乱光強度は入射光強度に比べ
微弱であり、光検出器のノイズ等に影響され易いため、
入射光方向に対して直角に光検出器を配置する構成では
光検出器の出力信号のＳ／Ｎ比が悪い欠点があった。従
って、特に低い抗原（抗体）濃度では測定精度が悪＜　
、１０−”ｇ／Ｊ以下の濃度では信頼性に欠ける不都合
が生じていた。一方、試料の少量化や処理速度の向上を
図るため、最初の分析操作では１０−”ｇ／ａ＋１以下
の濃度で分析する場合が多く、検知出力信号のＳ／Ｎ比
を向上させることが強く要請されている。

（発明の目的） 本発明の目的は上述した欠点を除去し、抗原−抗体反応
により生成される微粒子による散乱光または反応液に加
えた抗原または抗体を固定した微粒子の抗原−抗体反応
によって生ずる散乱光を大きな強度で検知でき、従って
低い抗原または抗体濃度でもＳ／Ｎ比の高い検知出力信
号を得ることができ、これにより高い精度で測定できる
光強度ゆらぎによる免疫反応測定方法を提供しようとす
るものである。

（発明の概要） 本発明は、抗原および抗体を含む反応液に輻射線を投射
し、反応液中の微粒子による散乱光を検知し、この検知
出力の強度ゆらぎのパワースペクトル密度に基いて抗原
−抗体反応を測定するに当たり、輻射線の入射光方向に
対してほぼ４５°の角度をなすように配置した検知手段
により散乱光を検知することを特徴とするものである。

（実施例） 第１図は本発明の免疫反応測定方法を実施する装置の一
実施例の構成を示す図である０本例においては、コヒー
レント光を放出する光源として波長６３２．８ｎｍのＨ
ｅ−Ｎｅガスレーザ１を設ける。コヒーレント光を放射
する光源としては、このようなガスレーザの他に半導体
レーザのような固体レーザを用いることもできる。また
、本発明の方法ではインコヒーレントな光を放射する光
源を用いることもできる。光源１から放射されるレーザ
光束２を半透鏡３により光束４と光束５とに分離する。

一方の光束４を集光レンズ６により集光して、透明な円
筒セルフに放射し、その内部の１点に集束させる。他方
の光束５をシリコンフォトダイオードより成る光検出器
８に入射させ、光源１の出力光強度の変動を表すモニタ
信号に変換する。

セルフの中には、表面に抗体または抗原を結合した微粒
子９を分散させた緩衝液と、抗原または抗体を含む被検
液との混合物である抗原−抗体反応液を収容する。した
がってセルフ中で抗原−抗体反応が起こり″、微粒子間
に相互作用が生ずると、微粒子が相互に付着するため、
ブラウン運動の状態が変化することになる。セルフ中の
微粒子９によって散乱された散乱光を、一対のピンホー
ルを有するコリメータ１０を経て光電子増倍管より成る
光検出器１１に入射させる。

本発明ではコリメータ１０及び光検出器１１をセルフに
入射する光束４の入射光方向に対して４５″の角度をな
すように配置する。抗原−抗体反応により生成される微
粒子や抗原または抗体を固定した微粒子９からの散乱光
はＭｉｅ散乱に該当し、セルフに入射する光束４の入射
光方向に対して４５°の方向に強度が最大の散乱光が放
射される。したがって、本発明のようにコリメータ１０
及び光検出器１１を光束４の入射光方向に対して４５″
の角度に配置すれば、最大強度の散乱光を受光でき、光
検出器１１からＳ／Ｎ比の高い検知出力信号を得ること
ができる。特に、入射光方向に対して４５″の角度方向
には入射光がほとんど到達しないため、微粒子９からの
散乱光だけを受光できる。

コリメータ１０は空胴構造となっており、外光の影響を
除くために暗箱構造となっており、その内面は反射防止
処理が施されている。空胴の前後にはピンホールを形成
する。光検出器８の出力モニタ信号は低雑音増幅器１３
を経てデータ処理装置１４に供給する。また、光検出器
１１の出力信号を低雑音増幅器１５および低域通過フィ
ルタ１６を経てデータ処理装置１４に供給する。データ
処理装置１４にはＡ／Ｄ変換器１７、高速フーリエ変換
部１８および演算処理部１９を設け、後述するような信
号処理を行い、抗原−抗体反応の測定結果を出力する。

この測定結果は表示装置２０に供給して表示する。

セルフからの散乱光強度は、光検出器８からの光源強度
モニタ信号の短時間平均値出力によって規格化され、光
源から放射されるレーザ光強度の変動を除去した後、高
速フーリエ変換部１８に供給され、散乱光の強度ゆらぎ
のパワースペクトル密度が求められ、後述するようにこ
のパワースペクトル密度の緩和周波数を求め、これに基
づいてセルフ中での微粒子９の凝集状態、したがって抗
原−抗体反応の進行状態の測定を行う。

本発明では、上述したように散乱光の強度ゆらぎのパワ
ースペクトル密度を検出するが、このパワースペクトル
密度は、微粒子が波長程度の距離を拡散してゆくことに
よる干渉成分のゆらぎによる項と、散乱体積への微粒子
の出入りによって生ずる粒子数のゆらぎによる項とから
成っている。

この内、干渉による散乱光のゆらぎはスペックルパター
ンの空間的なゆらぎとして観測されるが、これをそのま
ま広い受光面を持った光検出器１１に入射させると、受
光面の面積に亘って空間的な平滑化が行われるので、検
出されるゆらぎは小さくなってしまう。そこで所定の寸
法のピンホールを有するコリメータ１０を用いて光検出
器１１の視野を限定することにより、ゆらぎを高感度で
検出することができるようになる。

上述した実施例においては、円筒状セルフを用い円筒セ
ルフに入射する光束４の方向と、コリメータ１０の光軸
とを４５″′の角度をなすように構成したが、第２図に
示すよう断面が直角二等辺三角形の角柱体のセルを用い
、直角二等辺三角形の底辺をなす面７ａに垂直に光束４
を入射させ、面７ａと４５″の角度をなす面７ｂの垂直
方向にコリメータ１０を配置する構成とすることもでき
る。このように構成すれば、最大強度の散乱光がセルの
側壁に垂直に入射するからセルフの側壁での反射を回避
でき散乱光を効率よく受光することができる。

また、入射光が微粒子９と衝突するまでの距離が短くな
ると共に微粒子９からの散乱光がセルを脱出するまでの
距離が短くなり、散乱光を効率よく外部に取り出すこと
ができる。

また、コリメータ１０も上述した構成に限定されるもの
ではなく、光検出器１１の視野を１スペツクルパターン
以下に制限できるものであれば任意の構成とすることが
できる。

上述した装置を用い、光検出器１１の出力信号を低域通
過フィルタ１６を経てデータ処理装置１４へ供給し、光
検出器８からのモニタ信号と共に処理をして散乱光の強
度ゆらぎのパワースペクトル密度を求めた結果を次に説
明する。ここで定常確立過程Ｘ（ｔ）のパワースペクト
ル密度Ｓ　（ｆ）は、次のように表すことができる。

この式をもとに高速フーリエ変換を用いてパワースペク
トル密度の計算を行う。すなわち、光検出器１１からの
出力信号を低雑音増幅器１５により、データ処理装置１
４におけるＡ／Ｄ変換の量子化レベルを信号の値域がで
きるだけ広（おおうように増幅し、この量子化したデー
タをマイクロプロセッサによって演算処理してパワース
ペクトル密度を求めた。本発明ではこのようにして求め
たパワースペクトル密度から統計学的手法により緩和周
波数を求め、免疫反応の前後における緩和周波数の比を
求め、この比により抗体または抗原濃度を求め、これを
表示装置２０で数値的に表示する。

第３図は、粒径が０．１μＩの抗体感作ラテックス粒子
を分散させた液に５　Ｘｌ０−’ｇ／　ｓｉｔの抗原（
ＣＲＰ）を加える前後におけるパワースペクトル密度の
変化を示すものである。両曲線ともローレンツ型パワー
スペクトル密度を表すものであり、散乱光の強度ゆらぎ
のパワースペクトル密度の内、干渉効果によるものであ
る。免疫反応前後におけるパワースペクトル密度の緩和
周波数ｆ□およびｆｒｔは微粒子の直径に反比例するこ
とがわかる。

すなわち、散乱光の強度ゆらぎは上述したように微粒子
の運動に基づくコヒーレント光の干渉による成分と、散
乱体積内の粒子数の変動による成分と、散乱体積内の粒
子数の変動による成分との合成されたものとなるが、本
実施例では干渉成分が主として検出されており、パワー
スペクトル密度の緩和周波数は粒子が光の波長の距離を
移動する時間の逆数となるので、免疫反応による凝集が
進んで粒径が等価的に大きくなると移動時間は長くなり
、緩和周波数ｆ、、２が減少することになる。

第３図から明らかなようにパワースペクトル密度はロー
レンツ型となっていることがわかる。上述したように、
散乱光の強度ゆらぎは粒子のブラウン運動による干渉性
成分と、散乱体積内の粒子数の変化による非干渉性成分
との和になるが、散乱体積内の粒子数が少な（なり、干
渉性成分が少なくなって、非干渉性成分と同程度となる
と、粒子のブラウン運動による散乱光強度変化以外の成
分も検出してしまい、抗原−抗体反応を精度よく検出す
ることはできなくなる。したがって、粒子の濃度は、散
乱体積内での入射光強度が十分得られる程度に低く、か
つ干渉性成分が非干渉性成分よりも大きくなるような範
囲に選ぶ必要がある。

第４図および第５図は、直径０．３μｍのラテックス粒
子の表面に免疫グロブリンＧの抗体を固定したものを、
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでＰＨ７に調整した緩衝液に分離させ
たものに、抗原として１０−’ｇ／　ｌ１ｉｔおよび１
０−９ｇ／　ｍｊ！の濃度の免疫グロブリンＧを加えた
抗原−抗体反応液をセルに収容し、抗原−抗体反応の開
始前と開始後（１５分後）のパワースペクトル密度を示
すものである。第４図に示す抗原濃度１０−’ｇ／　ｍ
ｊ！の場合には、反応前の緩和周波数が約５０Ｈｚであ
るのに対し、反応１５分後の緩和周波数が１０Ｈｚに変
化している。これに対し、抗原濃度が１０−９ｇ／　ｔ
ａｌｌの場合には、反応開始前の緩和周波数は約９５Ｈ
２で、反応後の緩和周波数は約４０Ｈｚとなっている。

したがって、抗原−抗体反応前後の緩和周波数の比Ｆを
、 と定義し、この値を幾つかの抗原濃度について求めてグ
ラフに示すと第６図に示すようになる。すなわち、第６
図において横軸は抗原濃度をとり、縦軸は緩和周波数の
比Ｆの値をとって示すものであるが、緩和周波数の比Ｆ
を求めることにより抗原濃度を検出することができる。

一方、第４図および第５図において、抗原−抗体反応の
前後における相対ゆらぎの比（Ｒ）が抗原濃度と一定の
関係を有することもわかる。次にこのことについて説明
する。第１図において、光検出器１１によって散乱光を
変換した電気信号を以下に示すような伝達関数を有する
低域通過フィルタに通す。

ｆ、。

ここにｆｃは低域通過フィルタのカットオフ周波数であ
り、緩和周波数ｆ１よりも十分低い周波数とする。この
とき、低域通過フィルタの出力とし　　。

て得られる電流Ｉのゆらぎのパリアンスは、（δ　Ｉ”
　　＞　　＝Ｋ”　　　＜Ｎ＞　　＋Ｋ”　　ｆｃ　　
／ｆ、・−−−（４）となる。ただしＫは定数、＜Ｎ＞
は散乱体積中の平均粒子数である。したがって、低域通
過フィルタの出力電流の相対ゆうぎとして次式（５）が
成立する。

ここでγは比例定数である。ここで散乱体積中の粒子数
は十分に大きいとすると、（５）式は次のように書き直
すことができる。

したがって、パワースペクトル密度のグラフから緩和周
波数ｆ、を求めることにより相対ゆらぎを算出すること
ができる。このどき相対ゆらぎ比Ｒは次式で表すことが
できる。

この（７）′式により相対ゆらぎ比Ｒを求め、これと抗
原濃度との関係をグラフにして求めたのが第７図である
。このグラフより明らかなように、抗原−抗体反応前後
における相対ゆらぎの比Ｒを求めることにより未知の抗
原濃度を知ることができる。すなわち、測定に先立って
既知の異なる抗原濃度の標準サンプルについて相対ゆら
ぎ比Ｒを求めて第７図のように検量線を求めておき、未
知の抗原濃度の被検体について相対ゆらぎ比Ｒを求め、
先に求めた検量線に基づいて抗原濃度を知ることができ
る。

一方、（７）式による相対ゆらぎ比Ｒは第４図および第
５図に示すパワースペクトル密度の低周波数帯域におけ
る積分値の変化の比としても求めることができる。すな
わち、 に基づいて相対ゆらぎ比Ｒを求めることができる。

ここで抗原−抗体反応前のパワースペクトル密度の積分
値Ａおよび反応後の積分値Ｂは、１０−１〜１０１Ｈｚ
の低周波帯域における積分値である。したがって低域通
過フィルタは１０’Ｈｚ以下の周波数を通過するものと
する。

上述した例では第４図および第５図に示すようにパワー
スペクトル密度の低周波数における積分値ＡおよびＢの
比として相対ゆらぎ比Ｒを求めるようにしたが、低周波
領域における特定の周波数、例えば１０８２におけるパ
ワースペクトル密度のレベルの比から相対ゆらぎ比を求
めるようにしてもよい、このように周波数を特定すると
きには、高速フーリエ変換器の代わりにディジタルフィ
ルタを用いることができ、構成が簡単となると共に処理
時間も短くなる。

粒径が一定の場合にはパワースペクトル密度はローレン
ツ型であり、緩和周波数より大きい周波数においては周
波数の自乗に反比例して減少する。

ところが、粒径が分布している場合には、それぞれの粒
径に対応した緩和周波数を持ったローレンツ型スペクト
ルを重ね合わせたものが観測されるので高周波部分にお
けるパワースペクトル密度は最早や周波数の自乗に反比
例しなくなる。したがってこの部分の形状から逆に反応
によって凝集した粒子の粒径分布を知ることができる。

このようなデータは従来は得られなかったものであり、
抗原−抗体反応の状態を解析する上で有用な情報である
。

本発明は上述した実施例にのみ限定されるものではなく
、幾多の変形や変更が可能である。上述した説明は免疫
グロブリンＧ　（Ｉｇ　Ｇ）について例示したが、免疫
グロブリンＡ　（Ｉｇ　Ａ）、ｒｇ　Ｍ、　　ｉｇ　Ｄ
、　　Ｉｇ　Ｅ、オーストラリア抗原、梅毒抗原、イン
シュリンなど抗原−抗体反応によって凝集を生ずるすべ
ての物質の測定に適用することができる。また、上述し
た実施例では、微粒子の表面に抗体を固定して、被検体
中の抗原を検出するようにしたが、微粒子の表面に抗原
を固定し、被検体中の抗体を検出することもできる。さ
らに、上述した実施例では微粒子としてポリスチレンラ
テックス粒子を用いたが他の有機物粒子や、ガラスなど
の無機物粒子を用いることもできる。

さらに上述した実施例では抗原−抗体反応液の中には最
初から微粒子を存在させたが、このような微粒子を用い
ずに、抗原−抗体反応の結果として生ずる微粒子状生成
物による散乱光を利用することもできる。このような抗
原−抗体反応の実施例としては、抗原としてヒト絨毛ゴ
ナドトロピン（ＨＣＧ）を用い、抗体として抗ヒト絨毛
ゴナドトロピン（抗ＨＣＧ）を用いる反応があり、この
反応により生成される抗原−抗体複合体は微粒子として
扱うことができる。さらに抗原そのものを粒子として用
いることもできる。このような抗原−抗体反応としては
抗原としてカンディダ・アルビカンス（酵母）を用い、
抗体として抗カンディダ・アルビカンスを用いる例や、
他に血球、細胞１、微生物などを粒子として用いること
もできる。また第１図に示す実施例では抗原−抗体反応
液をセルに収容して測定を行うバッチ方式としたが、抗
原−抗体反応液を連続的に流しながら測定を行うフロ一
方式とすることも勿論可能である。

（発明の効果） 以上説明したように本発明によれば、散乱光を受光する
コリメータ及び光検出器を、セルに入射する光束の入射
方向に対してほぼ４５°の角度をなすように配置してい
るから最大強度の散乱光を受光することができ、光検出
器のノイズ等に影響されないＳ／Ｎ比の高い検知出力信
号を得ることができる。したがって、特に抗原（抗体）
濃度が低い場合でも信頼性の高い測定値を得ることがで
き、試料の少量化、装置の小型ｊヒ及び処理速度の向上
を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による免疫反応測定装置の一実施例の構
成を示す線図、 第２図は本発明の免疫反応測定装置の他の実施例の要部
の構成を示す線図、 第３図は粒径が０．１μ−の抗体感作ラテックス粒子を
分散させん液に５　Ｘｌ０−’ｇ／ｎ＋　ｊｔの抗原を
加える前後におけるパワースペクトル密度を示すグラフ
、 第４図および第５図はそれぞれ抗原濃度が１０−４ｇｅ
ｔｓ　Ｉｔおよび１０−’ｇ／１ｍ　Ｉｔに対する抗原
−抗体反応前および後のパワースペクトル密度を示すグ
ラフ、第６図は抗原濃度と緩和周波数の比との関係を示
すグラフ、 第７図は抗原濃度と相対ゆらぎ比との関係を示すグラフ
である。 １・・・レーザ光源　　　　２．４．５−・・光束３・
・・半透鏡　　　　　　６・・・集光レンズ７・・・セ
ル　　　　　　　８・・・光検出器９・・・微粒子　　
　　　　１０・・・コリメータ１１・・・光検出器　　
　　　１３．１５・・・低雑音増幅器１４・・・データ
処理装置　　１６・・・低域通過フィルタ２０・・・表
示装置 第２図 第３図 周波数ｆ　（Ｈｚ）　− 回灯中９き゛ｒ仁Ｒ−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、抗原および抗体を含む反応液に輻射線を投射し、反
   応液中の微粒子による散乱光を検知し、この検知出力の
   強度ゆらぎのパワースペクトル密度に基いて抗原−抗体
   反応を測定するに当たり、輻射線の入射光方向に対して
   ほぼ４５°の角度をなすように配置した検知手段により
   散乱光を検知することを特徴とする光強度ゆらぎによる
   免疫反応測定方法。