JPH02275361A - 免疫反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抗原抗体反応に基づく免疫反応を、微粒子
による散乱光強度ゆらぎを利用して測定する免疫反応の
測定方法に関する。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の測定方法として、免疫反応の特異的選択反応を利用
した免疫分析法があり、その代表的なものとして、酵素
や放射性アイソトープを標識物質として用いる標識免疫
分析法と、抗原抗体複合物を直接測定する非標識免疫分
析法との２つの方法がある。

前者の標識免疫分析法としては、ラジオイムノアッセイ
　（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、
フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）等が知られている。

しかし、これらの分析法は高感度であるが、測定に長時
間を要するうえに、標識物質が高価であるため、検査コ
ストが高くなる等の問題があり、また特にＲＩＡにおい
てはアイソトープの取扱い、廃棄物処理等の種々の制限
がある。

また、後者の非標識免疫分析法としては、免疫電気泳動
法、免疫拡散法、沈降法等が知られている。しかし、こ
れらの分析法は簡便であるが、怒度、定量性、再現性の
点で精密測定には適さないという問題がある。

なお、このような免疫分析法に関しては、「臨床検査法
提要」　（金井、泉原著、金井正光編著、金属出版）や
、「臨床検査Ｊ　Ｖｏｌ、　２２、Ｎｏ、　５　（１９
７８）、第４７１−４８７頁に詳しく説明されている。

上記の問題を解決するものとして、例えば特開昭６１−
２８８６６号公報には、抗体または抗原を表面に担持さ
せた粒子とサンプル中の抗原または抗体とを反応させ、
凝集粒子の大きさに比例して減少するブラウン運動の指
標となる緩和周波数を、レーザ光の散乱光強度ゆらぎの
パワースペクトルから求めて、サンプル中の抗原または
抗体を定量分析するようにした免疫反応の測定方法が開
示されている。しかし、この免疫反応の測定方法にあっ
ては、緩和周波数をパワースペクトル密度のグラフから
求めるようにしているため、これを正確に求めることが
難しいという問題がある。

このような問題を解決するものとして、本願人は特開昭
６１−９００４１号公報において、実測したスペクトル
データをローレンツ型パワースペクトルに対して最小２
乗法で回帰して緩和周波数を求めるようにしたものを、
また特開昭６１−１７５５４９号公報においてパワース
ペクトル密度の低周波数領域における平坦な部分（ホワ
イトレベル）から３ｄＢ低下した周波数を緩和周波数と
して求めるようにしたものを既に提案している。

〔発明が解決しようとする課題］ しかしながら、抗原抗体反応によって形成される粒子の
凝集塊は、反応の進行によって成長して種々の大きさと
なるために、散乱光強度ゆらぎのパワースペクトルは、
それぞれの粒子の存在確率に基づくローレンツ型パワー
スペクトルの重ね合わせとなり、低周波数領域ではホワ
イトレベルが平坦とならず傾きをもつようになると共に
、高周波数領域ではパワースペクトル密度が周波数の２
乗に比例して減少するローレンツ型とはならなくなる。

このため、特開昭６１−９００４１号公報におけるよう
に、実測したスペクトルデータをローレンツ型パワース
ペクトルに対して最小２乗法で回帰して緩和周波数を求
めるようにすると、パワースペクトルの変化に適合しな
くなり、緩和周波数を正確に決定できなくなるという問
題がある。また、特開昭６１−１７５５４９号公報にお
けるように、パワースペクトル密度の低周波数領域にお
けるホワイトレベルから３ｄＢ低下した周波数を緩和周
波数として求めるようにすると、ホワイトレベルが傾き
をもつために、同様に緩和周波数を正確に決定できな（
なるという問題がある。

この発明は、このような従来の問題点に着目してなされ
たもので、免疫反応を常に高精度で測定できる免疫反応
の測定方法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段および作用〕上記目的を達
成するため、この発明では抗原および抗体を含む反応液
に輻射線を投射し、抗原抗体反応により生成される複合
物からの散乱光を検出してそのパワースペクトルを求め
、このパワースペクトルの緩和周波数より高周波数頭域
における傾きを求めてその傾きに基づいて免疫反応を測
定する。

〔実施例〕

第１図はこの発明の免疫反応の測定方法を実施する測定
装置の一例の構成を示すものである。この例では、光源
１として波長６３２．８ｎｍのコヒーレント光を放射す
るｔ（ｅ−Ｎｅガスレーザを用いている。

コヒーレント光を放射する光源１としては、このような
ガスレーザの他に半導体レーザのような固体レーザを用
いることもできる。光源１から放射されるレーザ光束２
は、半透鏡３により光束４と光束５とに分離し、一方の
光束４を集光レンズ６により集光して透明なセルフに投
射させ、他方の光束５をシリコンフォトダイオードより
成る光検出器８に入射させて光源１の出力強度の変動を
表すモニタ信号に変換する。

セルフ内には、表面に抗体または抗原を結合した微粒子
９を分散させた緩衝液と、抗原または抗体を含む被検液
との混合物である抗原抗体反応液を収容する。したがっ
て、セルフ内では抗原抗体反応が起こり、微粒子間に相
互作用が生じたり、微粒子が相互に付着するためブラウ
ン運動の速度が変化することになる。

セルフ内の微粒子９によって散乱された散乱光は、一対
のピンホールを有するコリメータ１０を経て光電子増倍
管より成る光検出器１１に入射する。

コリメータ１０は、迷光の影響を除くために暗箱構造と
して、その内面には反射防止処理を施し、暗箱の前後に
ピンホールを形成する。

光検出器８の出力モニタ信号は、低雑音増幅器１２を経
てデータ処理装置１３に供給すると共に、光検出器１１
の出力信号は低雑音増幅器１４およびローパスフィルタ
１５を経てデータ処理装置１３に供給する。データ処理
装置１３には、Ａ／Ｄ変換部１６、高速フーリエ変換部
１７および演算処理部１８を設け、このデータ処理装置
１３において、光検出器１１の出力信号すなわちセルフ
からの散乱光強度を光検出器８からの光源強度モニタ信
号の短時間平均出力によって光源１から放射されるレー
ザ光強度の変動を除去して規格化した後、後述するよう
にしてその散乱光強度ゆらぎのパワースペクトルの緩和
周波数より高周波数領域における傾きを求め、その傾き
に基づいてセルフ内での微粒子９の凝集状態すなわち抗
原抗体反応を測定し、その測定結果を表示装置１９に供
給して表示させる。

第２図は第１図に示す測定装置によって得られる散乱光
強度ゆらぎのパワースペクトルの一例を示すものである
。この例では、直径０．２μｍのラテックス粒子の表面
に免疫グロブリンＥの抗体を結合したものを緩衝液に分
散させ、それに濃度１００ＩＵ／ｍｆの免疫グロブリン
Ｅを抗原として添加し、１５分間反応させたときの反応
前後のパワースペクトルを示す。反応前のラテックス粒
子による散乱光強度ゆらぎのパワースペクトルは、低周
波数領域でほぼフラット、高周波数領域では周波数の２
乗に比例して減少する典型的なローレンツ型のパワース
ペクトルＰ　＜ｒ、＝　ａ　／　（１＋（ｆ／ｆ、）”
）になっている。ここで、ｆは周波数、ｆ、は緩和周波
数、ａは低周波数領域でのホワイトレベル、Ｐ　（ｆ）
　　はｆでのパワースペクトル密度を表す。

これに対し、抗原抗体反応後では、抗原抗体反応により
種々の大きさのラテックス粒子が混合しているため、そ
のパワースペクトルは高周波数領域において周波数の２
乗に比例して減少するローレンツ型とはならない。そこ
で、この例では高周波数領域でのパワースペクトルの減
少は周波数のｍ（未知数）乗に比例するとして、実測し
たスペクトルデータに Ｐ　、ｒ、＝　ａ　／　（１＋（ｆ／ｆ、）”）を非線
型の最小２乗法により回帰して傾きｍを求め、その緩和
周波数よりも高周波数領域における傾きｍに基づいて抗
原抗体反応を測定する。

第３図は上記のようにして求めた抗原抗体反応後のパワ
ースペクトルの緩和周波数よりも高周波数領域における
傾きｍと抗原濃度との関係を示すものである。この例で
は、直径０．２μｍのラテックス粒子の表面に免疫グロ
ブリンＥの抗体を結合したものを緩衝液に分散させ、そ
れに濃度Ｏ〜１００１０／ｄの免疫グロブリンＥを抗原
として添加し、３００分間反応せたときの結果を示す。

第３図から明らかなように、パワースペクトルを非線型
の最小２乗法により適合させて、その緩和周波数よりも
高周波数領域における傾きｍを求めると、その傾きｍは
抗原濃度依存性を示し、抗原濃度が高くなるに従って傾
きｍが低下する。したがって、この例によれば、抗原１
ｇＢについて、抗原濃度０．１１１１／ｄ程度まで正確
に測定することができる。

なお、上記の例では抗原■ｇＥを測定するようにしたが
、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔ
ｉｇｅｎ）　、ｒｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｒｏｂｌｉｎ　
Ｇ）　、ＡＦＰ（ｃｒ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）やＣ
ＲＰ（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）等を測
定することもできるし、担体粒子に抗原を固定化してサ
ンプル中の抗体濃度を測定することもできる。また、こ
の発明は抗原抗体反応の測定に限らず、例えば溶液中の
高分子の物理的な測定や、大腸菌、精子等の生物の運動
の解析にも有効に適用することができるし、微粒子の粒
度分布をパワースペクトル密度により求める場合にも有
効に適用することができる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によれば、粒子の散乱光強
度ゆらぎのパワースペクトルの緩和周波数より高周波数
領域における傾きを求め、その傾きに基づいて測定すべ
き物質の量を決定するようにしたので、該物質の量を常
に高精度で測定することができる。また、上記のパワー
スペクトルの緩和周波数より高周波数領域での減少の傾
きは、粒子の分布状態と密接に関係しているので、その
傾きに基づいて高感度の免疫測定ができると共に、粒子
の分布状態も測定することができる。さらに、この発明
によれば、抗原抗体反応後の凝集複合物による散乱光強
度ゆらぎのパワースペクトル密度に良（適合するように
、近似曲線の傾きをパラメータとして変化させて傾きを
決定することができるので、実験結果に合致し、したが
って実験結果に忠実なカーブフィッテングが可能となる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の免疫反応測定方法を実施する装置の
一例の構成を示す図、 第２図は抗原抗体反応前後の散乱光強度ゆらぎのパワー
スペクトルを示ス図、 第３図はパワースペクトルの緩和周波数より高周波数領
域における傾きと抗原濃度との関係を示す図である。 １−・レーザ光源　　　２．４．５−・−光束３−・−
半透鏡　　　　　６−集光レンズ７−・−セル　　　　
　　８．１１−・−光検出器９−・微粒子　　　　　１
０ １２．１４−低雑音増幅器 １３−データ処理装置 １５・−ローパスフィルタ １６・−Ａ／Ｄ変換部 １８・・・演算処理部 １７−高速フーリエ変換部 １９−・−表示装置 コリメータ 特 許 出 願 人 オリンパス光学工業株式会社 第１図 第２図 用度数 ＣＨｚ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、抗原および抗体を含む反応液に輻射線を投射し、抗
   原抗体反応により生成される複合物からの散乱光を検出
   してそのパワースペクトルを求め、このパワースペクト
   ルの緩和周波数より高周波数領域における傾きを求めて
   その傾きに基づいて免疫反応を測定することを特徴とす
   る免疫反応の測定方法。