JPS62153760A - 免疫反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、抗原−抗体反応に基づく免疫反応の測定方法
、さらに詳しくいえば直線偏光を抗原−抗体反応液に投
射し、この偏光方向と異なる成分の光強度ゆらぎを用い
て免疫反応を測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の測定法として免疫反応の特異的選択反応を利用した
免疫分析法があり、大別すると酵素や放射性アイソトー
プを標識物質として用いる標識免疫分析法と、抗原・抗
体複合体を直接測定する非標識免疫分析法の２方法がよ
く知られている。

前者の標識免疫分析法としてはラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）、酵素免疫分析（Ｅ　Ｉ　Ａ）　。

螢光免疫分析（ＦＩＡ）等がよく知られており、高感度
であるがアイソトープの取り扱い、廃棄物処理等の種々
の制限があり、又測定に長時間を要するうえに標識試薬
が高価であるため検査コストが高い等の欠点がある。

後者の非標識免疫分析法には免疫電気泳動法、免疫拡散
法、沈降法等があり、簡便な分析法であるが感度、定量
性、再現性の点で精密測定としては不充分である。この
ような免疫分析法に関しては「臨床検査法捷要」　（金
井泉原著、金井正光編著、金属出版）や、「臨床検査」
Ｖ　ｏ　（！　、　２２．　＋　５　　（１９７８）　
、第４７１〜４８７真に詳しく説明されている。

また、ｒ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　＋　
　Ｖ　ｏ　ｊ２　、１２＋隘４　（１９７５）　、第３
４９〜３５１頁には、抗体または抗原を表面に担持させ
た粒子を抗原または抗体と反応させ、凝集粒子の大きさ
に比例して減少するブラウン運動の指標となる平均拡散
定数を、レーザ光の散乱光のスペクトル幅の変化から求
めることにより抗原または抗体を定量分析する方法が開
示されている。この分析方法では標識試薬を用いない利
点はあるが、粒子のブラウン運動によるドツプラ効果に
よって入射光のスペクトルが広がるのを分光計を用いて
検出しているため、装置が大形で高価となる欠点がある
と共に分光計を機械的に駆動する際に誤差が生じ、精度
および再現性が悪くなる欠点がある。また、この方法で
は光のスペクトル幅から平均拡散定数を求めているだけ
であり、情報量が少ないという欠点もある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述したように従来の免疫分析方法では、高価な標識試
薬を用いるため分析のランニングコストが高価となると
共に液体の取扱いおよび処理が面倒となったり、処理時
間が長くなる欠点があったり、高価で大形な分光計を必
要とする欠点があった。

本発明は、このような欠点を解決するため光強度ゆらぎ
を利用した新しい免疫反応の測定方法を提供する。

〔問題点を解決するための手段〕

発明者は光強度ゆらぎを用いて免疫反応について研究を
続けてきた。その結果、直線偏光を反応液に入射させ、
この反応液中で生じる散乱光の入射光と異なる偏光成分
を検知して抗原抗体反応を測定するに際し、反応液中の
抗体または抗原を固定化した感作不溶性担体の重！？Ｍ
度が測定感度に大きな影響を与えることを知見し本発明
を完成させるに至った。すなわち本発明は測定すべき抗
原または抗体を含む被検液と、この抗原または抗体と特
異的な抗体または抗原を感作した不溶性担体とを水性液
体媒体中、感作不溶性担体の濃度０．１〜１．０ｕ量％
で反応させ、この反応液に直線偏光された輻射線を投射
し、反応液中で生じる散乱光の輻射線の偏光方向と異な
る成分を検知し、この検知出力に基づいて抗原抗体反応
を測定することを特徴とする免疫反応の測定方法である
。

〔作　用〕

本発明において反応液中に存在させる感作不溶性担体の
量は、被検液と感作不溶性担体と水性液体媒体との和に
対して０．１〜１．０重量％から選べば良い。感作不溶
性担体の量が０．１重量％より少ない場合には濃度が薄
すぎて抗原抗体反応が起こりにくく、さらには迷光等の
雑音が増大するので好ましくない。逆に１．０重量％よ
り多い場合には３重散乱以上の多重散乱光が増大してし
まいゆらぎ量が平均化されるので好ましくない。

〔実施例〕

本発明の実施例を第２図〜第９図を用いて説明する。

直線偏光を球形粒子（例えばラテックス等）に入射させ
、入射光の偏光面に対して垂直な方向の偏光成分のみを
通過させる偏光子によって、粒子からの散乱光を検出す
る場合を考えてみることにする。

第２図（Ａ）、　（Ｂ）は単一散乱を説明するための図
である。

入射光１を偏光子２を通過して粒子３に入射させ、偏光
子２の偏光方向と垂直な方向の偏光成分のみを通過させ
る偏光子４を介して受光素子５で受光するよう装置を構
成する。

偏光子２を通過して矢印６の方向に直線偏光した入射光
１は粒子３に入射する。粒子に入射する光によって粒子
内に振動双極子が誘起される。粒子３が球形であれば、
粒子内の振動双極子の向きは入射光の電界ベクトルの方
向６と一敗することになる。従って球形粒子３に入射し
た入射光１による散乱光は矢印６で示す成分しか持たず
、それと直交する成分しか通過させない偏光子４によっ
てカントされるため受光素子５で検出することはできな
い。この時、受光素子５の出力は第２図（Ｂ）に示すよ
うに、主に迷光等の雑音によるものとなる。

球形粒子において粒子数密度があまり大きくなく、粒子
によって散乱された光が再び他の粒子に入射して、散乱
されることがないと考えると、粒子を含む懸濁液を通過
する散乱光の電界ヘクトルの振動成分は入射光の偏光方
向に一致する。このため受光素子の前方に入射光の偏光
方向に直交する偏光のみを通過させる偏光子を置くと、
散乱光は遮断される。この様な散乱は単一散乱（Ｓｉｎ
ｇｌｅ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）である。

ところが散乱光強度を増加させて検出感度を高めるため
に粒子の１度を増加すると、多重散乱光が受光素子に入
射するようになる。

第３図（Ａ）、　（Ｂ）は多重散乱を説明するための図
である。

第２図（Ａ）と同一の部分には同一の符号を付し、詳細
は省略する。矢印６方向に直線偏光した入射光１は粒子
３に入射し矢印７方向つまり入射光の偏光方向と異なる
成分を持つ散乱光となって粒子８に入射する。さらに粒
子８で散乱された２回目の光は矢印９方向の偏光成分を
有することになる。このため、偏光子４の後に置かれた
受光素子５に出力信号が表われる。すなわち受光素子５
の出力は第３図（Ｂ）に示すように、単一の個々の粒子
によって二重散乱（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎ
ｇ）された光の強度に対応している。三重散乱、四重散
乱についても同様に考えることができる。

第４図は本発明を実施する免疫反応測定装置の構成を示
す線図である。本例においては、コヒーレント光を放出
する光源として波長６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅガスν
−ザ１１を設ける。コヒーレント光を放射する光源とし
ては、このようなガスレーザの他に半導体レーザのよう
な固体レーザを用いることもできる。光源１１から放射
されるレーザ光束１２を半ｉ３鏡１３により光束１４と
光束１５とに分離する。一方の光束１４を集光レンズ１
６により集光した後、例えばグラントムソンプリズムよ
り成る偏光子１７に通して直線偏光された光として、透
明セル１８に投射する。他方の光束１５をシリコンフォ
トダイオードより成る光検出器１９に入射させ、光源１
１の出力光強度の変動を表わすモニタ信号に変換する。

セル１８の中には、表面に抗体または抗原を結合した球
状の微粒子、例えば表面に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
を固定したポリスチレンラテックス粒子を分散させた緩
衝液と、抗原または抗体を含む被検液との混合物である
抗原−抗体反応液２０を収容する。したがってセル１８
中で抗原−抗体反応が起こり、微粒子間に相互作用が生
ずると、微粒子が相互に付着するため、散乱光の偏光状
態が変化するとともにブラウン運動の状態が変化するこ
とになる。セル１８中の微粒子によって散乱された散乱
光を、一対のピンホールを有するコリメータ２１に入射
させ、前記偏光子１７の偏光面と直交する偏光面を有す
る検光子２２を経て光電子増倍管より成る光検出器２３
に入射させる。光検出器１９の出力モニタ信号は低雑音
増幅器２４を経てデータ処理装置２５に供給する。また
、光検出器２３の出力信号を低雑音増幅器２６および低
域通過フィルタ２７を経てデータ処理装置２５に供給す
る。データ処理装置２５では後述するような信号処理を
行ない、抗原−抗体反応の測定結果を出力する。この測
定結果は表示装置２８に供給して表示する。検光子２２
と光検出器２３との間にレンズ、ミラー、プリズム等の
光学素子を配置すると、検光子を透過した光がさらに影
響を受けるので測定誤差となる恐れがある。したがって
、本実施例のように検光子２２の出力を直接光検出器２
３に入射させるようにするのが好適である。また、セル
１８にキズ等があると偏光状態が変化するので好ましく
ない。

セル１８中には、表面に抗体または抗原を固定した球状
の微粒子を含む反応液２０が収容されているが、本実施
例ではこのようなセル１８に直線偏光された光束を入射
させて微粒子による散乱光を検出する。

今、ラテックス粒子のみが水などの緩衝液中に懸濁して
いる場合について粒子数濃度と散乱光強度との関係を考
えてみる。球形粒子による多重散乱光は直接偏光で入射
する光に対して直交偏光成分を持つ。二重散乱の場合、
直線偏光で入射する光に対する散乱光の直交偏光成分の
強度は粒子数の２乗に比例する。つまり、ＩｖＭｃｃＮ
”−ｅｘｐ　（−（Ｘｌ　・−（１１ここで、ＩＶＨ・
・・垂直偏光入射、水平偏光検出による散乱光強度、 Ｎ・・・・・・粒子数、 α・・・・・・減衰定数、 ！・・・・・・光路長、である。

直径０．２１２μＩのラテックスを光路長１２　＝　１
　ｍのガラス製セル中に懸濁させて、単位体積当りの粒
子数と散乱光強度の直交偏光成分の平方根の関係を第５
図に示す。

第５図において、横軸はラテックス粒子数（ＸＩＯ”／
ａｄ）を表わし、縦軸は散乱光強度の直交偏光成分の平
方根を表わす。また縦軸は（１）式の減衰項で補正した
。図中、実験値を実線で表示した。点線は（１１式より
求めた二重散乱光の直交偏光成分の平方根の理論値を表
示した。

点線で表わした範囲内の粒子数で二重散乱になっている
ものと考えられる。それ以上の粒子数では三重散乱以上
の多重散乱が表われている。

散乱光の強度ゆらぎを測定する方法として相対ゆらぎを
導入する。

相対ゆらぎは、第４図に示した装置で求めることができ
る。

相対ゆらぎの求め方としては２通りある。

第１の方法は、光検出器２３の出力を増幅し、例えばカ
ットオフ周波数が１００１１ｚの低域通過フィルタ２７
に通した後、データ処理装置２５に供給する。このデー
タ処理装置にはＡ／Ｄ変換器を設け、ディジタル信号に
変換し、これを演算装置に供給する。所定のサンプリン
グレートでＮ個のＡ／Ｄ変換したディジタル値ｌ５ｉ（
ｉ＝１゜２．３．・・・Ｎ）から平均強度すを求める。

へ より平均強度ｎを求める。この場合相対ゆらぎγは、 〈　■　〉： で定義されるから、 から求めることができる。

第２の方法は、光検出器２３の出力のパワースペクトル
密度から求められる緩和周波数ｆ１を利用して相対ゆら
ぎを求める方法である。光検出器２３によって散乱光を
変換した電気信号を以下に示す伝達関数を有する低域通
過フィルタ２７に通す。

ｃ Ｈ（ｆ）＝　− ｆ　＋　ｉｆｃ ここにｆＣは低域通過フィルタ２７のカントオフ周波数
であり、緩和周波数ｆ、よりも十分低い周波数とする。

このとき、低域通過フィルタ２７の出力として得られる
電流Ｉのゆらぎのパリアンスは、 〈δＩ　＞”＝に２＜　Ｎ＞　＋　Ｋ”＜Ｎ＞”ｆｃ／
ｆ。

となる。ただしＫは定数、　くＮ〉は散乱体積中の平均
粒子数である。したがって、低域通過フィルタの出力電
流の相対ゆらぎとして次式が成立する。

＜Ｉ＞”　　　ｆ、　　＜Ｎ＞ ここでａは比例定数である。散乱体積中の粒子数が十分
に大きいとすると、上式は次式のように書き直すことが
できる。

＜ｌ＞２　　　　ｆ。

したがって、パワースペクトル密度から緩和周波数ｆ、
を求めることにより相対ゆらぎを算出できる。

直径０．２１２μｍのラテックス粒子（比重１．０４ｇ
／ｃ＋ｄ）を緩衝液中に拡散させたラテックス懸濁液の
相対ゆらぎγを（２）式から求めた実験結果を第６図に
示す。第６図において、横軸はラテックス粒子数（ＸＩ
Ｏ”／ｃ＋１１）　、縦軸は相対ゆらぎである。この結
果から相対ゆらぎに粒子数依存性があることがわかる。

これは、ラテックス粒子数が多い時には、３重散乱以上
の多重散乱が増大するためにゆらぎ量が平均化されると
同時に散乱光強度が大きくなるので、相対ゆらぎは小さ
くなると考えられる。一方、粒子数が少なくなると、迷
光等の雑音の影響が大きくなり（２）式の分母が太き（
なる。それ故、相対ゆらぎが小さくなると解釈すること
ができる。その結果、相対ゆらぎがある粒子数でピーク
を示す　と考えられる。第６図において、ピークは５Ｘ
１０”個／ｃ１１付近にある。つまり、最も相対ゆらぎ
を大きくとることができる粒子数は、標準偏差があるの
である範囲の粒子数でピークを示す。

ピーク付近である４、８〜７×１０日／ｃｄは第５図か
ら明らかに２重散乱光を主に検出していることがわかる
。

第６図では、単位体積当りの粒子数と相対ゆらぎとの関
係を示したが、粒子の直径を変化させると相対ゆらぎと
粒子数との関係もそれにともなって変化する。そこで粒
子数と粒径の情報を持つ濃度として重！ｔＪ１度を導入
する０重量濃度と単位体積当りの粒子数との関係は次式
で与えられる。

ここで、Ｄ・・・重量濃度（賀ｔ％はＤ　Ｘ　１００で
求まる。）ｒ・・・粒子の半径 ｒ・・・粒子の比重　　　である。

ラテックス懸濁液の相対ゆらぎＴを（２）式から求めた
実験結果を第７図に示す。

第７図はラテックス粒子と相対ゆらぎとの関係を示す図
である。横軸はラテックス粒子の直径（μｍ）を、縦軸
は相対ゆらぎを表わす０図中記号△は０．２７ｗｔ％：
Ｏは０．４ｗｔ％；は０．６ｗｔ％の実験結果を表わす
。相対ゆらぎはラテックスの粒径に比例して増加してお
り、重量濃度によって実線で示した直線の傾斜角度が異
なる。

このことから、ラテックス粒子の重量濃度によって相対
ゆらぎが変化することがわかった。

発明者は第６図、第７図から、実際に抗原または抗体を
感作したラテックス粒子を用いて抗原抗体反応を相対ゆ
らぎを用いて検出する場合に最適な重量濃度を見い出し
た。最適なラテ・２クス濃度は、ラテックス粒子と緩衝
液等水性液体媒体との和に対して０．１〜１ｗｔ％（こ
れは第６図で粒子数２Ｘ１０”〜２０Ｘ１０”／ｃｊに
相当する。）、好ましくは０．２〜０．５ｗｔ％（これ
は第６図では粒子数４Ｘ１０”〜９Ｘ１０”／−に相当
する。）である。上記のラテックスの量が０．１ｗｔ％
より小さい場合には雑音が大きく相対ゆらぎが小さくな
り、かつ、濃度が薄すぎて抗原抗体反応が起こりにくい
ので好ましくない。ラテックスの量が１ｗｔ％より大き
い場合には逆に抗原抗体反応は増大するがラテックスが
濃すぎるために３重散乱以上の散乱光が増大しゆらぎ量
が平均化されてしまい、相対ゆらぎが小さくなるので好
ましくない。特に好ましいラテックス量として０．２〜
０．４７ｗｔ％を挙げたが、この範囲内では抗原抗体反
応が起こりやすく、相対ゆらぎが特に大きい。

第４図の装置を使用して抗原抗体反応を行なわせた結果
を第８図、第９図に示す、横軸は抗原濃度、縦軸は抗原
抗体反応による相対ゆらぎ比Ｒである。Ｒは以下のよう
に定義する。

第８図、第９図で抗原はアルファ・フェト・プロティン
（ＡＦＰ）を用いた。記号△は抗原をセル１８に分注し
てから５分後の相対ゆらぎ比Ｒの値を表わし、○は同３
０分後のＲの値を表わす。

第８図で、ＡＦＰと特異的に結合する抗体を固定した（
感作した）ラテックス粒子濃度は０．６ｗｔ％である。

実験結果から、抗原濃度が高い程、また反応時間が長い
程、相対ゆらぎ比Ｒが大きくなっている。これはラテッ
クスが凝集塊を形成したため、懸濁液中の粒子数が減少
すると共にブラウン運動が変化し、これによって散乱光
の位相干渉の程度が変化したことによる。

第９図で、粒子濃度は０　、２３ｗ　ｔ％である。第９
図では第８図に比べて全体的にＲが大きくなっている。

この粒子濃度は最適なラテックス濃度０．１〜１ｗｔ％
中の好ましい範囲０．２〜０．５ｗｔ％の値であり、第
９図の結果と良く対応している。

本実施例では、不溶性担体としては、球形のポリスチレ
ンラテックスを用いたが、本発明の測定を行う時に用い
られる水性液体媒体に実質的に不溶性であればどのよう
なものでも良い。

たとえば、有機高分子勧賞の微粒子として、ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジェン共重合体の如き乳化重合によ
り得られる有機高分子のラテックス、或いはシリカ、シ
リカ−アルミナ、アルミナの如き無機酸化物、その他鉱
物粉末、金属等が用いられる。

本実施例では、ラテックスを緩衝液に懸濁させていたが
、抗原ま・たは抗体を感作した不溶性担体を懸濁させる
水性液体媒体としては、水または水と水混和性有機溶媒
との混合物が包含され、この有機溶剤としては、アセト
ン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノールな
どが挙げられる。

本実施例においては、第７図に示す様に、相対ゆらぎγ
は、粒径に比例する。つまり、ＴＯｃＣｒ（Ｃは第７図
中実線で示す直線部の傾き；ｒは粒径を表わす。）であ
るから、あらかじめ、測定する微粒子の粒径と相対ゆら
ぎとの関係を求めておけば、粒径の不明な、この微粒子
の粒径を相対ゆらぎの値から測定できる。

この相対ゆらぎから粒径を求める場合には、測定すべき
粒子は球形でなくても良い。たとえば、入射光の波長の
数十分の１のオーダーの微粒子であれば不定形であって
も球形の微粒子と同様のふるまいをする。したがって、
ばいじん。

大気、工場排水中の各種微粒子の粒径測定に応用できる
。

〔発明の効果〕

本発明によれば、光強度ゆらぎから高感度で免疫反応を
測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第２図（Ａ）、　（Ｂ）は単一散乱を説明するための図
、 第３図（Ａ）、　（Ｂ）は多重散乱を説明するための図
、 第４図は本発明を実施する免疫反応測定装置の構成を示
す線図、 第５図は多重散乱光と二重散乱光の検知出力を示すグラ
フ、 第６図は粒子数と相対ゆらぎとの関係を示すグラフ、 第７図は粒径と相対ゆらぎとの関係を示すグラフ、 第８図、第９図は抗原濃度と相対ゆらぎとの関係を示す
グラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、測定すべき抗原または抗体を含む被検液と、前記抗
   原または抗体と特異的な抗体または抗原を感作した不溶
   性担体とを水性液体媒体中、前記感作不溶性担体の濃度
   ０．１〜１．０重量％で反応させ、この反応液に直線偏
   光された輻射線を投射し、前記反応液中で生じる散乱光
   の前記輻射線の偏光方向と異なる成分を検知し、この検
   知出力に基づいて抗原抗体反応を測定することを特徴と
   する免疫反応の測定方法。