JPH03274462A - 検体検査方法及び装置、並びに検体検査用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は抗原抗体反応等の特異的な結合を利用して担体
微粒子を凝集させ、その凝集状態を検出することにより
目的抗原又は抗体の定性又は定量測定を行なう検体検査
分野に関する。

［従来の技術］ 従来、抗原抗体反応等の特異的な結合作用を利用して、
目的物質を定性的又は定量的に測定する方法が広く知ら
れている。これはラテックス等の均一サイズの多数の担
体粒子の表面に目的抗原と特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を感作したものを被検試料と反応させて反応試
料を作成し、抗原抗体反応により凝集した反応試料中の
担体粒子を光学的手段等を用いて測定することにより、
目的抗原の定性的あるいは定量的な測定を行なうもので
ある。

より具体的な一例として、フローサイトメトリ法を用い
て前記作成した反応試料中の凝集担体を１個ずつ分離し
て流し、これに対してレーザ光源等からの光ビームを照
射し、その結果発生する散乱光を測光することにより凝
集塊の大きさを判断し、凝集状態から抗原抗体反応の測
定を行なうというものである。これは例えば特開昭５９
−１７３７５９号公報、特開昭６０−１１１９６３号公
報、特開昭６２−２２５９２８号公報等に具体例が記載
されている。

［発明が解決しようとしている課題］ これらに方法において使用する担体粒子は、通常０．５
〜５μｍ程度のサイズのラテックスが用いられている。

しかしながら抗原抗体反応により担体粒子を凝集させ易
くするためには担体粒子のサイズをできるだけ小さく、
好ましくは０．５μｍ以下、より好ましくは０．２μｍ
より小さいサイズであることが望ましい。

上記従来例では凝集塊の大きさを判断するのに、実質的
には１つのパラメータ、すなわち特定方向に発する散乱
光のみから判断している。ところが担体粒子のサイズが
あるレベル以上小さくなると、一つのパラメータだけで
は反応試料中に含まれる素手な゛ゴミ等の不純物と担体
粒子との区別がつきにくくなる。よってこれらの不純物
を担体粒子と誤認してカウントしてしまい、測定値に誤
差として含まれてしまうという問題点を有していた。

これを防ぐため、反応試料の純度を高めて不純物をなる
べく少なくするという対処法が考えられるが、これは手
間がかかる上、限界かあった。

本発明はサイズの小さい担体粒子を用いた場合ても、ノ
イズの混入が無く正確な測定か行なえる検体検査方法及
び装置、更には検体検査用試薬の提供を目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明は前記課題を解決すへくなされたもので、その要
旨は、目的抗原又は抗体と特異的に結合する抗体又は抗
原が表面に担持された担体粒子を被検試料と反応させ、
反応試料を作成する工程と、前記反応試料中の個々の物
質に光照射する工程と、光照射された個々の物質より発
生する前方散乱光強度及び側方散乱光強度を検出する工
程と、前記側方散乱光強度か所定閾値以上の場合に、前
記前方散乱光強度を測定データとして採用する工程と、
少なくとも前記前方散乱光強度の測定データを基に担体
粒子の凝集度合を判断し、前記目的抗原又は抗体の定性
又は定量測定を行なう工程とを有することを特徴とする
検体検査方法である。

［実施例コ 以下、本発明の実施例を図面を用いて詳細に説明する。

本実施例においては、担体粒子としてサイズが０．１８
μｍの不溶性ラテックスを用いた。

しかしながらラテックスには限定されず、例えばシリカ
、シリカ−アルミナ、アルミナ等の無機酸化物、鉱物粉
末、金属、さらに赤血球、ブドウ球菌、細胞膜片、リポ
ソーム、カーボンブラック等も使用可能である。担体粒
子表面に抗体を感作させるには、物理的に吸着させる方
法、担体上の官能基を利用して化学的に吸着させる方法
等が知られる。

目的とする抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体
か表面に感作されたラテックスを用意して、こねにヒト
の血清等の検体試料を添加し、適切な反応時間及び濃度
に調整して反応試料液、すなわちサンフ゛ル液をイ乍成
する。このサンプルン夜（±第１図のサンプル液容器１
６に入れられる。サンプル液の調整方法の具体例は、例
えば特開昭６２−８１５６７号公報に記載される。ここ
で前記モノクローナル抗体に特異的に結合する目的抗原
が血清中に含まれていた場合には、抗原抗体反応が起き
、目的抗原を介してラテックス同志が結合して２〜４個
程度の凝集塊を形成する。又、目的とする抗原が存在し
ない場合には凝集は起きず、ラテックスは単体のままで
ある。

又１、蒸留水や生理食塩水等のシース液は、シース液容
器１４に入れられる。サンプル液容器１６及びシース液
客器１４は各々不図示の加圧機構により加圧される。そ
して、シースフロー原理により、フローセル４内でサン
プル液がシース液に包まれて細い流れに収斂され、フロ
ーセル４内の流通部のほぼ中央部を通過する。この時、
サンプル液に含まれる個々のラテックスは分離されて１
粒或いは１塊ずつ順次流れる。このラテックスの流れに
対して、半導体レーザ１から出射されたレーザ光は、Ｓ
ＨＧ等の波長変換部材１９によって短波長光に変換され
る。なお、測定感度を高めるために波長変換部材１９を
使用してレーザ光を短波長化しているが、半導体レーザ
１として短波長レーザ光を出力するものを採用すれは、
波長変換部材１９は特に必要は無い。更には使用するレ
ーザは半導体レーザには限らない。このレーザ光は各々
流通部方向、それと直交した方向にパワーを有するシリ
ンドリカルレンズ２．３の組によって任意の形状に収斂
され照射される。ラテックスに照射される光ビームの形
状は、一般には流れに対して横長の楕円形状であること
が好ましい。これは個々のラテックスの流れの位置が変
動しても、ラテックスに均一の強度で光ビームが照射さ
れるようにするためである。

ラテックスに光ビームか照射されると散乱光が生じる。

前記散乱光の内、光路前方方向に発する前方散乱光は集
光レンズ５、光検出器６によって受光される。なお胛射
された光ビームが直接、光検出器６に″）、射するのを
防ぐため、光路中集光レンズ５の前方に光吸収性のスト
ッパ１７が設けられ、照射光源からの直接光、及び担体
を光透過した透過光を除去している。これにより担体か
らの散乱光のみを受光することかできる。

また前記散乱光の内、光路に直交する側方方向に発する
側方散乱光は集光レンズ７て集光され、ダイクロイック
ミラー８で反射されて光検出器１１で受光される。一般
には側方散乱光を受光する方向は本実施例のように直交
方向であることが多いが、直交には限定されず、例えは
４５度方向や６０度方向等であっても良い。又、本実施
例では使用しないが、ラテックスが蛍光性である場合に
散乱光と共に発生する微弱な蛍光を受光するため、集光
レンズ７によって集光され、ダイクロイックミラー８を
通過した蛍光の内、ダイクロイックミラー９、光検出器
１２の組によって緑色蛍光が検出され、全反射ミラー１
０、光検出器１３の組によって赤色蛍光か検出される構
成となっている。

なお本図では省略されているか、各光検出器の手前には
各検出波長域の光のみを通過させるためのバントパスフ
ィルタが設置されている。光検出器６．１１．１２．１
３の信号、及び先に説明した透過光を検出する場合には
光検出器１８の信号は演算回路１５に人力され、該演算
回路１５にて測定データ解析の演算が行なわれる。その
演算結果はＣＲＴモニタ等の出力手段１８に出力される
。

第２図は本実施例の電気処理系の詳細なブロック図であ
る。光検出器１１の出力である側方散乱光強度は比較回
路２０に人力される。ゴミ等の不純物と均一球形のラテ
ックスとでは粒子の光学的性質が異なり、これは側方散
乱光成分の違いとして判別することができる。よって比
較回路２０においては、この検出値を所定の閾値と比較
して、閾値以上であれば、すなわちラテックスと判断さ
れたら検出値を記憶演算回路２２に送る。それと同時に
弁別回路２１に指令を送り、光検出器６の出力である前
方散乱光強度を弁別して検出値を記憶演算回路２２に送
る。又、比較回路２０の比較の結果、側方散乱光強度が
所定閾値以下、すなわち不純物と判断されたら比較回路
２０の指令に基づき、光検出器６及び１１の出力は記憶
演算回路２２には取込まない。記憶演算回路２２におい
ては、前記選択的に取込んだ前方散乱光強度及び側方散
乱光強度を記憶し、必要に応じて外部記憶媒体２５に記
憶する。そして記憶演算回路２２てはこれらの検出値を
基に担体粒子の凝集状態を判別する演算を行なう。その
結果はＣＲＴモニタ２３やプリンタ２４に出力する。

次に以上の構成で得られた測定データの解析方法につい
て説明する。

第３図は前方散乱光強度の測定データをヒストグラムと
して出力した例である。横軸はログスケールによる前方
散乱光強度、縦軸は個数である。第３図（ａ）は弁別回
路２１を作動させずに不純物を含む全てのデータを取込
んだ場合の出力であり、これは従来例に相当する。又、
第３図（ｂ）は所定閾値以下のレベルの側方散乱光デー
タを弁別して取込んだ本発明に係るヒストグラム出力で
ある。両図においてＡ群は凝集しない単体のラテックス
によるもの、Ｂ群、０群、Ｄ群はそれぞれ２個、３個、
４個のラテックスの凝集塊によるものである。

ここで第３図（ａ）の従来例では、反応試料中に含まれ
る微小な不純物が１個又は２個のラテックスのサイズと
近似するため、同等の前方散乱光出力となり、これが測
定データに混在してしまい、ヒストグラムが不純物デー
タを含んだ不正確なものとなってしまっている。これに
対して第３図（ｂ）の本発明によれば、ノイズ成分であ
る不純物のデータが取込まれないため、正確なヒストグ
ラムが得られることが分かる。

記憶演算回路２２においては、第３図（ｂ）で前方散乱
光強度を自動的に４区間に分割してそれぞれの凝集塊の
個数を計数する。そしてこれらの計数値の比を演算する
ことで目的とする抗原の定性的あるいは定量的な測定を
行なう。より具体的には、未凝集粒子の個数をＰｌ、凝
集粒子の個数をＰ２とすると、Ｐ　２　／　Ｐ　１　　
あるいはＰ２／（ｐ＋　＋Ｐ２　）を演算しこれを凝集
状態を表わす凝集率とする。凝集率を求める手順につい
てのより詳細な説明は、特開昭６Ｏ−１１ｊ９６３号公
報、特開昭６０−２４３５６５号公報等に記載されてい
る。そしてこの凝集率を予め用意された検量線と比較す
ることにより、目的とする抗原の濃度を求めることカベ
できる。又、特開昭６１−２８０５６８号公報に示され
るように、反応時間Ｔ　＋　、Ｔ　２におし１て、それ
ぞれ凝集率から濃度を求め、それらの比較により定量測
定することも可能である。

さて、次に前方散乱光強度と共に側方散乱光強度も測定
データとして利用し、より正確な計数力τ可能な実施例
を第４図を用いて説明する。第４図は縦軸に側方散乱光
強度、横軸に前方散乱光強度をとり、サイトグラムとし
て出力したものである。各軸はログスケールを用いてい
る。第４図（ａ）は従来例、第４図（ｂ）は本発明によ
るものである。両図においてＡ群、Ｂ群１Ｃ群、Ｄ群は
それぞれ１個、２個、３個、４個のラテックスの測定デ
ータがプロットされる範囲を表わす。

又、第４図（ａ）のＥ群は不純物のデータがプロットさ
れたもので、前方散乱光強度は十分大きし１が側方散乱
光強度は極めて小さく、Ａ群〜Ｄ群の粒子とは性質が異
なっている。

これから分かるように、本発明によれば、不純物Ｅに相
当するデータが取り除かれるため、ノイズの無い正確な
サイトグラムが得られる。先の第３図（ｂ）に示したヒ
ストグラムでは、場合によっては各粒子塊の境界が不明
確で分割が難しいこともあったが、第４図（ｂ）に示す
サイトグラムによれば各粒子塊のプロット領域が２次元
的に明確に分離されるため、ウィンドウ処理を用いて各
領域の範囲をサイトグラム上で指定することで、より正
確に分割することができ、正確な計数値が得られる。こ
のウィンドウ処理は記憶演算回路２２にてパターン認識
処理技術を用いて自動的に行なうようになっているが、
マウスやトラックボール等のポインティングデバイスを
用いて人間が行なうようにしても良い。

第５図は更に別の実施例であり、特開平１−２０７６６
３号公報や特開平１−２７０６４３号公報に示される方
法により、−度の測定で多項目の検査を行なうものであ
る。

光学特性の異なる２種類のラテックスをそれぞれ２種類
のモノクローナル抗体で感作して、この反応試料を上記
装置で測定することで、サイトグラム上でこれら２種類
のラテックスが分離して表示され、−度の測定で２項目
の検査を行なうことができる。より詳細な説明は上記公
報に記載されるためここでは省略する。本実施例におい
ても不純物のノイズ成分が除かれるため、より正確な測
定が可能となる。

なお、以上の実施例では目的抗原を測定するために、担
体粒子表面に抗体を担持したものであるが、これとは反
対に担体粒子上に抗原を感作して抗体を測定するように
しても良い。

［発明の効果コ 本発明によれば、担体粒子を凝集し易くするために担体
粒子のサイズを小さくした際に問題となるノイズ成分の
混入を防ぐことができ、微小な担体粒子を使用して精度
の高い測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例の構成図、 第２図は実施例の電気処理系の構成図、第３図は従来と
本発明のサイトグラム出力の比較図、 第４図は従来と本発明のヒストグラム出力の比較図、 第５図は従来と本発明の多項目測定のサイトグラム出力
の比較図、 であり、図中の主な符号は、 １・・・・半導体レーザ、４・・・・フローセル、６．
１１．１２．１４・・・・光検出器、１５・・・・演算
回路、１８・・・・ＣＲＴモニタ、泥 う 昭 （θ） （ｂ） 第Ｕ口 り） （ｂ） 第 う 図 （Ｃり （１）） １つ畝名ＬＬ ！ＦＪう敢８Ｌ泊

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）目的抗原又は抗体と特異的に結合する抗体又は抗
   原が表面に担持された担体粒子を被検試料と反応させ、
   反応試料を作成する工程と、前記反応試料中の個々の物
   質に光照射する工程と、 光照射された個々の物質より発生する前方 散乱光強度及び側方散乱光強度を検出する工程と、 前記側方散乱光強度が所定閾値以上の場合 に、前記前方散乱光強度を測定データとして採用する工
   程と、 少なくとも前記前方散乱光強度の測定データを基に担体
   粒子の凝集度合を判断し、前記目的抗原又は抗体の定性
   又は定量測定を行なう工程と、 を有することを特徴とする検体検査方法。
2. （２）目的抗原又は抗体と特異的に結合する抗体又は抗
   原が表面に担持された担体粒子を被検試料と反応させた
   反応試料を、被検部に流す手段と、 前記被検部に対して光照射を行なう手段と、前記被検部
   を通過する反応試料中の個々の物質より発生する前方散
   乱光強度及び側方散乱光強度を検出する手段と、 前記側方散乱光強度と所定閾値とを比較する手段と、 前記側方散乱光強度が所定閾値以上の場合 に、前記前方散乱光強度を測定データとして採用する手
   段と、 少なくとも前記前方散乱光強度の測定データを基に担体
   粒子の凝集度合を判断し、前記目的抗原又は抗体の定性
   又は定量測定を行なう手段と、 を有することを特徴とする検体検査装置。
3. （３）前記担体粒子の凝集度合の判断は、前記前方散乱
   光強度の測定データと共に、それに対応する側方散乱光
   強度の測定データも用いて行なう請求項（１）又は（２
   ）記載の検体検査方法及び検体検査装置。
4. （４）前記担体粒子のサイズが０．５μｍ以下であるこ
   とを特徴とする請求項（１）又は（２）記載の検体検査
   方法又は検体検査装置。
5. （５）均一担体粒子の表面に目的抗原又は抗体と特異的
   に結合する抗体又は抗原が担持され、前記目的抗原又は
   抗体を介して担体粒子が凝集塊を形成する検体検査用試
   薬であり、前記担体粒子のサイズが０．５μｍ以下であ
   り、光照射により発生する側方散乱光強度が所定値以上
   であるような光学特性を有することを特徴とする検体検
   査用試薬。