JPS60501228A - 免疫反応物質等の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫反応物質等の分析法 発明の概要 本発明は、免疫反応物質等の少なくとも１種類を保持している不溶性粒子におけ る、免疫反応物質等の反応に起因する凝集度を測定する改良された方法に係わる 。キャリア粒子はラテックス・ビーズのような人造粒子でもよく、白液、組繊細 胞、微生物のような天然粒子でもよい。

本発明は特に単数または複数の特定の類に属する凝集物の計数に係わる。各類の 凝集物は例えば所与のサイズ範囲に含まれるサイズ、または所与の明るさ範囲に 含まれる散乱光を有するすべての凝集物から成る。その計数は複数回に亘って測 定、処即されることが好ましい。こうして凝集物形成パターンを比較的詳細に得 ることで、凝集度を従来よりも広範囲に、且つ正確にめることができる。

また、所与の系に関して、特に測定し易い類の凝集物を選択すると共に、測定結 果としての凝集物カラン１〜が特に敏感に全体的な凝集度を反映するように、類 ごとに凝集物を列挙するのに特に好適なタイミングを選択することが可能である 。

本発明の伯の特徴は不溶性粒子の凝集を利用する方法により、上記凝集度測定に 基づき試験溶液または懸濁液中の免疫反応物質等の分析を改良することにある。

試験媒質の反応に起因する凝集度を標準反応物で得た対応の基準データと比較す ることにより試験物質の濃度を少なくとも近似的に分析する方法はすでに数多く 提案されている。凝集度そのものの測定を改良することにより、本発明はこれら の公知分析法の精度及び信頼度を上記改良に比例して高めることができる。

本発明はまた、従来のようにすべての凝集物の平均分布からではなく、好ましく は単数または複数の類に属する凝集物のカラン１〜から試験物質の濃度をめる。

どの類の凝集物を測定するかは多くの場合、各試験系ごとに、特に分析すべき個 々の試験物質ごとに選択される。この選択の重要な条例として、各類の凝集物に ついて得られるカウントが被分析物質の濃度と密接に相関づることが好ましい。

そこで本発明はめるべき値との相関関係が特定の類を使用して得られる測定カウ ントよりも低い測定カウントをすべて無視する。

特定の被分析物質の分析に関与する凝集物の類は種々の方法で弁別することがで きる。多くの場合、凝集物パラメータ値の範囲に従ってそれぞれの凝集物が特定 される。この場合、前記パラメータは測定または計算されたパラメータ値が成る 凝集物がその類に属するがどうかを弁別するという意味で類を弁別する。

個々の凝集物に対応するこのような類限定パラメータ値は一般に光学的、電気的 または機械的測定、またはこれらを組合わせた測定によって得られる。光学パラ メータの例としては、散乱係数、吸収能または反射能、総光学密度、屈折率等が ある。電気パラメータとしては個々の凝集物が帯びる電荷、インピーダンス、コ ンダクタンス等がある。個々の凝集物のサイズや形状のような構造上のパラメー タは原理的には機械的測定によってめることができるが、光学手段による方が便 利である。密度は個々の凝集物の沈降速度で測定できる。、多くの測定結果及び これに対応する、またはこの結果からめられる類パラメータは複合的な技術によ って得られる。

特定物質の分析に利用すべき凝集物の類を弁別する土で特に有効なパラメータは 凝集物のサイズである。種々の特定サイズを有する凝集物の形成パターンは個々 のサイズに応じて互いに著しく異なり、従来のように凝集物のすべてのサイズを 一括して得た形成パターンとも著しく異なることが判明した。即ち、どのような 所与の操作条件下においても、凝集物サイズの限られた範囲は、分析試験物質の 初期濃度を示唆する特に敏感な関数である前記限られた凝集物サイズ範囲の凝集 物サイズの数により識別することができる。従って、このような相関性の高いサ イズ範囲内の凝集物だけ（または主としてこのサイズ範囲内の凝集物）を考慮し 、この勺イズの凝集物を測定するのに好適なタイミングで測定することにより、 分析の精度及び信頼度を従来よりもはるかに向上させることができる。凝集物サ イズ以外のパラメータに基づいて限定された特定の類の凝集物の形成パターン及 び有用性についても同様である。

実際には、測定対象として選ぶべき凝集物の特定の類及び各類に最も効果的な測 定夕、イミングは各試薬系による予備実験で選択するのが普通である。例えば、 分析すべきいくつかの既知基準濃度の試験物質を適当な補体物質の部分標本と先 ず反応させる。この場合、前記物質の１つが不溶性細胞またはその他の粒子の表 面に存在するのが普通である。形成された凝集物を観察し、どのパラメータが試 験物質の分析に好適な類の凝集物を限定するかを知るために、その分布を測定す る。この分布測定は試験物質のそれぞれの濃度に基づいて行なわれ、基準反応の 過程で数回繰返されるのが普通である。

得られたデータから、任意の凝集物パラメータと系のその弛のパラメータ、特に 測定時間及び試験物質の初期基準濃度との依存関係を確認することができる。上 記基準データから、凝集物カウントが試験物質の濃度変化と相関して特に敏感に 変化するパラメータ値の組合わせを識別するのが普通である。測定時間などのよ うな他のパラメータのそれぞれと関数関係にあるとすれば、前記カウントは比較 的安定した値を取ることが好ましい。このように識別されたパラメータ値が問題 の試験物質を分析する」二で特に好ましい測定条件を限定する１、例えば、特定 の試験系における上記基準反応の結果発生した凝集物のサイズ分布を測定、分析 すれば、試験物質初期濃度の所与の変化に伴ない、比較的早い段階にあっては、 小さい凝集物のカウントに大きい凝集物のカウントよりも大きい変化が現われる が、時期を遅らせた測定ではこの関係が逆転することが明らかになるであろう。

このような条件下では、早期の測定にはサイズの小さい凝集物が好ましく、遅い 時期の測定にはサイズの大きい凝集物が好ましい。

このような条件のほかに、パラメータの選択に際しては、凝集物カウントが比例 的に、またはその他の好ましい関数関係で試験物質濃度に依存するようなパラメ ータ値またはパラメータ値範囲、及び連携の測定タイミングを選択することが好 ましい。

基準データの検討には、上記凝集物カウントからめることができ試験物質Ｉｉ１ 度の変化により敏感に応答することのできるもつと複雑な関数の考察も含まれる 。例えば、特定の凝集物パラメータ範囲に対応する凝集物カウントの変化率を多 数回に亘って得られたカウントから計算することができる。また、このようなカ ウントを実際に測定が行なわれる範囲外の時間、例えば、もはや著しい変化が起 こらない“無限時間″に外挿することもできる。検討領域をこのような誘導パラ メータにまで広げることにより、本発明は測定可変数とめる８１曵との間にさら に高い相関関係を成立させることを可能にする。

本発明による新しい分析法の一般的な応用分野を要約すると、薬剤、低及び高分 子ホルモン、血漿蛋白、抗体、細胞抗原、及び粒子凝集に至る特定の反応によっ て検出できる物質など種々の物質の混合物中における凝集を含む方法による定量 ということになる。前記反応としては、抗原・抗体反応、レクチン・炭水化物反 応、レセプタ・抗体反応などがある。本発明の特に有用な用途は分子またはその 表面構造の検出及び定量による天然粒子の識別である。検出及び定量の対象とな る被検体は一般に、自然発生した場合と、人工的に粒子表面に結合させられた場 合とが考えられる。一般的な例が細胞の型分類、例えば個人の血流中におけるＢ 細胞、Ｔ細胞及び単球の数を定量するための赤血球の型分類や、微生物のような 単細胞または種子や花粉のような細胞群の識別である。

これに関連して、立体障害の問題を克服し、細胞間に充分なブリッジ状態を得る ため、抗体などのような補体物質を溶液の状態ではなく微粒子またはその他の細 胞に結合させた状態で、即ち、両反応物が粒子表面に存在するようにして利用す れば多くの場合成果を上げることができる。

本発明は直接的な凝集反応の利用に限られるものではなく、例えばあらかじめ反 応物を操作したり、補体反応物を添加したりすることを必要とするような種々の 変則的な凝集反応のいずれかを利用するように改良した反応勘定開法をも提供す る。この変則的な反応には、例えば、凝集の抑制または促進を伴なう方法である クームス（Ｃｏｏｍｂｓ　）法や、共同凝集反応が含まれる。

この明＄１［１書及び請求の範囲に使用する抗体という語は一般に適当なモノク ロナル抗体、抗原結合作用を有する抗体断片、及び人工的に生成した異種結合抗 体を含むものとする。また、抗抗体という語は一般に抗免疫グロブリン作用を有 する適当なブドウ球菌プロティンＡなどの物質を含むものとする。

粒子という語は天然粒子及び人造粒子の双方を含むものとする。天然粒子の例と しては、血液または組繊細胞、微生物及び天然に生成する花粉や細胞小器官のよ うな小さい細胞群がある。人造粒子はラテックス・ビーズやガラス・ビーズのよ うな適当な材料で形成することができる。

本発明のその他の特徴を以下に説明する。

１１悲１１ 抗原とこれに対応する特定の抗体との間の、または互いに特殊な反応をするその 伯の組合わせの補体物質間の反応の存在を一方の物質が結合している不溶性粒子 の凝集により立証できることは公知である。この粒子は特定のレセプタ、例えば 抗原または抗体を帯びる天然の細胞であるか、またはラテックス、ガラスその他 適当な物質の人工的な″゛ビーズ″ある。このビーズに、多くの場合吸収または 化学結合により一方の反応物質の分子をコーティングすることによって先ず感作 処理する。感作細胞または感作ビーズが補体反応物質を含有する溶液と接触する と、２つの反応物の分子が結合する。もし溶解反応物が多重原子価を有するなら 、反応が細胞またはビーズを結合させて凝集物を形成する。このような凝集物を 検出することで反応の存在が立証され、粒子側の反応物またはレセプタの型が示 唆されるか、または溶解反応物の濃度が半定量的に測定される。

抗体などとの反応によって細胞を凝集させるのは細菌及びその伯の微生物を識別 づるための最も占い血清学的方法の１つである。この方法は血液型の鑑定や適合 試験にも広く利用されている。このような凝集法には測定すべき凝集を最終的に 発生させるために補足的な段階を必要とする間接凝集や凝集抑制のような変則的 なものも含まれる。前記補足的段階としては試薬添加や洗浄が含まれ、これらは 最初の補体反応物の一次反応に続いて行なわれるのが普通である。しかし、この ような補足的な段階を利用して形成される粒子凝集はあくまでも前記−次反応に 起因づるものと考察され、この−次反応がなければ補足的な段階は無効である。

本発明は以上に述べた公知の方法及び当業者には周知の変更実施態様によりこれ ら公知の方法から導かれる多様な関連方法との関係において凝集度を分析するの に応用できる。

細胞またはその他の粒子を自然にまたは人為的に固有の抗原または抗体でコーテ ィングしてから、適当な補体試薬により凝集させればよい。特定の補体物質と反 応させるための多種に亘る物質を支持するキャリア粒子の選択、調製及び／また は感作については文献に詳しく記載されている。粒子凝集を形成づるこの反応を 進行させる訂細な方法も公知である。

一般に、キャリア粒子は抗原またはこれと神体関係にある抗体でコーティングす ることによって感作処理することができるから、このような１対の補体物質のい ずれか一方について試験溶液を分析するのに凝集法を利用することができる。キ ャリア粒子を適当に選択すれば、抗原と抗体の免疫反応に似た特殊な態様で補体 物質と組合わせることのできるほとんどすべての物質にこの方法を応用すること ができる。例えば、レクチンは特定の炭水化物と特殊な反応を行なうことが知ら れている。同様に、非免疫原性のハプテンは適当な特異性を有する抗体と反応す ることができる。一般的にはこのような対のいずれか一方を天然または人造の粒 子と連携させればよく、これがもう一方の補体物質と反応すれば凝集するから、 この凝集を利用して１対の反応物のいずれが一方を分析することができる。

リンパ球やその他の細胞及び細菌のような自然発生的なキャリア粒子の多くは固 有の結合部位を有し、この部位と特殊な関係にあって粒子を凝集させる適当な抗 体またはレクチンを利用することによって直接的に定量することができる。例え ば各種の細菌はその種類に固有の抗原を支持している。このような細菌は支持し ている抗原に固有の抗体と接触させることで凝集させることができる。このよう な反応を利用すれば、抗原に固有の既知抗体との接触による凝集で細菌を識別す るが、または血清サンプルに特定の細菌を添加した時に現われる凝集により、こ の細菌に対する抗体が患者の血清中に存在づることを立証することができる。

反応して凝集を形成する抗体の型を感作することにより患者の赤崩球を型分類す るのに同様の反応が広く利用される。

分析すべき試験反応物を補体物質と接触させた時に必ずしも検出可能な凝集が形 成されなくてもよく、この段階において凝集を伴なわずに２つの補体反応物が組 合わされ、試験反応物の存在を分析する手掛かりとなる凝集を形成するために補 足的な操作または試薬の添加が必要であってもよい。このような間接凝集法の一 例がクームズ試験（ＣＯＯｍｂＳ　１’ｅＳｔ　）である。例えば、天然または 人造粒子が帯びている抗原と溶解抗体との間の最初の反応が抗体を結合するが顕 著な凝集を形成づるには至らない場合がある。この場合、凝集を形成するための 補足段階としては、遠心分離及び洗浄、またはクロマ１〜グラフイ法などによっ て粒子及びこれと結合している反応物から溶解状態の非反応性物質を除去した後 、抗体ど補体関係にある補足反応物、例えば第１抗体に対応する、適当な動物の 体内で形成される抗抗体を添加するのが公知の代表的なり法である。このような 補足的な方法を利用して形成した粒子凝集は粒子側の抗原または抗体を分析する のに利用できる本来の免疫反応の程度を表わす測定値を提供する。

間接凝集による分析の他の実施態様では特定の物質による凝集抑制作用を利用す る。このような抑制度の測定値を利用すれば試験溶液中の抑制物質濃度をめるこ とができる。例えば、不溶性粒子と結合している被分析物質と溶液中の特定抗体 との反応による凝集は多くの場合、溶解状態の被分析物質分子の存在によって抑 制される。

溶解した被分析物質は結合状態被分析物質と競合して抗体と反応し、結合状態被 分析物質との凝集反応に関与する有効抗体濃度を低下させる。

被分析物質としての試験溶液の分析に抑制を利用する際に、実際には、粒子に結 合状態の被分析物質を添加づる前に先ず試験溶液を限られた量の溶解抗体と反応 さゼることによって感度を高める。試験溶液中に被分析物質が存在せず、従って 抑制が起こらない場合、微量Ｃあるが明確に検知可能な基準凝集を発生させるよ うに反応に関与する抗体量を調整すれば、試験溶液に微量で一６被分析物質が存 在すれば、前記微量の基準凝集の比較的大きいパーセンテージが低下する。従っ て、適切な考慮を払えば試験の感度を著しく高めることができる。この方法は血 清またはその他の液体中に通常低濃度で存在する低分子ホルモンまたは薬剤のよ うな被分析物質の定量に特に有用である。

試験物質を適当な粒子に結合させることができるか、または試験物質が適当な粒 子に支持されているなら、試験溶液中のいずれか一方の補体物質の分析に一般的 な凝集抑制法を利用することができる。通常の凝集法の場合と同様に、粒子は天 然でも人造でもよい。

凝集分析の感度及び速度は多くの場合、水と結合し易いポリエチレングリコール のような親水性の、ただし免疫的に不活性の物質を添加することによって高める ことができる。これにより粒子は比較的疎水性の環境に置かれ、相互の結合性向 を強める。

また、抗体全体ではなく、１価または２価の抗体断片だけをビーズと結合させる 場合、個々の系に応じて感度を高め、非固有反応性を低下させればよい。例えば ガラスやラテックスの表面のような粒子表面の非固有反応性をできるだけ小さく するためには、非反応性蛋白またはその他の適当な物質でコーティングするか、 または結合することによって前記表面をカバーすることが好よしい。

以上に述べた公知の方法はいずれも従来凝集法が利用されて来た領域がいかに広 いかを物語るものである。凝集物を類別し、凝集度を測定する本発明の方法の用 途も同様に広く、以上に述べた具体例は極く一部に過ぎない。

公知技術 凝集反応一般及びその変形例に関しては多くの書籍や、おそらくは数百にものぼ る論文が詳細に記述している。

これらの開示例の多くは赤血球をキャリア粒子として使用する血球凝集反応に係 わる。この種の多くの物質を処理する詳細な方法は１９７７年にＡｃａｄｅｍｉ ｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉ　ｎｃ。

から出版されたＣｕｒｔｉｓ　Ａ、ＷｉｌｌｉａｌＩｌｓ及びＭｅｒｒｉｌｌＷ 、Ｃｈａｓｅ著“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”　、第■巻、第１６章、第１−１２５頁に、原 典の川魚と共に記載されている。これらの公知方法では凝集の検出は視覚的であ り、この検出によって確認されるのは試験反応物希釈物のうちのどれが検出可能 な凝集を発生させるかどうかだけである。

凝集度を゛測定する″といえる公知方法は個々の凝集物を検討することなく、懸 濁物を全体として処理するのが普通であった。このような公知方法の代表的なも のは懸濁液を透過する、または所定の測定角度で懸濁液から散乱する光の性質を 測定する方法である。例えば３ｈｉｒ。

Ｍｏｒ＋ｔａ等の米国特許第４，３１３，９２９号は懸濁液全体から一定の角度 で散乱する光の強さまたはその変化率の測定を開示している。

凝集の存在は懸濁液から擬弾性散乱する単色光の周波数ずれを測定することによ って検出された。各懸濁粒子のブラウン運動が粒子サイズと反比例する限界内で 統計的に変化する周波数ずれを発生させる。しかし、観察されるスペクトル拡張 は必然的に、懸濁液中に存在するすべての凝集物及び単独粒子の平均値を表わす ことになる。

このような測定方法は例えば９　Ｒ１ｃｈａｒｄ　Ｊ　、　（：、　ｏｈｅｎ等 の米国特許第４，０８０，２６４号に開示されている。凝集物のサイズ分布を制 御づ゛ることにより反応条件を調整する方法がＧｕｓｔａｖ　Ｋ、　Ｖｏｎ　５ ｃｈｕｌｔｈｅｓｓ等の米国特許第４．１６４，５５８号に開示されているが、 すべての凝集物サイズ群の一部だ（ブを測定することはできない。Ｅ、Ｆ、ＵＺ （１ｉｒｉｓの米国特許第３，９８４，５３３号は懸濁液中に存在するすべての 粒子の平均電気泳動度を測定するのにほぼ同様の技術を利用する。

懸濁液中の非凝集粒子数の減少に基づいて間接的に凝集を検出する方法も公知で ある。例えば、単独粒子だけをカウントするように改良した自動粒子カウンタ装 置のフロー・セルをサンプルが通過するようにすればよい。

こ（Ｄようなアプローチは、（ｌｉｎ、ｃｈｅｍ、、２７／７．１２０５−１２ ０９　＜　１９８１）に掲載されたＤａｎｉｅｌ　Ｃｏ１１ｅｔ　Ｃａ５ｓａｒ ｔ等の論文“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ−ＣｏｕｎｔｉｎｇＩｍｍ ｕｎｏａＳＳａｙｆｏｒ　［）ｉｇｏｘｉｎ”に記載されている。

粒子カウント免疫分析（ＰＡＣＩＡ＞及びこの分析法及び本発明を応用できる具 体的な問題が１９８１年Ａ　ｃａｄｅｍ　１ＣｐｒｅＳ３刊“Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　［ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　”の第７４巻、Ｊ　ｏｈｎ　Ｊ　、　Ｌ　ａｎｇ ｏｎ及びＨｅｌｅｎ　Ｖ　ａｎ　Ｖ　ｕｎａｋｉｓ編“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（Ｐａｒｔ　Ｃ）　”にもつと広範囲に亘って 取上げられている。この方法ではニコーヨーク州、テリタウンの■ｅｃｈｎｉｃ ｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている装置（第１０６−１１１頁） が採用されている。

光線をフロー・セルに合焦さゼ、単独キャリア粒子に固有の一定の小さい角度の 散乱光だけを光電管に合焦させる。こうして得られる光パルスに基ついてセルを 通過りる単独キャリアのカウントをめる。

Ｅ、　Ｅ、　Ｕｚｇｉｒｉｓ等の米国特許第４．１９１，７３９号にはそれぞれ ２個または３個だけのビーズから成る凝集体に応答できるという特°性に鑑み、 ″“抵抗パルス法パが反応を測定する敏感な方法として有効であることも示唆さ れている。この方法では、瞬間的に交番する電圧が印加される２つのチェンバ間 の微視的なオリフィスに圧力または電気泳動効果の強制下に粒子を通過させる。

この特許は請求の範囲として、ビーズ感作中の自己凝集に起因する誤差を回避す る方法を開示している。このような誤差は１種類の試薬で２つの異なる粒子サイ ズのビーズを別々に感作処理してから、互いに且つ他の試薬と混合し、各サイズ のビーズ１個を含む錯体だけを検出することによって回避される。こうして得ら れるカウントには、各サイズのビーズを感作処理する過程でたまたま形成された 凝集物は含まれない。この方法とその利点は明らかに本発明と異なる。

試験懸濁液の凝集度をめるため、本発明は多くの場合懸濁液の代表的な領域を適 当な態様で走査することにより、領域中に小さい間隔で配列された一連の基本位 置にあける明るさを表わす電気信号を発生させる。

他の実施例では個別の信号を直接発生ずる例えば光感ダイオードのような矩形配 列の不連続な光感素子上に懸濁液の領域を結像させるか、または公知の光学手段 により、線形配列の前記素子を領域に対して横断方向に掃引することにより、各 素子が一定通路に沿って前記領域を走査できるようにする。

領域走査またはこれと等価の操作中に発生する個々の位置信号は多くの場合デジ タル変換され、対応の領域位置の識別と共に公知のメモリ装置に記録される。こ の場合、適当な汎用デジタル・コンビ」−一夕を公知の態様でプログラムすれば 記憶データを処理して所要の操作を行なうことができる。

例えば、領域背景ではなくキャリア粒子を表わす信号を選択するようにコンビコ ータをプログラムする。この選択は一般に信号で表わされる明るさに関して行な われ、その場合、選択をアナログ信号で直接行ない、記憶に先、・って二進形式 に縮小寸ればよい。しかし、粒子がはっきりした色を帯びている場合には、各位 置信号は公知のビーム・スプリッタ光学系及び／またはカラー・フィルタで別々 に感知されるそれぞれの波長域を表わす２つ以上の弁別可能な成分を含むことが できる。この場合、領域信号と粒子信号の弁別は例えばカラー成分の比率に基づ いて行なうことができる。このような弁別は色彩の異なる２種類以上の粒子間で も可能である。

コンピュータはまた、粒子に対応する種々の信号の位置を比較して、領域中の位 置が互いに近接し、従って懸濁液中で同じ物理的対象に係わる粒子の群を識別す るようにプログラムされる。個々の粒子が光学系で解像できるほど人ぎければ、 この対象は単独粒子でもよいが、粒子凝集物であってもよい。

本発明のこのような実施態様にあっては、各粒子信号群を分析することにより、 分析に含まれる凝集物と無視される凝集物とを弁別するために設定されたパラメ ータ値をめるのが普通である。このパラメータ値を利用して各凝集物ごとに信号 を発生させる。この信号は特定の類の凝集物を表わすから、以後類信号と呼称す る。説明の便宜上、選択されたパラメータは光学走査装置から見た凝集物の見掛 は面積であると想定づ−る。その場合、類信号は個々の凝集物の面積を表わす。

もし位置信号が好ましい状態である等間隔の領域要素に対応するなら、各対象の 見掛は面積を粒子信号数をカウントづることにＪ：ってめることができる１１例 えば、もし信号が１ミグ１２間隔で正方形格子を形成する位置に対応するなら、 対象の面積は連携の群における信号数をカウントするだけで平方ミクロン単位で 表わすことができ、各類信号はこうしてめられた面積を表わす。

順次側方に位置をずらしながら領域を横切る掃引に対応して連続的に変化するア ナログ信号を発生するビデオカメラまたはその他の装置によって走査を行なう場 合、各掃引中に発生するビデオ信号は掃引を制御する周期的な同期時間信号に対 する時間関係により識別される小さい要素部分から成ると考えることができる。

この場合、掃引についても同期信号に対する時間関係についてもＵいに″近接す る″いくつかの掃引信号セグメントに領域内の各対象を連携させればよく、各対 象の面積はＡ−バラツブする掃引部分の長さの和と走査インターバルの積として 表わすことができる。

信号処理に関する別のアプローチとして、例えばコンピュータによって領域中の 対象間の境界を、近接信号を比較して信号が位置に応じて急変する位置を児つけ ることで直接検出することができる。この場合、各対象はその面積内の信号によ ってではなく境界に沿った位置のシーケンスによって限定される。、対象の面積 は例えば境界点のＸ及びｙ座標の差で計算することができる。このアプローチで も、公知のパターン検知技術を利用することで形状の異なる粒子の弁別が容易に なる。その他の種類の走査装置及び処理方法を採用してもよく、対象物の面積及 びその他の必要な性質を適当な態様で計算することにより類信号を形成すればよ い。

従って、懸濁領域の各走査ごとに、それぞれが領域の個々の見掛は面積を表わし 、且つ類信号によって表わされる一連の数が得られる。この信号をそれぞれの信 号に関する他の必要な情報と共にメモリ装置に直接記憶させればよい。ただし一 般的には、コンピュータに凝集物の特定の類を限定する上下限の少なくとも実験 値を入力すると共に、これらの限界値を類信号を比較して特定頬内の測定凝集物 数をめるようにコンピュータをプログラムすることが好ましい。多くの場合メモ リに記憶されるこれらの数カウントが凝集度を定量するための重要な基準となる 。

上記のような光学走査法には、取扱いに便利なトレイに形成された公知の小さい 凹みに収納した培養懸濁液に影響を及ぼさずに実施できるという利点がある。反 応物は公知の態様で自動的に凹みに装入するのが好ましい。

多くの場合、培養の過程で間歇的に懸濁液を攪拌し、一定の降下時間後凹みから 取出さずに反応生成物を測定する。結果の電子的記録及び処理を伴なう光学走査 の利点は多数の凹みをほぼ同時に走査するのに充分な高い操作速度が可能である ことにある。個々の領域の走査はほぼ瞬間的に達成できるほど高速である。従っ て、比較的多数の凹みをほとんど同条件で処理しなければならない場合でも、一 連の走査を高精度で時定できる。走査される領域が凹み全体を代表するような領 域なら、比較的小さくても懸濁液全体を正確に表わす成果を提供することができ る。

粒子凝集の測定に対する伯のアプローチでは、多くの場合狭く限定された線形通 路に沿って懸濁液の一部が通過するフロー・セルが使用される。個々の粒子また は粒子凝集物の通過に応答するモニター装置を前記通路の近傍に設置する。この モニター装置はサイズの異なる凝集物に選択的に応答するのが普通である。全反 応生成物を表わす凝集物を得るには懸濁液全体のうちから比較的小さい一部を取 出すだけでよい。

公知フロー・セルの１つは所定の小角度で散乱リ−る光だけに応答する光検知器 と共に鮮明に合焦された横断光源を使用する。光線と交差する物体があれば、物 体の４ノイズとほぼ対応して振幅が変化するパルス形式の信号が検知器から出力 される。このような“粒子カウンタ″及び付属装置は例えばニューヨーク州、テ リタウンのＴｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎや、カリ７７１ルニア州メンロー・パークのｐａｃｉｆｉｃ　３ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　、　＠　１Ａ　Ｃ／　ＲＯＹ　ＣＯＩ　ｒｉｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　 ｄｉｖｉｓｉｏｎがら市販されている。

粒子検出器の他の実施態様では、異なる電圧に接続した２つのチェンバ間の小さ いオリフィスが利用される。

液状媒質とは異なる電気特性を有する固体が通過するとオリフィスにおける測定 電界が混乱する。この混乱を感知したチェンバ内の電極が固体のサイズに応じて 振幅が変化する電圧パルスを発生する。このような装置はイリノイ州、■ルムハ ーストのｐａｒｔｉｃｌｅ　ｄａｔａ、Ｉ　ｎＣ，がら市販されている。電気的 、光学的の別なく、フロー・セルは粒子サイズを表わす信号を出力するが、電気 的な装置は容積に、光学的な装置は面積にそれぞれほぼ対応する独自のサイズ測 定方式を結果に反映にする傾向がある。

測定用に設定される凝集物サイズは反応物及び粒子の性質と操作条件に応じて著 しく異なる。凝集する粒子が例えば血球や殺菌を利用する場合のように適当に拡 大すれば光学的に視認できるサイズのものなら、上述したような態様で最も小さ い錯体で測定し、カウントすることができる。従来利用されているラテックス・ ビーズのように粒径が光の波長程度なら、凝集物が充分なサイズに達するや否や 凝集物形成パターンの測定を開始できる。

従って、本発明は通常の分析に利用できるサイズなら、いかなるサイズの粒子の 凝集分析にも応用できる。

光学測定の場合、入射光線及び検知光線は例えば遠紫外線から近赤外線に至る広 いスペクトル域にまたがってもよいが、公知の態様で任意の波長範囲または単一 波長にだけに制限してもよい。このような光線を感知する光学系及び変換装置は 数多く市販されており、特定の用途に特に有用なものがある。

また、条件によっては光線の異なる特性に関連する２つ以上のパラメータを感知 して凝集物の異なる性質を測定するため、複合光学系を使用することが望ましい １．この場合、凝集物の類は複数のパラメータに基づいて限定すればよい。例え ば、被分析物が螢光を発する場合、領域中の個々の凝集物の総螢光量が１つの数 限定パラメータとなる。この光線の偏光劇をも測定すれば、その測定値は螢光性 反応物の状態に関する補助データとなり、凝集物の別の類を限定するのに利用で きる。同様に、散乱光の強さと共に各凝集物の屈折率を測定してもよい。このよ うな１対ずつのパラメータを各凝集物について測定すれば、得られた測定値を単 独でまたは組合わせた形で利用することにより数パラメータを限定することがで き２個のパラメータに基づいて限定される類としては、例えば長さと幅の比によ って凝集物の形状を規定する類が考えられる。その他の形態パラメータとしては 、個々の凝集物からの反射光とその見掛は面積との比などで表わされる凝集物構 造の開放度または不透明度がある。

凝集度の測定は２つのほぼ同様な物質の微妙な相違を検知するなど多様な目的に 利用できる。例えば異なる供給源から取得され、濃度が同じであるとされている 同じ薬剤の２つのサンプルを全く同じ条件下て凝集反応さぜれば、反応の全過程 を通して全く同じ凝集度か認められるはずである。もし凝集度に差が検知されれ ば、２つの物質が全く同じで′ないことになる。

分析のための凝集物の類選択 凝集度測定は、凝集反応に関与し試験溶液または懸濁液中に元から存在する特定 反応物の濃度をめるのに利用されるのが普通である。試験物質または被分析物の このような分析では通常、試験反応による凝集の程度を測定し、試験結果を既知 量の標準物質及び適当な対照物質を使用する標準反応で対応の態様で得られたデ ータと比較する。本発明の顕著な特徴は凝集測定の範囲が試験反応についても標 準反応についても単数または複数の類の凝集物の数の測定に限定されることにあ る。従って、本発明の要点は特定物質の分析において考慮すべき凝集物の適当な 類を選択することにががっている。

このような凝集物サイズを左右する要因は、凝集物サイズに基づいて限定される 類の異なる１群の凝集物におけるこれら凝集物の分布に直接影響する凝集物形成 ・成長の力学を考察することによって理解Ｊることがて゛きるであろう。

１つの反応物を含有覆−る溶液を、補体反応物で感作処理された粒子懸濁液と組 合わせる場合、最初に形成される凝集物は溶解反応物の多価分子によって結合さ れた２個の粒子だ（プを含む。培養が進むにつれて、懸濁液中のこのような二元 凝集物の個数が増加し、単独粒子の個数が減少づる。従って、残る単独粒子は次 第に、他の単独粒子とよりもむしろ既存の二元凝集物と結合し易＜＜’にる。

即ち、正味の二元凝集物生成率は低下し、二元凝集物の成長率が増大する。同様 に、四元以上の凝集物が順次現われる。反応物の性質、初期濃度及び粒子のサイ ズ、感作度などの条件が適当なら、個々の凝集物の多くはそれぞれの粒子数が数 十または数百に達するまで成長し続ける。すべての凝集物サイズの平均が時間と 共に増大するにつれて、どのサイズ範囲においても個数の増加速度が鈍り、最大 限に達した後、減少に移る。比較的小さいサイズについては比較的急速に増加し 、比較的急角度の最大限を経て、この最大値からかなり著しく減少する。最大サ イズ凝集物については、限られたサイズ範囲内の個数は反応が平衡に達づるまで はゆっくりと成長するのが普通である。

なお、明確さを期して明細書の記述はやや簡略化してあり、例えば、反応物の親 和力や、統計的に優位を占めるど推定される凝集物の傾向などのような要因を省 略しである。

各種凝集物の形成パターンは多くの実験条件に応じて軛しく異なり、特に試薬の 種類及びその濃度に左右される。従って、本発明を最大限に活用するためには、 各類の測定タイミングを適正に選択し、且つ分析ずべき物質及び試験溶液または 懸濁液中におりるこの物質の推定濃度に留意しながら、測定すべき凝集物の類を 選択することが好ましい。

特定の分析に適当な凝集物の類選択は同じ試薬及び同じ操作条件で行なわれた経 験に基づいて行なわれるのが普通である。このような経験がなければ、問題の試 薬に対応するパラメータ値の相互関係を実験的に調査し、この調査データに基づ いて特に好ましい凝集物の類を選択する。

例えば溶液中の抗原を分析するための予備測定を行イｊうには、種々の標準量の 抗原を、不溶性粒子と結合している補体関係の抗体の部分量と反応さゼる１、そ の他の条件はどの反応物についても一定とし、実際の分析に採用する条件と一致 させる。これらの反応物のそれぞれに起因する凝集物を、どのパラメータが有用 な凝集物の類を限定Ｊるかについて測定する。即ら、可能な類限定凝集物サイズ をめるため、観察される各凝集物のサイズを測定し、この場合、１絹の反応物の りへての測定をはば同時に行なう。時間をずらして測定を行なう場合については 後述する。

得られた１組のデータから、凝集物サイズに応じｃ５″？。

なる凝集物の数をサイズごとに示すグラフをそれぞれの初期抗原濃度ごとに作成 づる。このようなり−イズ分布曲線は利用し易い形式で基本情報を含んでおり、 これを検討することにより、有用な凝集物の類を形成することのできる凝集物サ イズ範囲を知ることができる。類選択はまた、前記サイズ範囲内のサイズを有す る凝集物の数を初期抗原濃度との関係で示すグラフを、各サイズ範囲ごとに作成 することによって容易になる。

凝集物カウントと抗原濃度の関係を示すグラフの多くは勾配が比較的急な、即ち 、平均勾配よりも著しく急な部分を含む。この部分は個々のグラフの特定サイズ 範囲に対応する凝集物カウントによって特に敏感に表わされる抗原濃度範囲を示 す。従ってこの凝集物サイズ範囲が特定濃度範囲における抗原の分析に適したパ ラメータであることが示唆される。用途によっては、このレベルの分析に基づい て分析のための最終的な凝集物サイズを行なうことができる。

以上に述べた１組の標準データの相互関係は多くの場合、Ｘ軸に凝集物サイズ、 ｙ軸に初期被分析物濃度、Ｚ軸に対応の凝集物個数をそれぞれ示す三次元グラフ を作成するようにコンピュータをプログラムすることでさらに明確に可視化する ことができる。このグラフは例えば任意の被分析物範囲について最も敏感な凝集 物サイズを明示すると共に、個々の分析において予想される全濃度範囲を高感度 でカバーす払には幾通りのサイズを測定すべきかを示唆する。場合によっては、 特に日常分析には特表昭ＧＯ−５０１２２８（１２） 単一サイズ範囲内の凝集物を測定し、処理するだけで、予想される濃度範囲全域 に亘ってすぐれた精度が得られる。

上記類選択は説明の便宜上、標準反応物を同時的に測定する場合だけに限定した が、時間パラメータを活用するためには、予備試験によって選択できる時間帯に 亘る一連の時点に補足的な測定を行なう。反応パラメータを測定し、測定の結果 得られた凝集物個数を、好ましくはそれまでと同じサイズについて上記態様で処 理し、各時点における凝集物カウントと標準被分析物′ａ度の関係を示す同様の 一連のグラフを得る。好ましくは各測定時点ごとに三次元グラフを作成する。

これらのグラフを互いに比較すれば、多くの場合、成る時点の最適凝集物サイズ が他の時点の最適凝集物サイズと異なることが判明する。また、所与のサイズに 関しては、成る時点では成る被分析物濃度と、他の時点では他の被分析物濃度と 最も敏感な関係が成立する。しかし、所要の濃度範囲の一部については成る時点 に、他の部分については他の時点に測定することにより、前記所要の濃度範囲全 域に亘って高い感度を示す単一の凝集物サイズを発見できる場合が多い。濃度範 囲の各部分が特定のサイズ及びこのサイズに好適な特定の測定時点によって最も よくカバーされる場合もある。データ分析の結果、最適の凝集物類を得るのに特 に好ましい被分析物濃度節、囲が示唆されることもある。多くの場合、試験溶液 中の予想される被分析物濃度を、元の試験媒質を適当に希釈することにより好ま しい範囲にすることができる。

以上、方法原理を明らかにするため、主としてグラフの作成及び検討に基づく類 選択法を説明した。相関関係、最小二乗法などを利用してこのような作業をコン ピュータ処理に置き換える方法は公知である。

特に類選択のため、完全には互いに共存しないアプローチを大幅に折衷しなけれ ばならない場合、公知の多変分析技術を利用することにより容易に解決できるこ とが多い。種々の制約を折衷して、所定の条件を満たす一連の類限定を得るよう な］ンビュータ・プログラムは容易に入手できる。

ところが、選択された類の感度を絶対最適化処理をしなくても公知技術に比較し てはるかにすぐれた成果が得られる。選択の過程で多くの折衷が行なわれる場合 もあり得るが、それでも、すべての凝集物を単に合計するよりもはるかに好まし い形で測定すべき可変値に応答するパラメータに基づいて分析を行なうことがで きる。

特定の抗原及び抗体によるこのような初期調査に続いて行なわれる同じ物質によ る定常分析は、凝集物サイズの比較的少数を比較的少ない回数に亘って測定する だけで達成されるのが普通である。即ち、多くの場合、比較的広範囲の予備デー タに照らして最終的に選んだパラメータ値としては、単一サイズ範囲及び単一測 定タンミングだけで充分である。所要の初期反応物濃度を高感度で反映するよう に選択されたものであるだけに、このように狭く限定したパラメータでも、従来 のように一塊となったすべてのサイズの凝集物を測定することで得られるよりも もっと正確な、信頼ｊるに足る定量分析が可能である。

明解さを期して、主として凝集物リーイズによって類が限定される場合に関して 以上に説明したが、その他のパラメータまたはパラメータ群または各種パラメー タの組合わせの関係を同様に検討することによって、これらのパラメータの任意 の数値範囲で限定される好ましい凝集物の類を識別することも可能である。この ようなパラメータは個々の凝集物について測定可能なほとんどすべての性質、例 えば比容積、吸光度または光散乱度、密度または電気的性質と関連することがで きる。

いくつかの異なる凝集物パラメータを複数回に亘って測定することで多様な凝集 物類をめ、試験結果ど標準結果を比較するためにこれらの類から１つまたは２つ 以上の類を選択すればよい。測定のためこのような類を若干数選択する場合、各 類に独自の試験結果を処理することにより、必ずしも独立ではなくても被分析物 濃度分析値を分離づるようにコンピュータをプログラムするのが酋通である。多 くの場合、これらの分析値を適当に重み（＝ｊりして平均し、精度も信頼度も高 い総合的な分析結果を術る。

いくつかの異種のパラメータの特殊関数、または単一パラメータの、例えば異な る時点で測定された異なる値の関数に基づいて凝集物の類を限定Ｊることもでき る。

このような類を選択づる場合、測定パラメータ値を処理することにより、試験被 分析物で得られた関数の試験値を計算し、これを適当な標準物質による測定から 得られた同じ関数の適当な標準値と比較する。例えば、試験反応開始後数回に亘 って得られたパラメータ測定値を処理することにより、このパラメータの変化率 をめる。この変化率値の任意の範囲が被分析物濃度の尺度として利用できる凝集 物の類を限定する。

異なる時点におけるこのようなパラメータ測定及び／または関数誘導の結果は適 当な時点に挿入したり、実際の測定時間枠を越えｌζ時点、例えばゼロまたはそ の他の早い時点、またはその時点を過ぎればもはヤ）顕著な変化が起こらない実 質的には無限の時点に外挿したりすることができる。類限定関数の他の例として 、各凝集物の最大測定径及び最小測定径のような２つの異なるパラメータ比値の 任意の範囲によって凝集物の類を限定Ｊることができる。このようにめられた試 験バラン〜りの計綽値が類限定範囲内にあるＪ、うな凝集物の個数を、既知標準 量の被分析物との反応から同様にしで得られた同じ関数の数値群の標準値からめ られｌこ対応の凝集物個数と比較する。

以上に述べたように一コンビコータにＪ、っＣ標準反応を検討する方式の他の利 点は、特定数の凝集物カラン１へまたはその他の類限定値がほとんど、または全 く現われない動作状態を検知できることにある。このような情報に基づいて装置 の正常な動作をヂエツクできる。即ち、通常の試験においては、はとんど現われ るはずのない類限定値に相当するカウントをモニターして誤動作らしいことを指 示づる信号を発するように］ンビコータをプログラム１−る。

被分析物を定量する場合、分析のため選択する凝集物の類個数に冗長度を持たせ る万がしばしば有用である。

特に、特定の濃度範囲などのような条件に対して、一定範囲の類限定パラメータ が充分な感度を示すことが判明すれば、この範囲によって限定される類だけでな く、比較的低い濃度域に対して最大感度を示す類及び比較的高い濃度域に対して 最大感度を示す類をも選択する上で、冗長度を持たせることが有用であることが 多い。このように冗長な類を含むように測定及びｎ１幹を広げることにより、比 較的低い濃度範囲と比較的高い濃度範囲における凝集度を考慮に入れ、凝集度の 測定を、従って被分析物の定量を、このようなデータが利用されない場合よりも 正確に達成することができる。

分析の標準品 本発明に関連した比較標準品の調製及び利用方法は各種の生物学的評価において 既に公知のものと基本的には変らない。しかし、いくつかの要点を明確にすると 共に誤解を避りる目的で以下にその大要を説明する。

要覆るに、標準溶液中にも既知濃度で存在している試験溶液中の抗原の濃度を、 ラテックスのような適当な物質の粒子に結合させである特定抗体との関係におい て分析するのが課題であり、多くの場合、抗体懸濁液の部分標本を、単数または 複数濃度の試験溶液と反応させることによって試験懸濁液を調製し、さらに前記 抗体懸濁液の部分標本を一連の既知濃度の標準抗原を含有する標準溶液と反応さ せることによって標準懸濁液を調製する。

試験及び標準懸濁液をいずれも培養し、培養開始から対応の時点で走査または測 定する。その結束前られる試験及び標準懸濁液からの信号を対応の態様で処理づ ることによって試験値及び標準値を得る。ここに使用する″対応の″という詔は 意図的に変化させる場合を除ぎすべての条件がほとんど等しいか、または効果に おいて等価であることを意味する。この条件には配合、測定時間のはか、粒子サ イズ、ｐＨ，塩濃度、温度、液中にその仙の物質が存在する可能性などの要因が 含まれる。最後に挙げた要因が含まれる場合には別に特殊な対照を含めることが 必要になる。

このような条件下では、測定及び比較のために選択された類とは異なる単数また は複数の凝集物パラメータの互いに直接比較可能な試験値及び標準値が得られる 。この測定パラメータ値から、各類の凝集物個数がめられる。この凝集物カウン トは凝集度を測定するための基本情報であり、被分析物の定量を可能にする。

試験反応における選択された各類の凝集物の個数を標準反応における対応の個数 と直接比較する力旭、またＣよノ＼ラメータ値から誘導される適当な関数に基づ （１て比較すればよい。例えば、この関数は特定類の凝集物個数の経時変化率で ある場合が考えられ、その場合、被分析物濃度の尺度としての対応の標準凝集物 個数の経時変化率と比較されることになる。その他のパラメータを試験反応にお いても標準反応においても一定に維持される力旭、またはその変化がしかるべき 計算において配慮されるなら、前記関数は前記その他のパラメータにも依存する 。このような関数は元のパラメータ値を比較するための手段または直接比較され る誘導パラメータと考えることができる。請求の範囲に記載されている例え＆ま 任意のサイズの凝集物個数の試験値及び標準値の比較【まこのような個数の適当 な関数の比較及び個数そのものの比較を含むものである。

試験値と規準値の比較は実際には任意の適当な態様で実施すればよく、ここでは 詳細な説明を省く。最も簡単な形式では分析すべき物質のパラメータの量に応じ た選択パラメータの標準値をグラフに作成し、この曲線上にあって試験データと 一致する点を見つける。

標準化操作に使用される標準曲線は凝集物の類選択に関連して上述した凝集物パ ラメータと被分析物濃度の関係を示す標準グラフの成るものと似ている。即ち、 いずれも場合によっては同じ反応からめることができる。

ただし、類選択にはもつと広範囲の被分析物濃度及び測定値を必要とするのが普 通であり、標準化曲線は実際の試験反応と並行して進行する反応から作成するこ とが好ましい。従って、事実士別々の反応及び曲線を２つの目的に使用すること になる。

分析すべき試験物質が最初から溶液中に存在する場合、分析結果は溶液の単位容 積当りのモルまたはマイクロダラムのような適当な単位による試験溶液中の被分 析物初期濃度として表わされるのが普通である。試験物質が反応によって凝集状 態となる粒子の表面に最初から存在する場合、分析によって測定された試験物質 の量は分析標準化に使用される標準懸濁液中に存在する物質量を限定することの できる任意の形で表わせばよい。

従って、粒子の単位個数または例えば粒子の単位質量、または懸濁液の単位容積 当り既知量の試験反応物を含有する標準液が得られるなら、分析結果を対応の単 位で表わすのが最も便利である。細胞表面における抗原部位のような天然細胞の 性質は標準抗血清の有効濃度に基づいて定量することができ、また、抗体が前記 の１発明の概要」において述べたような粒子と結合している場合には感作された この粒子の標準懸濁液に基づいて定量することができる。

少なくとも３種類の反応物が関与する間接凝集及び凝集抑制による分析では、い くつかの異なる量の少なくとも被分析物質を利用し、標準量の前記３種類から対 応の態様で得た標準値と比較する。

本発明の伯の特徴として、凝集度を高める反応物の作用を測定づることにより、 高感度反応物に関して溶液を分析することができる。例えば、補体関係の抗体を 支持している一定量の粒子懸濁液を試験溶液と反応させることにより、また、粒 子懸濁液と直接反応さぜる場合なら微量の、しかし測定可能な標準凝集を形成す るに充公な一定量の抗原溶液と反応させることにより、抗原について試験溶液を 分析することができる。試験溶液中に抗原が存在すれば、凝集形成に寄与する抗 原総量が増え、適当な条件下では標準凝集度を比較的高いパーセントだけ増大さ せる。以上に述べた改良分析法で全体的な凝集度を測定する場合、この分析のた めの凝集物の適正な類選択により、測定感度をさらに高めることができる。

本発明ではまた、多数の被分析物が少なくとも２つの独立抗原部位（エピトープ ）を示すという事実を利用する。特定の結合部位に対して抗体を形成するメカニ ズムは公知であり、このメカニズムの一部が最近Ｊ、Ｇ、５ＬＩｔＣ１ｉｆｆｅ 等によりＳ　Ｃ１ｅｎＧｅ、２１９，６６０　（１９８３年）に発表された。こ のような物質を具体的に分析する新しい技術ではトレーサとして放射性物質が利 用される。

本発明は放射性物質を使用けず、２つの独立部位を利用することによって特異性 を完全に保持できるという重大な利点を有する新しい間接凝集方式でこのような 多重部位被分析物の分析を可能にする。

本発明の実施態様では、被分析物の１つの特定部位に対する抗体を適当な不溶性 粒子と結合する。試験被分析物を添加すると、粒子と結合している抗体と結合す るが凝集しないのが普通である。反応は過剰の抗体中で行なわれることが好まし い。

被分析物の第２部位に固有の第２抗体を添加すると凝集が起こる可能性がある。

凝集が起こったら、好ましくは以上に述べたようにこれを定量する。この段階で 凝集が起こらなければ、第２抗体に対して特異性を有する抗折体を添加すること によって凝集させる。

こうして形成された凝集は第２抗体によるものか抗折体によるものかに関係なく 、好ましくは以上に述べた改良式分析法によって定量し、同様にして調製された 標準品と比較することにより、試験溶液中の被分析物の初期濃度をめる。

従って、本発明のこの特徴によれば、試験分子の２つの独立反応部位におＩする ニニ重の特異性が関与するから、従来よりも高い信頼度で試験物質を識別できる 定量凝集度測定法が提供される９、定量凝集度測定法を採用すれば、多くの場合 望ましくない放射性物質の使用を回避できるから、現在使用されている放９Ａ標 識免疫検定ン去よりもはるかに右利である。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和５９年１２月２６日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８４１００３７４ ２、発明の名称 免疫反応物質等の分析法 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国、９１１０５　カリフォルニア州、パサデナ、ラス　パル マス　ロート８４５氏名　アラジェム、フレデリック　ジ〕−イ。

住所　アメリカ合衆国、９１１０５　カリフォルニア州、パザデナ、ラス　パル マス　ロート８４５氏名　アニンカー、パドマシニ　ケイ。

４、代理人 東京都新宿区下落合二丁目１４番１号 請　請求　の　範　囲 １、不溶性キャリア粒子上に存在する第１物質とこれと補体関係にある第２物質 との反応による粒子の凝集度の分析法において、前記物質の反応による粒子凝集 物に対応して、凝集物カウントが全体的な凝集度を特に敏感に反映する少なくと も１つの限られた類の凝集物を識別し、分析すべき反応による個々の粒子凝集物 を測定することによって前記類を表わす各測定凝集物に対する電気的類信号を発 生さゼ、前記信号を処理でることによって各識別された類の凝集物個数をめ、得 られた個数を凝集度の尺度として使用することを特徴とする粒子凝集度の分析法 。

２、前記類が限られた凝集物パラメータ範囲によって限定され、前記信号がこの パラメータの値を表わづ請求の範囲第１項に記載の方法。

３、前記類が凝集物の形状の尺度を表わす限られたパラメータ範囲によって限定 され、前記信号がこのパラメータの値を表わす請求の範囲第１項に記載の方法。

４、前記類が凝集物υイズの尺度を表わす限られたパラメータ範囲によって限定 され、前記信号がこのパラメータの値を表わす請求の範囲第１項に記載のｈ払。

５、前記粒子凝集物測定が、特徴的な凝集物を含む光学的領域を自動走査するこ とによってそれぞれの領域要素に対応する電気信号を発生させると共に粒子によ って占有された領域要素に対応する粒子信号を弁別し、各群のすべての信号が同 じ凝集物と連携する粒子信号群を識別し、各信号群から、識別された凝集物の類 を表ねづ類信号を形成する段階を含む請求の範囲第１項に記載の方法。

６、前記粒子凝集物測定が、凝集物懸濁液の一部を誘導して狭い領域を通過させ 、各凝集物がこの狭い領域を通過するのに呼応して、識別された凝集物の類を表 ゎジー類信号が発生するようにする段階を含む請求の釦囲第１項に記載の方法。

７、前記粒子凝集物測定を複数の時点において行ない、前記類信号を処理するこ とによって前記測定時点のそれぞれにお（プるそれぞれの識別された類の凝集物 個数をめる請求の範囲第１項に記載の方法。

８、前記粒子凝集物測定を複数の時点において行ない、前記類信号を処理するこ とによって凝集度の尺度としてそれぞれの識別された類の凝集物個数の経時変化 率をめる請求の範囲第１項に記載の方法。

９．前記凝集物測定を前記反応がほぼ平衡に達した後に行なう請求の範囲第１項 に記載の方法。

１０、前記物質の１つが抗原であり、他の前記物質が前記抗原に固有の抗体であ る請求の範囲第１項に記載の方法。

１１、前記物質の１つが炭水化物であり、他の前記物質が炭水化物と補体関係に あるレクチンである請求の範囲第１項に記載の方法。

１２、前記物質の１つが天然細胞に特殊な態様で存在するか、または人造粒子に 結合さゼたレセプタであり、他の前記物質がレセプタζ固有の反応を示す配位子 である請求の範囲第１項に記載の方法。

１３、前記第１物質を帯びる粒子が天然細胞であり、前記物質が双方共に不溶性 粒子上に存在する請求の範囲第１項に記載の方法。

１４、前記物質の１つがその濃度を分析すべき液状媒質中に最初から存在する試 験物質であり、前記凝集物の類識別段階が、異なる既知量の試験物質を他の物質 の部分量と反応させる段階と、各に応ごとに得られた個々の粒子凝集物を測定し 、測定結果を処理することによって類中の凝集物個数が前記液状媒質中の試験物 質の量に比較的敏感に依存するような単数または複数の敏感な凝集物類を識別す る段階と、このようにして識別された少なくとも１つの凝集物類を凝集度の分析 のために選択する段階とを含む請求の範囲第１項に記載の方法。

１５、複数時点において前記粒子凝集物を測定し、測定結果を処理することによ って各測定時点ごとに少なくとも１つの敏感な凝集物類を識別し、このように識 別された少なくとも１つの類及びこれと連携の測定時点を凝集度の分析のために 選択する段階を含む請求の範囲第１４項に記載の方法。

１６、前記第１及び第２物質の反応が前記キャリア粒子の凝集を伴なわずに両者 を結合し、得られた反応生成物を前記第２物質と補体関係にある他の物質と接触 させることによって前記粒子凝集を発生させる段階を含む請求の範囲第１項に記 載の方法。

１７、前記他の物質と接触させる前に前記反応生成物を非反応成分から隔離する 段階を含む請求の範囲第１６項に記載の方法。

１８、補体関係にある物質と特殊な態様で反応して不可溶粒子を凝集させる試験 物質を、前記物質の１つが粒子表面に存在する状態で分析する方法において、補 体物質を試験物質と反応させることによって連携の粒子を凝集させ、この反応に よる個々の凝集物を測定することによって少なくとも１つの任意の限られた類の 凝集物の個数をめ、こうしてめられた凝集物個数を、既知標準量の前記物質の反 応により対応の態様で得られた標準凝集物個数と比較することによって前記試験 物質の量をめることを特徴とする分析法。

１９、前記標準凝集物個数を得る方法が、異なる既知量標準量の試験物質を前記 補体物質の部分量と反応させることによってその表面に前記１つの物質が存在す る粒子を凝集させる段階と、この反応による凝集物を請求の範囲第１８項と対応 の態様で測定することによってこれらの各反応ごとに前記任意の類の凝集物個数 をめる段階とを含む請求の範囲第１８項に記載の方法。

２０、前記任意の凝集物の類が、該類の凝集物個数が前記試験物質の量の比較的 敏感な関数であるような類である請求の範囲第１８項に記載の方法。

２１、前記凝集物測定が、複数類のそれぞれに属する凝集物個数をめる段階を含 ゛み、少なくとも２つの類の凝集物個数がそれぞれ異なる前記量範囲における前 記試験物質の量の敏感な関数である請求の範囲第１８項に記載の方法。

２２、前記任意の凝集物類が、前記類における凝集物個数が前記試験物質の量の 比較的敏感な関数であるような限られたサイズ範囲内のサイズを有する凝集物か ら成る請求の範囲第１８項に記載の方法。

２３、前記凝集物測定が、複数の異なるサイズ範囲のそれぞれに該当するサイズ の凝集物の個数をめる段階と、各サイズ範囲ごとにめられた凝集物個数を対応の サイズ範囲の標準凝集物個数と比較することによって試験物質量の値をめる段階 を含む請求の範囲第１８項に記載の方法。

２４、前記凝集物測定が複数時点におりる測定を含む請求の範囲第１８項に記載 の方法。

２５、前記凝集物測定が複数時点において測定し、各時点で測定された凝集物個 数を適当な時点に挿入または外挿するか、またはその時点を過ぎると顕著な変化 が起こらない事実上の無限時点に外挿する段階を含み、前記凝集物個数の比較を 前記挿入または外挿された凝集物個数値に基づいて行ない、この個数値を標準量 の物質の反応によって得られる対応の凝集物個数値と比較することによって試験 物質に関する値をめる請求の範囲第１８項に記載の方法。

２６、前記凝集物測定が複数時点において測定して任意の限られた類の凝集物個 数変化率をめる段階を含み、前記凝集物個数の比較を前記変化率値に基づいて行 ない、この変化率値を標準量の物質の反応で得た対応の標準変化率値と比較する ことによって試験物質の量に対応する値をめる請求の範囲第１８項に記載の方法 。

２７、前記試験物質が蛋白質またはその伯の免疫化学反応物質であり、補体物質 が試験物質と特殊な態様で反応づ−る抗体である請求の範囲第１８項に記載の方 法。

２８、前記試験物質が前記補体物質に対する抗体であり、前記補体物質が既知の 天然細胞上に存在するか、または抗体の検出及び定量のＩζめの人造粒子と結合 している既知抗原である請求の範囲第１８項に記載の方法。

２９、前記試験物質が天然細胞の表面に存在する抗原または抗原部位であり、補 体物質が例えば赤血球、白血球、微生物またはその他の天然細胞を定量類別する ための、細胞抗原に対して既知の特異性を有する抗体である請求の範囲第１８項 に記載の方法。

３０、前記抗体が不溶性粒子上に存在する請求の範囲第２９項に記載の方法。

３１、前記試験物質が蛋白質または配位子であり、補体物質が試験物質と特殊な 態様で反応し、且つ天然細胞上に特殊な態様で存在するかまたは人造粒子と結合 しているレセプタである請求の範囲第１８項に記載の方法。

３２、前記試験物質がレクチンであり、他の物質が天然細胞上に存在する炭水化 物であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。

３３、異なる既知量の試験物質と前記神体物質の部分量とを反応させることによ って前記粒子を凝集さけ、得られた凝集物の分布を単数または複数のイｆ意の凝 集物パラメータに関して測定し、得られた分イＤを処理づることによって凝集物 個数が試験物質の初期量に比較的敏感に依存する前記パラメータの単数または複 数の敏感４１節回合識別し、前記任意の限られた類を限定するため少なくとも１ つの前記敏感なパラメータ範囲を選択Ｊる請求の範囲第１８項に記載の方法。

３４、前記選択された凝集物パラメータが凝集物サイズの尺度であり、前記凝集 物分布が凝集物サイズ分布であり、前記選択されたパラメータ範囲がサイズ範囲 であり、前記凝集物類が前記サイズ範囲内のサイズを有する凝集物から成る請求 の範囲第３３項に記載の方法。

３５、前記凝集物分布を複数時点で測定する請求の範囲第３３項に記載の方法。

３６、前記凝集物分布を処理することによって、前記選択された類の凝集物個数 が経時的に比較的安定であるような測定時点を識別する請求の範囲第３５項に記 載の方法。

３７、前記凝集物分布を処理することによって、前記類の凝集物個数が試験物質 初期量の変化に比較的敏感に呼応するような測定時点及びこれと連携の前記パラ メータの値範囲を識別する請求の範囲第３５項に記載の方法。

３８、前記選択された凝集物パラメータが凝集物サイズの尺度である請求の範囲 第３７項に記載の方法。

３９、前記試験物質量のそれぞれに対応して少なくとも１つの敏感なパラメータ 範囲を識別し、前記分析のため、分析される試験物質の予想される量範囲のほぼ 全域を通して敏感な少なくとも１つのパラメータ範囲を選択覆る段階を含む請求 の範囲第３３項に記載の方法。

４０、前記試験物質と前記補体物質の反応が前記キャリア粒子の凝集をほとんど 伴なわずに両者を結合し、反応生成物を前記補体物質と補体関係にある他の物質 と接触させることによって前記粒子を凝集させる段階を含む請求の範囲第１８項 に記載の方法。

４１、前記他の物質と接触させる前に前記反応生成物を非反応成分から隔離する 段階を含む請求の範囲第４０項に記載の方法。

４２、前記試験物質が天然細胞上に存在する抗原または抗原部位であり、前記補 体物質が試験物質に固有の抗体であり、前記他の物質が前記抗体に固有の抗抗体 である請求の範囲第４０項に記載の方法。

４３、前記試験物質が天然細胞上に存在する炭水化物であり、前記神体物質が試 験物質に固有のレクチンであり、前記他の物質がレクチンまたはレクチンと反応 する炭水化物弁に対する抗体である請求の範囲第４０項に記載の方法。

４４、前記試験物質が反応混合物中に凝集を起こさない抗体であり、前記補体物 質が天然細胞上に存在するがまたは人造粒子と結合していて試験物質と特殊な態 様で反応する抗原または抗原部位であり、前記他の物質が抗抗体である請求の範 囲第４０項に記載の方法。

４５、前記試験物質が天然細胞上に存在するかまたは人造粒子と結合しているレ セプタであり、前記補体物質がレセプタに固有の配位子であり、前記他の物質が 配位子と特殊な態様で反応するレセプタ、抗配位子抗体またはレクチンである請 求の範囲第４０項に記載の方法。

４６、前記試験物質が天然細胞上に存在するかまたは人造粒子と結合している抗 体であり、前記補体物質が試験物質に固有の抗原または配位子であり、前記他の 物質が抗原または配位子に対する抗体である請求の範囲第４０項に記載の方法。

４７、前記類を凝集物サイズの尺度を表わす限られたパラメータ範囲によって限 定する請求の範囲第４０項に記載の方法。

４８、前記試験物質を前記粒子と結合している過剰量の抗体と反応させ、反応完 了後、反応生成物を試験物質に対する溶解抗体と接触させることによって粒子を 凝集させる請求の範囲第４０項に記載の方法。

４９、試験溶液を、溶解状態の補体物質と特殊な態様で反応する溶液中の試験物 質量について粒子凝集抑制によって分析する方法において、前記試験溶液の一部 と前記補体物質の限られた量とを接触させることによって両物質の分子を結合さ せ、得られた反応生成物を不溶粒子と結合させた試験物質と接触ぎせることによ って、前記結合している試験物質と未反応の補体物質との反応による前記粒子の 凝集を起こさせ、この凝集による個々の凝集物を測定することによって任意の限 られた類の凝集物個数をめ、こうしてめられた凝集物個数を既知標準量の前記物 質の同様の反応で得られた標準凝集物個数と比較することによって前記試験溶液 中の試験物質の量をめることを特徴とする分析法。

５０、前記試験物質が薬剤、配位子またはホルモンであり、前記補体物質が試験 物質に固有の抗体またはレセプタである請求の範囲第４９項に記載の方法。

５１、補体物質と特殊態様で反応する試験物質を粒子凝集促進によって分析する 方法において、不溶粒子と結合している前記補体物質の一定量の懸濁液を、試験 物質サンプル及びもし前記懸濁液と直接反応すると軽微ながら測定可能な凝集を 起こすのに充分な一定量の追加試験物質と反応させ、この反応による凝集度を測 定し、測定結果を標準量の前記物質の対応の反応による凝集度の標準測定値と比 較することによって前記試験物質の初期量をめることを特徴とする分析法。

５２、前記凝集度測定が、個々に形成された凝集物を測定することによって、凝 集物個数が前記試験物質の量を特に敏感に反映するような任意の限られた類の凝 集物の個数をめる段階を含む請求の範囲第５１項に記載の方法。

５３、少なくとも２つの異なる抗体と特殊態様で反応する溶解状態の試験物質を 間接凝集によって分析する方法において、試験物質を不溶粒子と結合している第 １抗体と反応させ、反応生成物を溶解状態の第２抗体と反応させ、その結果生ず る凝集を前記試験物質の初期濃度の尺度とし定量することを特徴とする分析法。

５４、前記凝集度定量に先立って、第２の前記反応の反応生成物を第２抗体に対 して特異性を有する抗体と反応させる段階を含む請求の範囲第５３項に記載の方 法。

５５、前記定量が、個々に形成した凝集物を測定することによって、凝集物個数 が前記試験物質の濃度を特に敏感に反映するような任意の類の凝集物個数をめる 段階を含む請求の範囲第５３項に記載の方法。

国、際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．不溶性キャリア粒子上に存在する第１物質とこれと補体関係にある第２物質 との反応による粒子の凝集度の分析法において、前記物質の反応による粒子凝集 物に対応して、凝集物カウントが全体的な凝集度を特に敏感に反映する少なくと も１つの限られた類の凝集物を識別し、分析すべき反応による粒子凝集物を測定 することによって前記類を表わづ電気的類信号を発生させ、前記信号を処理する ことによって各類の凝集物個数をめ、肖られた個数を凝集度の尺度として使用す ることを特徴とする粒子凝集度の分析法。 ２、前記類が限られた凝集物パラメータ範囲によって限定され、前記信号がこの パラメータの値を表わす請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記類が凝集物の形状の尺度を表わ寸限られたパラメータ範囲によって限定 され、前記信号がこのパラメータの値を表わづ請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記類が凝集物サイズの尺度を表わす限られたパラメータ範囲によって限定 され、前記信号がこのパラメータの値を表わす請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、前記粒子凝集物測定が、特徴的な凝集物を含む光学的領域を自動走査するこ とによってそれぞれの領域要素に対応する電気信号を発生させると共に粒子によ って占有された領域要素に対応する粒子信号を弁別し、各群のすべての信号が同 じ凝集物と連携する粒子信号群を識別し、各信号群から、識別された凝集物の類 を表ねづ角信号を形成する段階を含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、前記粒子凝集物測定が、凝集物懸濁液の一部を誘導して狭い領域を通過させ 、各凝集物がこの狭い領域を通過するのに呼応して、識別された凝集物の類を表 ね寸類信号が発生ずるようにづる段階を含む請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、前記粒子凝集物測定を複数の時点において行ない、信号を処理することにに って前記測定時点のそれぞれにお（プるそれぞれの識別された類に含まれる凝集 物個数をめる請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、前記粒子凝集物測定を複数の時点において行ない、信号を処理することによ って凝集度の尺度としてそれぞれの識別された類に含まれる凝集物個数の経時変 化率をめる請求の範囲第１項に記載の方法。 ９、前記凝集物測定を前記反応がほぼ平衡に達した後に行なう請求の範囲第１項 に記載の方法。 １０、前記物質の１つが抗原であり、他の前記物質が前記抗原に固有の抗体であ る請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、前記物質の１つが炭水化物であり、他の前記物質が炭水化物と補体関係に あるレクチンである請求の範囲第１項に記載の方法。 １２、前記物質の１つが天然細胞に特殊な態様で存在するか、または人造粒子に 結合させたレセプタであり、他の前記物質がレセプタと固有の反応を示す配位子 である請求の範囲第１項に記載の方法。 １３、前記第１物質を帯びる粒子が天然細胞であり、前記物質が双方共に不溶性 粒子上に存在する請求の範囲第１項に記載の方法。 １４、前記物質の１つがその濃痩を分析すべき液状媒質中に最初から存在する試 験物質であり、前記凝集物の類識別段階が、異なる既知量の試験物質を他の物質 の部分量と反応させる段階と、各反応ごとに得られた粒子凝集物を測定し、測定 結果を処理することによって類中の凝集物個数が前記液状媒質中の試験物質の量 に比較的敏感に依存するような単数または複数の敏感な凝集物類を識別する段階 と、このようにして識別された少なくとも１つの凝集物類を凝集度の分析のため に選択する段階とを含む請求の範囲第１項に記載の方法。 １５、複数時点において前記粒子凝集物を測定し、測定結果を処理することによ って各測定時点ごとに少なくとも１つの敏感な凝集物類を識別し、このように識 別された少なくとも１つの類及びこれと連携の測定時点を凝集度の分析のために 選択する段階を含む請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６、前記第１及び第２物質の反応が前記キャリア粒子の凝集を伴なわずに両者 を結合し、得られた反応生成物を前記第２物質と補体関係にある他の物質と接触 させることによって前記粒子凝集を発生さゼる段階を含む請求の範囲第１項に記 載の方法。 １７、前記仙の物質と接触させる前に前記反応生成物を非反応成分から隔離する 段階を含む請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８、補体関係にある物質と特殊な態様で反応して不可溶粒子を凝集させる試験 物質を、前記物質の１つが粒子表面に存在する状態で分析する方法において、補 体物質を試験物質と反応させることによって連携の粒子を凝集させ、この反応に よる凝集物を測定することによって少なくとも１つの任意の限られた類の凝集物 の個数をめ、こうしてめられた凝集物個数を、既知標準量の前記物質の反応によ り対応の態様で得られた標準凝集物個数と比較することによって前記試験物質の 量をめることを特徴とする分析法。 １９、前記標準凝集物個数を得る方法が、異なる既知量標準量の試験物質を前記 補体物質の部分量と反応させることによってその表面に前記１つの物質が存在す る粒子を凝集させる段階と、この反応による凝集物を請求の範囲第１８項と対応 の態様で測定することによってこれらの各反応ごとに前記任意の類の凝集物個数 をめる段階とを含む請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２０、前記任意の凝集物の類が、該類の凝集物個数が前記試験物質の量の比較的 敏感な関数であるような類である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２１、前記凝集物測定が、複数類のそれぞれに属する凝集物個数をめる段階を含 み、少なくとも２つの類の凝集物個数がそれぞれ異なる前記量範囲における前記 試験物質の量の敏感な関数である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２２、前記任意の凝集物類が、前記類における凝集物個数が前記試験物質の量の 比較的敏感な関数であるような限られたサイズ範囲内のサイズを有する凝集物か ら成る請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２３、前記凝集物測定が、複数の異なるサイズ範囲のそれぞれに該当するサイズ の凝集物の個数をめる段階と、各サイズ範囲ごとにめられた凝集物個数を対応の サイズ範囲の標準凝集物個数と比較することによって試験物質量の値をめる段階 を含む請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２４、前記凝集物測定が複数時点における測定を含む請求の範囲第１８項に記載 の方法。 ２５、前記凝集物測定が複数時点において測定し、各時点で測定された凝集物個 数を適当な時点に挿入または外挿するか、またはその時点を過ぎると顕著な変化 が起こらない事実上の無限時点に外挿する段階を含み、前記凝集物個数の比較を 前記挿入または外挿された凝集物個数値に基づいて行ない、この個数値を標準量 の物質の反応によって得られる対応の凝集物個数値と比較することによって試験 物質に関する値をめる請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２６．前記凝集物測定が複数時点において測定して任意の限られた類の凝集物個 数変化率をめる段階を含み、前記凝集物個数の比較を前記変化率値に基づいて行 ない、この変化率値を標準量の物質の反応で得た対応の標準変化率値と比較する ことによって試験物質の量に対応する値をめる請求の範囲第１８項に記載の方法 。 ２７、前記試験物質が蛋白質またはその伯の免疫化学反応物質であり、補体物質 が試験物質と特殊な態様で反応する抗体である請求の範囲第１８項に記載の方法 。 ２８、前記試験物質が前記補体物質に対する抗体であり、前記補体物質が既知の 天然細胞上に存在するか、または抗体の検出及び定量のための人造粒子と結合し ている既知抗原である請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２９、前記試験物質が天然細胞の表面に存在づる抗原または抗原部位であり、補 体物質が例えば赤血球、白血球、微生物またはその他の天然細胞を定量類別する ための、細胞抗原に対して既知の特異性を有する抗体である請求の範囲第１８項 に記載の方法。 ３０、前記抗体が不溶性粒子上に存在する請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１、前記試験物質が蛋白質または配位子であり、神体物質が試験物質と特殊な 態様で反応し、且つ天然細胞上に特殊な態様で存在するがまたは人造粒子と結合 しているレセプタである請求の範囲第１８項に記載の方法。 ３２、前記試験物質がレクチンであり、他の物質が天然細胞上に存在する炭水化 物であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の方法。 ３３、異なる既知量の試験物質と前記補体物質の部分量とを反応させることによ って前記粒子を凝集させ、得られた凝集物の分布を単数または複数の任意の凝集 物パラメータに関して測定し、得られた分布を処理づることによって凝集物個数 が試験物質の初期量に比較的敏感に依存する前記パラメータの単数または複数の 敏感な範囲を識別し、前記任意の限られた類を限定づるため少なくとも１つの前 記敏感なパラメータ範囲を選択づ−る請求の範囲第１８項に記載の方法。 ３４、前記選択された凝集物パラメータが凝集物サイズの尺度であり、前記凝集 物分布が凝集物υイズ分布であり、前記選択されたパラメータ範囲がサイズ範囲 であり、前記凝集物類が前記サイズ範囲内のサイズを有する凝集物から成る請求 の範囲第３３項に記載の方法。 ３５、前記凝集物分布を複数時点で測定する請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３６、前記凝集物分布を処理することによって、前記選択された類の凝集物個数 が経時的に比較的安定であるような測定時点を識別する請求の範囲第３５項に記 載の方法。 ３７、前記凝集物分布を処理することによって、前記類の凝集物個数が試験物質 初期量の変化に比較的敏感に呼応するような測定時点及びこれと連携の前記パラ メータの値範囲を識別する請求の範囲第３５項に記載の方法。 ３８、前記選択された凝集物パラメータが凝集物サイズの尺瓜である請求の範囲 第３７項に記載の方法。 ３つ、前記試験物質量のそれぞれに対応して少なくとも１つの敏感なパラメータ 範囲を識別し、前記分析のため、分析される試験物質の予想される量範囲のほぼ 全域を通し−Ｃ敏感な少なくと−ｂ１つのパラメータ範囲を選択りる段階を含む 請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４０、前記試験物質と前記神体物質の反応が前記キャリア粒子の凝集をほとんど 伴なわずに両者を結合し、反応生成物を前記補体物質と補体関係にある他の物質 と接触させることによって前記粒子を凝集させる段階を含む請求の範囲第１８項 に記載の方法。 ４１、前記他の物質と接触させる前に前記反応生成物を非反応成分から隔離する 段階を含む請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４２、前記試験物質が天然細胞上に存在する抗原または抗原部位であり、前記神 体物質が試験物質に固有の抗体であり、前記他の物質が前記抗体に固有の抗抗体 である請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４３、前記試験物質が天然細胞上に存在する炭水化物であり、前記補体物質が試 験物質に固有のレクチンであり、前記他の物質がレクチンまたはレクチンと反応 する炭水化動弁に対する抗体である請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４４、前記試験物質が反応混合物中に凝集を起こさない抗体であり、前記神体物 質が天然細胞上に存在するがまたは人造粒子と結合していて試験物質と特殊な態 様で反応する抗原または抗原部位であり、前記他の物質が抗抗体である請求の範 囲第４０項に記載のプノｄ、。 ４５、前記試験物質が天然細胞上に存在づるがまたは人造粒子と結合しているレ セプタであり、前記補体物質がレセプタに固有の配位子であり、前記他の物質が 配位子と特殊な態様で反応するレセプタ、抗配位子抗体またはレクチンである請 求の範囲第４０項に記載の方法。 ４６．前記試験物質が天然細胞上に存在するかまたは人造粒子と結合している抗 体であり、前記補体物質が試験物質に固有の抗原または配位子であり、前記他の 物質が抗原または配位子に対する抗体である請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４７、前記類を凝集物サイズの尺度を表わす限られたパラメータ範囲によって限 定する請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４８、前記試験物質を前記粒子と結合している過剰量の抗体と反応させ、反応完 了後、反応生成物を試験物質に対する溶解抗体と接触させることによって粒子を 凝集させる請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４９、試験溶液を、溶解状態の補体物質と特殊な態様で反応する溶液中の試験物 質量について粒子凝集抑制によって分析する方法において、前記試験溶液の一部 と前記補体物質の限られた量とを接触させることによって両物質の分子を結合さ せ、得られた反応生成物を不溶粒子と結合させた試験物質と接触させることによ って、前記結合している試験物質と未反応の補体物質との反応による前記粒子の 凝集を起こさせ、この凝集による凝集物を測定することによって任意の限られた 類の凝集物個数をめ、こうしてめられた凝集物個数を既知標準量の前記物質の同 様の反応で得られた標準凝集物個数ｉ比較することによって前記試験溶液中の試 験物質の量をめることを特徴とする分析法。 ５０、前記試験物質が薬剤、配位子またはホルモンであり、前記補体物質が試験 物質に固有の抗体またはレセプタである請求の範囲第４９項に記載の方法。 ５１、補体物質と特殊態様で反応する試験物質を粒子凝集促進によって分析する 方法において、不溶粒子と結合している前記補体物質の一定量の懸濁液を、試験 物質サンプル及びもし前記懸濁液と直接反応すると軽微ながら測定可能な凝集を 起こすのに充分な一定量の追加試験物質と反応させ、この反応による凝集度を測 定し、測定結果を標準量の前記物質の対応の反応による凝集度の標準測定値と比 較することによって前記試験物質の初期量をめることを特徴とする分析法。 ５２、前記凝集度測定が、形成された凝集物を測定することによって、凝集物個 数が前記試験物質の吊を特に敏感に反映するような任意の限られた類の凝集物の 個数をめる段階を含む請求の範囲第５１項に記載の方法。 ５３、少なくとも２つの異なる抗体と特殊態様で反応する溶解状態の試験物質を 間接凝集によって分析する方法において、試験物質を不溶粒子と結合している第 １抗体と反応させ、反応生成物を溶解状態の第２抗体と反応させ、その結果生ず る凝集を前記試験物質の初期Ｉｔの尺度とし定量することを特徴とする分析法。 ５４、前記凝集度定量に先立って、第２の前記反応の反応生成物を第２抗体に対 して特異性を有する抗体と反応させる段階を含む請求の範囲第５３項に記載の方 法。 ５５、前記定量が、形成した凝集物を測定することによって、凝集物個数が前記 試験物質の濃度を特に敏感に反映するような任意の類の凝集物個数をめる段階を 含む請求の範囲第５３項に記載の方法。