JPS59195160A - 螢光多パラメ−タ粒子分析 - Google Patents
螢光多パラメ−タ粒子分析Info
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- JPS59195160A JPS59195160A JP59066009A JP6600984A JPS59195160A JP S59195160 A JPS59195160 A JP S59195160A JP 59066009 A JP59066009 A JP 59066009A JP 6600984 A JP6600984 A JP 6600984A JP S59195160 A JPS59195160 A JP S59195160A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は試料中の複数のパラメーター（ρａｒａ−ｍｅ
ｔｅｒ）を決定するだめの方法に関する。
ｔｅｒ）を決定するだめの方法に関する。
他の人間に輸血するだめの個人から得た全血に対する不
変の信頼性には、その血液群に関して多量の血液を監視
することが必要である。血液群を決定する際には、多く
の因子に焦点が当てられている：ＡＢＯ群における型、
７８０群の抗原に対する同種抗体の存在、及びＲｈ型。
変の信頼性には、その血液群に関して多量の血液を監視
することが必要である。血液群を決定する際には、多く
の因子に焦点が当てられている：ＡＢＯ群における型、
７８０群の抗原に対する同種抗体の存在、及びＲｈ型。
これらの因子の各々を独立に決定しなければならない場
合には多数の試験が行なわれる。多くの場合、厳しく且
つわずられしい種々の因子の測定には血液凝集試験が含
まれる。更に、それは簡単に自動化できず、従って技術
者が最小にでも係わって試験を簡単にするほかはない。
合には多数の試験が行なわれる。多くの場合、厳しく且
つわずられしい種々の因子の測定には血液凝集試験が含
まれる。更に、それは簡単に自動化できず、従って技術
者が最小にでも係わって試験を簡単にするほかはない。
それ故に血液型に必要な情報を精度良く報告しつつ、試
験数を最小にし、試験法を自動化せしめうる技術を見つ
けることは望ましい。
験数を最小にし、試験法を自動化せしめうる技術を見つ
けることは望ましい。
Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｉｎｔ 、Ｊ 、 Ｉ？７ａｎｕｎ
ｏ７ｙｈｃｔｒｒｎ、ａｃ 、 、 ３ （３） 。
ｏ７ｙｈｃｔｒｒｎ、ａｃ 、 、 ３ （３） 。
２４９〜２５４ （１９８］、 ）はフロー・シトメト
リー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ）による血液細
胞の免疫蛍光分析を記述している。蛍光ビーズの測定法
は、１３ｒｉｇｇＢら、５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２
、１２６６−１２６７ （１９８１） 及ＵＮｉｃｏｌ
ｉ Ｃ）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ。
リー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ）による血液細
胞の免疫蛍光分析を記述している。蛍光ビーズの測定法
は、１３ｒｉｇｇＢら、５ｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２
、１２６６−１２６７ （１９８１） 及ＵＮｉｃｏｌ
ｉ Ｃ）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ。
Ｔ’ｌ 、４９０４〜４９０８”’ （１９８０）に記
述されている。更に１９８２年７月１２日付は関連特許
願第３９７．２８ｓ号を参照のこと（この開示は、蛍光
細胞を測定するための他の技術を記述するものとして本
明細書に参考文献として引用される）。
述されている。更に１９８２年７月１２日付は関連特許
願第３９７．２８ｓ号を参照のこと（この開示は、蛍光
細胞を測定するための他の技術を記述するものとして本
明細書に参考文献として引用される）。
一般的な記述に関しては、ｌ？ｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔ
ｒ、ｙ ａｎｄＳｏｒｔｉｎｇ、 （Ｍｅｌａｍｅｄら
編） 、 Ｊｏｉｂｎ ｒＶｉｌｅｙ ＆５ｏｎｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７９年、を参照のこと。
ｒ、ｙ ａｎｄＳｏｒｔｉｎｇ、 （Ｍｅｌａｍｅｄら
編） 、 Ｊｏｉｂｎ ｒＶｉｌｅｙ ＆５ｏｎｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７９年、を参照のこと。
今回、バルク溶液中において、マルチパラメータの試料
を、限られたフロー（ｆｌ、ｏｗ ）又は分離を用いる
ことなしに、最小の試験数で分析するための方法と組成
物が提供される。本方法は粒子及び蛍光標識を用い、光
信号を分析媒体中の成分の指標として測定する。この技
術の使用例は、全血試料の１つの懸濁液の、ΔＢＯ群及
び同種抗体としての分類、及び特別なＡ、Ｂ、同種抗体
及びＲｈ因子の決定である。前者の決定は元の赤血球と
区別しうるＡ及びＢ表現型粒子を用いる。この場合蛍光
抗体が使用され、独立に測定される蛍光の測定値を問題
のパラメータと関連づける。
を、限られたフロー（ｆｌ、ｏｗ ）又は分離を用いる
ことなしに、最小の試験数で分析するための方法と組成
物が提供される。本方法は粒子及び蛍光標識を用い、光
信号を分析媒体中の成分の指標として測定する。この技
術の使用例は、全血試料の１つの懸濁液の、ΔＢＯ群及
び同種抗体としての分類、及び特別なＡ、Ｂ、同種抗体
及びＲｈ因子の決定である。前者の決定は元の赤血球と
区別しうるＡ及びＢ表現型粒子を用いる。この場合蛍光
抗体が使用され、独立に測定される蛍光の測定値を問題
のパラメータと関連づける。
本発明によれば、試料中の複数のパラメータを最小の試
験数で決定するだめの新規な方法及び組成物が提供され
る。この方法は、粒子及び１つ又はそれ以上の蛍光体の
使用及び少くとも２種の区別しうる信号の検知を含む。
験数で決定するだめの新規な方法及び組成物が提供され
る。この方法は、粒子及び１つ又はそれ以上の蛍光体の
使用及び少くとも２種の区別しうる信号の検知を含む。
同一の又は異なる有用な分光学的特性に基づき１回の測
定で決定される信号の数に依存して、２種の信号が２種
のパラメータを区別することができる。信号の数の増加
と共に、より多くのパラメータの数が決定できる。
定で決定される信号の数に依存して、２種の信号が２種
のパラメータを区別することができる。信号の数の増加
と共に、より多くのパラメータの数が決定できる。
一般に、ｎ個の信号で、２？Ｌ−１個のパラメータが区
別できる。普通には高々３つの信号を用いて４つのパラ
メータを決定する。
別できる。普通には高々３つの信号を用いて４つのパラ
メータを決定する。
この決定は、観察された信号がいき値から予じめ決めた
量だけ正又は負に異々るかどうかに関して１つの粒子を
検査することを含む。問題のパラメータに依存して、そ
のパラメータの存在又は不存在を規定する予じめ決めた
いき値以上又は以下の信号を有する粒子の集団が存在し
よう。パラメータはそれぞれ配位体及び受体のエピトー
プ部位及び特異的結合具の結合部位である。
量だけ正又は負に異々るかどうかに関して１つの粒子を
検査することを含む。問題のパラメータに依存して、そ
のパラメータの存在又は不存在を規定する予じめ決めた
いき値以上又は以下の信号を有する粒子の集団が存在し
よう。パラメータはそれぞれ配位体及び受体のエピトー
プ部位及び特異的結合具の結合部位である。
多くの状態において、複数のパラメータの存在、不存在
又は共存を決定することが問題となる。例えばＨＬＡの
分類では、卓型の特別な組合せの存在又は不存在を決定
することに興味がもたれる。
又は共存を決定することが問題となる。例えばＨＬＡの
分類では、卓型の特別な組合せの存在又は不存在を決定
することに興味がもたれる。
他の興味のめる分野は細胞表面の蛋白の存在の決定でお
る。細胞表面上の抗原部位及び表現型に対する抗体を含
む血液の分類の分野もある。勿論、本発明は、細胞に制
限する必要はない。即ち物理的に会合していても解離し
ていてもよい２つのパラメータの同時の存在と関連した
他の状態であってもよい。
る。細胞表面上の抗原部位及び表現型に対する抗体を含
む血液の分類の分野もある。勿論、本発明は、細胞に制
限する必要はない。即ち物理的に会合していても解離し
ていてもよい２つのパラメータの同時の存在と関連した
他の状態であってもよい。
本発明を行なう場合、同一の又は異なる染料試剤、特に
蛍光試剤が同時に又は連続的に添加されていてもよい１
つの懸濁液を使用する。次いで溶液中に分散された個々
の試剤分子及び比較的ごく近接した試剤分子の群間を区
別する。染料分子の粒子上への集合又は会合は、監視し
つつおる個々の粒子と関連した染料試剤が実質的に高濃
度のために、実質的な信号の差を与える。平均して１つ
の粒子だけが１度に検査されるように十分な小容量を監
視し、また時間的又は空間的に異なるそのような小容量
に対する測定を多数回行なうことにより、予じめ決めた
いき値から異なる信号と関連した粒子の集団（即ち容量
）を決定する。予じめ決めだ値を越える信号を与える容
量の数に依存して、複数のパラメータの存在又は不存在
を同定することができる。
蛍光試剤が同時に又は連続的に添加されていてもよい１
つの懸濁液を使用する。次いで溶液中に分散された個々
の試剤分子及び比較的ごく近接した試剤分子の群間を区
別する。染料分子の粒子上への集合又は会合は、監視し
つつおる個々の粒子と関連した染料試剤が実質的に高濃
度のために、実質的な信号の差を与える。平均して１つ
の粒子だけが１度に検査されるように十分な小容量を監
視し、また時間的又は空間的に異なるそのような小容量
に対する測定を多数回行なうことにより、予じめ決めた
いき値から異なる信号と関連した粒子の集団（即ち容量
）を決定する。予じめ決めだ値を越える信号を与える容
量の数に依存して、複数のパラメータの存在又は不存在
を同定することができる。
試料は連続の、静置の又は攪拌されているものであり、
そして移動流のものでない。即ち測定する全試料と拡散
的関係にある試料の１部分を監視する。
そして移動流のものでない。即ち測定する全試料と拡散
的関係にある試料の１部分を監視する。
用いる試剤は、粒子試剤が試料媒体中に存在する粒原か
ら区別しうる限シにおいて、染料、特に蛍光体で標識さ
れた特異的結合具及び粒子或いは標識されてない粒子で
ある。試剤はパラメータを有する結合具と同一でも、同
一の又は実質的に同一の結合性を有することでそのよう
な結合具に同種であってもよい。例えばパラメータが抗
体結合部位である場合、試剤はＦａｂフラグメント、ｐ
（−ａｂ’）ｔ ＋ などの上に存在しうる。パラメ
ータが配位体の決定部位である場合、相反的受体に対し
てパラメータのエピトープ部位と競合できる同種の結合
性を有するオリゴペプチドを用いることができる。
ら区別しうる限シにおいて、染料、特に蛍光体で標識さ
れた特異的結合具及び粒子或いは標識されてない粒子で
ある。試剤はパラメータを有する結合具と同一でも、同
一の又は実質的に同一の結合性を有することでそのよう
な結合具に同種であってもよい。例えばパラメータが抗
体結合部位である場合、試剤はＦａｂフラグメント、ｐ
（−ａｂ’）ｔ ＋ などの上に存在しうる。パラメ
ータが配位体の決定部位である場合、相反的受体に対し
てパラメータのエピトープ部位と競合できる同種の結合
性を有するオリゴペプチドを用いることができる。
問題のパラメータの数及び試剤の選択に依存して多くの
種類のプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ ）が使用でき
る。例えばＸが粒子に結合しているＸ及び抗Ｙの測定に
対しては、唯一の蛍光体で標識された抗Ｘ（Ｆ−抗Ｘ）
でＸを決定することができ、またＹで標識された粒子が
Ｘの結合した粒子から区別できる場合にＹで標識された
粒子及び蛍光体で標識された抗Ｙ（Ｆ−抗Ｙ）で抗Ｙを
決定しうる。
種類のプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ ）が使用でき
る。例えばＸが粒子に結合しているＸ及び抗Ｙの測定に
対しては、唯一の蛍光体で標識された抗Ｘ（Ｆ−抗Ｘ）
でＸを決定することができ、またＹで標識された粒子が
Ｘの結合した粒子から区別できる場合にＹで標識された
粒子及び蛍光体で標識された抗Ｙ（Ｆ−抗Ｙ）で抗Ｙを
決定しうる。
プロトコールはｐ゛−抗ｘ４試料に添加し ｐ −抗Ｘ
がＸの結合した試料粒子に結合するようになるかどうか
を決定するであろう。次いでＹで標識された粒子及びＦ
−抗Ｙを添加し、蛍光標識された粒子の数が抗Ｙの不存
在を示す程度゛まで増加したかどうかを決定する。この
ようにして同一の試料に対し且つ同一の装置において２
つの連続的な測定が行なわれる。カル−セル（Ｃαγｏ
ｕｓｅｌ ） ヲ用いれば、添加と測定か自動化できる
。
がＸの結合した試料粒子に結合するようになるかどうか
を決定するであろう。次いでＹで標識された粒子及びＦ
−抗Ｙを添加し、蛍光標識された粒子の数が抗Ｙの不存
在を示す程度゛まで増加したかどうかを決定する。この
ようにして同一の試料に対し且つ同一の装置において２
つの連続的な測定が行なわれる。カル−セル（Ｃαγｏ
ｕｓｅｌ ） ヲ用いれば、添加と測定か自動化できる
。
連続的添−加及び連続的測定を行なう場合、唯一の蛍光
体を用いる場合がある。例えばＸ及び／又はＹであって
もなくてもよい粒子の試料の測定を考えよう。最初にＦ
−抗Ｘを添加し、予じめ決めたいき値以上で蛍光を発す
る粒子の数を測定する。
体を用いる場合がある。例えばＸ及び／又はＹであって
もなくてもよい粒子の試料の測定を考えよう。最初にＦ
−抗Ｘを添加し、予じめ決めたいき値以上で蛍光を発す
る粒子の数を測定する。
次いでＦ−抗）′（２つのＦは同一の蛍光体）を添加し
、Ｆ−抗Ｘの添加後に観察される値より太きい予じめ決
めた値を有する粒子の数を決定する。
、Ｆ−抗Ｘの添加後に観察される値より太きい予じめ決
めた値を有する粒子の数を決定する。
連続的な添加及び測定により、２つの異なる波長での光
を測定する必、要件が省略できる。
を測定する必、要件が省略できる。
本方法の特別な適用分野は、パラメータの種々の組合せ
が問題となる血液の分類である。次の第１表は、興味あ
る種々のパラメータ、必要とされるフルオルフォア（ｆ
ｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ）の数及び試剤の性質を示す。
が問題となる血液の分類である。次の第１表は、興味あ
る種々のパラメータ、必要とされるフルオルフォア（ｆ
ｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ）の数及び試剤の性質を示す。
第１表
Ｆ２
Ａ；αＡ Ｉ Ｍ−Ａ；αＡ−Ｆ。
Ｂ；α１３ １ Ｍ−Ｂ；αＢ−Ｆ。
Ａ −Ｂ ２ αＡ−Ｆ、：αＢ−
Ｆ２αＡ；αＢ（血漿） Ｉ Ｅ−Ａ：αＡ−
Ｆ、；ｍ−Ｂ；αＢ−Ｆ。
Ｆ２αＡ；αＢ（血漿） Ｉ Ｅ−Ａ：αＡ−
Ｆ、；ｍ−Ｂ；αＢ−Ｆ。
Ｆ２
αＡ；αＢ ２ Ｍ−Ａ；Ｍ−１３：α
Ａ−１？１；αＢ−Ｆ２ Ａ；Ｒｈ ２ αＡ−Ｆ、；αＲｈ−Ｆ２
ｙ５Ｂ；Ｒｈ ３ αＡ−Ｆ 、αＢ−Ｆ２
；αＲｈ −Ｆ３ Ａ：Ｂ；（Ａ、Ｂ） ３ α（Ａ、ＩＪ）−Ｆ、
、αＡ−Ｆ２ ；αＢ−Ｆ３ （Ａ、＃）；Ｒん ２ α（Ａ、Ｂ）−Ｆ、；α
ｐｈ−ｐ２ Ａ：Ｂ；αＡ；αＢ ２ Ｍ−Ａ；Ｍ−Ｂ：αＡ
・−Ｆ、；αＢ−Ｆ２ すべての分析は指示する場合を除いて全血で行なうこと
ができる。唯一の抗原を決定する場合には、分離した細
胞で分析を行なってもよい。唯一の抗体を決定する場合
には、血清又は血漿を用いて分析を行ないうる。Ｍは赤
血球（Ｅ）と異なる粒子、例えば光散乱にょシ或いは更
なるフルオルフォアを用いて検知しうるゴー、ｒ、 ）
（ｇｈｏｓｔ ）、気泡又はラテックスを意味する。
Ａ−１？１；αＢ−Ｆ２ Ａ；Ｒｈ ２ αＡ−Ｆ、；αＲｈ−Ｆ２
ｙ５Ｂ；Ｒｈ ３ αＡ−Ｆ 、αＢ−Ｆ２
；αＲｈ −Ｆ３ Ａ：Ｂ；（Ａ、Ｂ） ３ α（Ａ、ＩＪ）−Ｆ、
、αＡ−Ｆ２ ；αＢ−Ｆ３ （Ａ、＃）；Ｒん ２ α（Ａ、Ｂ）−Ｆ、；α
ｐｈ−ｐ２ Ａ：Ｂ；αＡ；αＢ ２ Ｍ−Ａ；Ｍ−Ｂ：αＡ
・−Ｆ、；αＢ−Ｆ２ すべての分析は指示する場合を除いて全血で行なうこと
ができる。唯一の抗原を決定する場合には、分離した細
胞で分析を行なってもよい。唯一の抗体を決定する場合
には、血清又は血漿を用いて分析を行ないうる。Ｍは赤
血球（Ｅ）と異なる粒子、例えば光散乱にょシ或いは更
なるフルオルフォアを用いて検知しうるゴー、ｒ、 ）
（ｇｈｏｓｔ ）、気泡又はラテックスを意味する。
αＸは抗Ｘ抗体を意味する。木組合せ分析法は１つの分
析媒体中で２〜４のパラメートを決定しうる。４つのパ
ラメータを与える１つの分析媒体は最も効果的である。
析媒体中で２〜４のパラメートを決定しうる。４つのパ
ラメータを与える１つの分析媒体は最も効果的である。
血液の分類では、普通１回の試験から最大量の情報を得
ることに興味がもたれる。本発明のプロトコールによれ
ば、血液の分類に問題の種々のパラメータを決定するこ
とができる。２つの独立の試験によシ、ＡＢＯ型、Ａ及
びＢ抗原に対する同種抗体の存在又は不存在、Ｒｈ型及
び特別なＡ。
ることに興味がもたれる。本発明のプロトコールによれ
ば、血液の分類に問題の種々のパラメータを決定するこ
とができる。２つの独立の試験によシ、ＡＢＯ型、Ａ及
びＢ抗原に対する同種抗体の存在又は不存在、Ｒｈ型及
び特別なＡ。
Ｂ型を決定することができる。（この特別なＡ。
Ｂ型は、Ａ抗原がＡ抗原を検知するための普通の抗血清
に対して弱くしか結合しない集団を少割合で含む）。こ
の方法は独立に区別しうる２〜３つの標識の使用を必要
とする。便宜上、これらの標識は、容易に区別できる放
射特性をもつ蛍光体である。本方法は、独立に、簡便に
は同時に個々の粒子上における異なる標識の存在又は不
存在を決定し、そして元の赤血球をＡ及びＢ又はＡＢ表
現型粒子から区別することを含む。
に対して弱くしか結合しない集団を少割合で含む）。こ
の方法は独立に区別しうる２〜３つの標識の使用を必要
とする。便宜上、これらの標識は、容易に区別できる放
射特性をもつ蛍光体である。本方法は、独立に、簡便に
は同時に個々の粒子上における異なる標識の存在又は不
存在を決定し、そして元の赤血球をＡ及びＢ又はＡＢ表
現型粒子から区別することを含む。
測定は３つのパラメータを有することに基づき、そのう
ち少くとも２つはそれらが区別できるように異なる最大
放射をもつ蛍光体で６Ｄ、１〜２つの光源によって励起
することができる。Ａ及び／又はＢ抗原を有する粒子と
関連する第３のパラメータが含まれる。この第３のパラ
メータは血液試料中に存在する赤血球及び試剤として役
立ち且つＡ及び／又はＢ抗原を有する粒子の［口」の検
知しうる区別を提供する。この試剤はＭとして言及され
、Ｍは印のついた（ ｍａｒｋｅｄ ）粒子に関し、こ
のマーカー（ｍａｒｋｅｒ ）又は赤血球からの区別は
粒子の性質に固有であっても或いは粒子に結合した蛍光
体標識の結果としてであってもよい。この区別は赤血球
で得られる信号と異なる検知しうる電磁照射信号を与え
る。
ち少くとも２つはそれらが区別できるように異なる最大
放射をもつ蛍光体で６Ｄ、１〜２つの光源によって励起
することができる。Ａ及び／又はＢ抗原を有する粒子と
関連する第３のパラメータが含まれる。この第３のパラ
メータは血液試料中に存在する赤血球及び試剤として役
立ち且つＡ及び／又はＢ抗原を有する粒子の［口」の検
知しうる区別を提供する。この試剤はＭとして言及され
、Ｍは印のついた（ ｍａｒｋｅｄ ）粒子に関し、こ
のマーカー（ｍａｒｋｅｒ ）又は赤血球からの区別は
粒子の性質に固有であっても或いは粒子に結合した蛍光
体標識の結果としてであってもよい。この区別は赤血球
で得られる信号と異なる検知しうる電磁照射信号を与え
る。
１つの粒状試剤（Ｍ）は蛍光体が例えば抗体を通して共
有的に又は非共有的に結合したＡ及びＢの正の赤血球で
あることができ、この試剤はＥ−Ｆ３として言及されよ
う。この時赤血球に結合した蛍光体はｌ？３ として言
及されよう。αＡ又はαＢを決定するために逆に分類す
る時には、赤血球に対する抗体がそれぞれＡ及びＢ決定
子に対して存在することになる。
有的に又は非共有的に結合したＡ及びＢの正の赤血球で
あることができ、この試剤はＥ−Ｆ３として言及されよ
う。この時赤血球に結合した蛍光体はｌ？３ として言
及されよう。αＡ又はαＢを決定するために逆に分類す
る時には、赤血球に対する抗体がそれぞれＡ及びＢ決定
子に対して存在することになる。
Ａ及びＢ抗原が結合し且つ赤血球粒子及び意図する粒子
間の識別を可能にする他の粒子も使用できる。そのよう
な粒子は粒子が標識されていてもいなくてもよい重合体
ビーズ例えば多糖類及び付加重合体、リポソーム及び赤
血球ゴーストを含む。
間の識別を可能にする他の粒子も使用できる。そのよう
な粒子は粒子が標識されていてもいなくてもよい重合体
ビーズ例えば多糖類及び付加重合体、リポソーム及び赤
血球ゴーストを含む。
標識は粒子の性質及び区別して検知しうる信号に依存し
て広く変化しうる。
て広く変化しうる。
１つの信号は、赤血球に関して観察される散乱がＭに関
して観察される散乱と異なる光散乱である。他の信号は
、粒子に結合した蛍光体が分析媒体中に存在する他の蛍
光体と異なる最大照射又は偏光を有するという蛍光でる
る。他に赤血球の内因的蛍光又は不透明も区別しうるパ
ラメータを与えることができる。
して観察される散乱と異なる光散乱である。他の信号は
、粒子に結合した蛍光体が分析媒体中に存在する他の蛍
光体と異なる最大照射又は偏光を有するという蛍光でる
る。他に赤血球の内因的蛍光又は不透明も区別しうるパ
ラメータを与えることができる。
光散乱の場合には、多くの異なる物質が、標識粒子例え
ばゴースト及びリポソームに対して使用できる。コロイ
ド状金属又は金属化合物、コロイド状炭素、インクなど
が使用しうる。他に、効果的に光を散乱するわけではな
いが、赤血球及び赤血球ゴースト曲の固有の光散乱の差
に基づいてもよい。
ばゴースト及びリポソームに対して使用できる。コロイ
ド状金属又は金属化合物、コロイド状炭素、インクなど
が使用しうる。他に、効果的に光を散乱するわけではな
いが、赤血球及び赤血球ゴースト曲の固有の光散乱の差
に基づいてもよい。
赤血球試剤に加えて、標識され且つ特別左表現型に対し
て特異的である抗体も使用される。
て特異的である抗体も使用される。
本分析において、個々の粒子は検知され、これらの粒子
の分光学的特性が決定される。特別な粒子状における蛍
光体の存在又は不存在を決定することによシ、保有者の
赤血球の表現型並びにＡ及びＢ抗原に対する同種抗体の
存在を決定することができる。
の分光学的特性が決定される。特別な粒子状における蛍
光体の存在又は不存在を決定することによシ、保有者の
赤血球の表現型並びにＡ及びＢ抗原に対する同種抗体の
存在を決定することができる。
次の第２弐は、ＡＢＯ型並びにＡＢ抗原に対する抗体の
存在の診断である個々の粒子に起源する信号のマトリッ
クスを、αＡ−Ｆ、、αＡ−Ｆ２゜及びＭ（Ａ）Ｂを用
いて例示する。
存在の診断である個々の粒子に起源する信号のマトリッ
クスを、αＡ−Ｆ、、αＡ−Ｆ２゜及びＭ（Ａ）Ｂを用
いて例示する。
第２表８
Ａ ＋ −−Ｂ
−十 −ＡＢ
＋ ＋ −０−−− 同種抗体 αＡ −＋ ＋ αＢ ＋
＋αＡαＢ −−→− −± 十 ＋ ＊αは抗体を意味する ＦｌはαＡに結合 ｐ′２はαＢに結合 ＭはＡ及びＢ抗原を有する赤血球に結合−Ｍ（Ａ）Ｂ ＋及び−は限定された信号値に関して増加した又は減少
した信号を意味する。
−十 −ＡＢ
＋ ＋ −０−−− 同種抗体 αＡ −＋ ＋ αＢ ＋
＋αＡαＢ −−→− −± 十 ＋ ＊αは抗体を意味する ＦｌはαＡに結合 ｐ′２はαＢに結合 ＭはＡ及びＢ抗原を有する赤血球に結合−Ｍ（Ａ）Ｂ ＋及び−は限定された信号値に関して増加した又は減少
した信号を意味する。
第２表を分析する場合、試料中に存在する粒子が少くと
も２種類存在するであろうと考えるべきである：Ａ及び
８表現型を有する印をつけた粒子及び表現型を決定すべ
き保有者の赤血球粒子。この赤血球と印をつけた粒子は
容易に区別できる。
も２種類存在するであろうと考えるべきである：Ａ及び
８表現型を有する印をつけた粒子及び表現型を決定すべ
き保有者の赤血球粒子。この赤血球と印をつけた粒子は
容易に区別できる。
Ａ血液型に対して蛍光体のマーカー１１３をＡ及び８粒
子に用いた場合を例にとると、保有者の赤血球はαＡ−
Ｆ、に結合するであろう。それ故に保有者の赤血球を観
察した時、そのような赤血球からの放射と吸光はＦ、の
波長帯に存在するであろう。Ａ及び８表現型粒子はαＢ
抗体が存在するかしないかに依存してＦ、＋、Ｆ２ 、
Ｆ３Ｉ−或いはＦ、＋。
子に用いた場合を例にとると、保有者の赤血球はαＡ−
Ｆ、に結合するであろう。それ故に保有者の赤血球を観
察した時、そのような赤血球からの放射と吸光はＦ、の
波長帯に存在するであろう。Ａ及び８表現型粒子はαＢ
抗体が存在するかしないかに依存してＦ、＋、Ｆ２ 、
Ｆ３Ｉ−或いはＦ、＋。
Ｆ２＋、蓼−のいずれかであろう。他の血液型に対して
も同様の分析が行なわれる。
も同様の分析が行なわれる。
保有者の赤血球は、赤血球ならばＦ３で標識されるであ
ろうＡＢで標識された粒子から区別できよう。それ故に
、Ｆ３の励起及び放射波長帯において蛍光を出さない赤
血球は保有者の赤血球でらシ、Ａ及びＢ抗原の存在の診
断になる。Ｆ３の波長帯に放射のある粒子から蛍光が観
察される場合には、Ｆｌ及びＦ２の励起及び／又は放射
波長帯における増加した又は減少した信号によってＡ及
び／又はＢ抗原に対する抗体が存在するかどうかが決定
できる。Ａ及びＢ抗原の両方に対する抗体が存在する場
合には、ｐ′３の波長範囲に蛍光を発する及び更にＦｌ
及びＦ２の波長範囲に蛍光を発する粒子の数の減少が観
察されよう。
ろうＡＢで標識された粒子から区別できよう。それ故に
、Ｆ３の励起及び放射波長帯において蛍光を出さない赤
血球は保有者の赤血球でらシ、Ａ及びＢ抗原の存在の診
断になる。Ｆ３の波長帯に放射のある粒子から蛍光が観
察される場合には、Ｆｌ及びＦ２の励起及び／又は放射
波長帯における増加した又は減少した信号によってＡ及
び／又はＢ抗原に対する抗体が存在するかどうかが決定
できる。Ａ及びＢ抗原の両方に対する抗体が存在する場
合には、ｐ′３の波長範囲に蛍光を発する及び更にＦｌ
及びＦ２の波長範囲に蛍光を発する粒子の数の減少が観
察されよう。
すでに記述したように、Ａ及び８表現型の粒子試剤は、
光信号で検知しうる性質によって元々存在する赤血球か
ら区別できる。光信号は、粒子が蛍光体で標識されてい
る場合に蛍光の結果として或いは粒子が赤血球と異なる
光を散乱する場合に光散乱の結果として得ることができ
る。
光信号で検知しうる性質によって元々存在する赤血球か
ら区別できる。光信号は、粒子が蛍光体で標識されてい
る場合に蛍光の結果として或いは粒子が赤血球と異なる
光を散乱する場合に光散乱の結果として得ることができ
る。
本方法によれば、単一の粒子上に存在する蛍光体の組合
せを検知することができる。これは単一の粒子から放身
１される光の連ＩＡ的な又は同時の測定の結果としてで
あってよい。同時の測定の場合には、蛍光体に起因する
異なる波長の差を昭識する及び個々の粒子からの適当な
光散乱として認識する検知手段が使用されよう。同時測
定以外の場合には、赤血球又は印をつけた粒子と関連す
る特別々蛍光体の存在の割合を決定するのに統語学的分
析が使用される。この測定では物理的マーカーが必要で
ない。むしろ「印をつけた」粒子は赤血球と実質的に異
なる（＞１０）濃度で存在しなければならない。これは
Ｆ−抗Ａ及び標識されてない抗Ａ赤血球を用いるＡ及び
抗Ａに対する測定に関して例示しうる。最初に血液の試
料とＦ−抗Ａを一緒にする。Ａ抗原の存在を示す正の結
果は、いき値以上の蛍光値を有する岸１子の予じめ決め
だ集団に基づく。次いで標識してないｌＪ赤血球を、保
有者の赤血球に少くとも等しい濃度で添加し、２回目の
蛍光の測定を行なう。抗Ａの不存在を示す負の結果は、
いき値以上の蛍光値を有する粒子の、予じめ観策された
集団以上の予じめ決めた集団に基づく。
せを検知することができる。これは単一の粒子から放身
１される光の連ＩＡ的な又は同時の測定の結果としてで
あってよい。同時の測定の場合には、蛍光体に起因する
異なる波長の差を昭識する及び個々の粒子からの適当な
光散乱として認識する検知手段が使用されよう。同時測
定以外の場合には、赤血球又は印をつけた粒子と関連す
る特別々蛍光体の存在の割合を決定するのに統語学的分
析が使用される。この測定では物理的マーカーが必要で
ない。むしろ「印をつけた」粒子は赤血球と実質的に異
なる（＞１０）濃度で存在しなければならない。これは
Ｆ−抗Ａ及び標識されてない抗Ａ赤血球を用いるＡ及び
抗Ａに対する測定に関して例示しうる。最初に血液の試
料とＦ−抗Ａを一緒にする。Ａ抗原の存在を示す正の結
果は、いき値以上の蛍光値を有する岸１子の予じめ決め
だ集団に基づく。次いで標識してないｌＪ赤血球を、保
有者の赤血球に少くとも等しい濃度で添加し、２回目の
蛍光の測定を行なう。抗Ａの不存在を示す負の結果は、
いき値以上の蛍光値を有する粒子の、予じめ観策された
集団以上の予じめ決めた集団に基づく。
災に、前述したように、同一の蛍光体でそれぞれ標識さ
れた異なる抗体を保有者の赤血球の１′諦濁液に連続的
に添加し、各添加後に蛍光粒子の数の統計学的測定を行
なう。この利点は前述のように簡単な光学系である。
れた異なる抗体を保有者の赤血球の１′諦濁液に連続的
に添加し、各添加後に蛍光粒子の数の統計学的測定を行
なう。この利点は前述のように簡単な光学系である。
特に興味あるものは、１９８２年７月１２日付は関連特
許願第３９７．２８５号或いは対応する公開ヨーロッパ
特許願第８３３０４０１９．９号に記述された技術及び
装置を用いることである。本発明は単一の粒子だけがそ
の蛍光に関して調べられるように十分少ない容量を取シ
扱うことのできる光学繊維の使用に頼っている。スプリ
ッター（５ｐｌｉｔｔｅｒ ）及び適当なフィルターを
用いることによシ、２又は３つの異なる波長範囲におい
て或いは異なる偏光の蛍光シグナル及び光散乱を同時に
測定することができる。即ち異なる蛍光体の１つ又はそ
れ以上の各々を比較的多数で有する粒子の濃度を決定す
ることができる。個々の蛍光体の粒子の表面上における
濃度でなくて、そのような蛍光分子が十分ないき値数で
存在するかどうかだけに関係するから、系は粒子から出
てくる蛍光の量ではなくて、異なる波長範囲間を識別す
ることだけを必要とする。
許願第３９７．２８５号或いは対応する公開ヨーロッパ
特許願第８３３０４０１９．９号に記述された技術及び
装置を用いることである。本発明は単一の粒子だけがそ
の蛍光に関して調べられるように十分少ない容量を取シ
扱うことのできる光学繊維の使用に頼っている。スプリ
ッター（５ｐｌｉｔｔｅｒ ）及び適当なフィルターを
用いることによシ、２又は３つの異なる波長範囲におい
て或いは異なる偏光の蛍光シグナル及び光散乱を同時に
測定することができる。即ち異なる蛍光体の１つ又はそ
れ以上の各々を比較的多数で有する粒子の濃度を決定す
ることができる。個々の蛍光体の粒子の表面上における
濃度でなくて、そのような蛍光分子が十分ないき値数で
存在するかどうかだけに関係するから、系は粒子から出
てくる蛍光の量ではなくて、異なる波長範囲間を識別す
ることだけを必要とする。
有用な装置は関連特許願第３９７．２８５号に例示され
ており、連続測定に対１７て改変しないで使用すること
ができる。同時測定の場合には、次の記述に従って装置
を改変してもよい。装置は試料保持手段を有し、そこに
は１〜３本の枝に分岐されている１本又はそれ以上の光
学繊維が浸される。
ており、連続測定に対１７て改変しないで使用すること
ができる。同時測定の場合には、次の記述に従って装置
を改変してもよい。装置は試料保持手段を有し、そこに
は１〜３本の枝に分岐されている１本又はそれ以上の光
学繊維が浸される。
各校は蛍光体の１つの蛍光放射又は光散乱に相描する信
号を伝達せしめる別々のフィルター及び／又は偏光子を
有している。励起光は枝の１つを通して或いは独立に試
料を光学繊維プローブ面（ｐｒｏｂｅ ｆａｃｅ ）で
照射する第２の光学繊維を通して導入することができる
。光がプローブを通って伝達される場合、更なる繊維の
枝が光源を与えるために使用される。他のそれ程好適で
ない方ｊ法は、異なる波長で励起させるために２つの光
源を用いることである。この時励起光を導入するための
枝を用い、放射光のための枝を排除する。
号を伝達せしめる別々のフィルター及び／又は偏光子を
有している。励起光は枝の１つを通して或いは独立に試
料を光学繊維プローブ面（ｐｒｏｂｅ ｆａｃｅ ）で
照射する第２の光学繊維を通して導入することができる
。光がプローブを通って伝達される場合、更なる繊維の
枝が光源を与えるために使用される。他のそれ程好適で
ない方ｊ法は、異なる波長で励起させるために２つの光
源を用いることである。この時励起光を導入するための
枝を用い、放射光のための枝を排除する。
種々の励起光源、好ましくはレーザー、更に特にＨｇ
−Ｃｄ 、 Ｂ ｅ −Ｎ ｅ又はＡｒｖ−ザーが使用
できる。広い波長帯の光源は非常に強くなければならず
、適当な波長範囲を保証してバックグランドの干渉が大
きくなるのを避けるためにフィルターを用いなければな
らない。光源は小さくて、光線は光学繊維プローブの前
の区域に直接向いているべきである。
−Ｃｄ 、 Ｂ ｅ −Ｎ ｅ又はＡｒｖ−ザーが使用
できる。広い波長帯の光源は非常に強くなければならず
、適当な波長範囲を保証してバックグランドの干渉が大
きくなるのを避けるためにフィルターを用いなければな
らない。光源は小さくて、光線は光学繊維プローブの前
の区域に直接向いているべきである。
プローブが受は且つ枝を通して伝達される放射光は検知
器に入る、検知器は光電子を受け、これを異なる強度の
信号間の差を認識する信号に変換することのできるいず
れかの装置でるる。光電子増巾器は代表的な例である。
器に入る、検知器は光電子を受け、これを異なる強度の
信号間の差を認識する信号に変換することのできるいず
れかの装置でるる。光電子増巾器は代表的な例である。
光電子増巾管により１つの光パルスで放射された電子は
、前置増巾器識別器に入ることができる。
、前置増巾器識別器に入ることができる。
この装置は信号を増巾し、光電子増巾器・に起因するノ
イズに対して識別し、そしτデジタル・カウンターで計
数しうる良好な形の電位パルスを発生する。カウンター
のゲートタイム（ｇａｔｅ ｔｉｍ、ｅ’ ）当沙の光
パルスの数はゲートタイムに亘って平均化された光の強
度に比例する。これらの光パルスの計数値は、計数値に
おける変化を検知するようにプログラミングされ且つ問
題の粒子が有効試料容量中を通過することに相当する蛍
光の鋭い変動を表示するコンピュータにインターフェー
スで拶続される。これは光検知器からの信号がいかにデ
ジタル的に解析しうるかの１つの例である。他に、検知
器からアナログ信号を受け、高域フィルターで鋭い変化
を検知してもよく、或いはアナログとデジタルの技術を
組合せて使用してもよい。
イズに対して識別し、そしτデジタル・カウンターで計
数しうる良好な形の電位パルスを発生する。カウンター
のゲートタイム（ｇａｔｅ ｔｉｍ、ｅ’ ）当沙の光
パルスの数はゲートタイムに亘って平均化された光の強
度に比例する。これらの光パルスの計数値は、計数値に
おける変化を検知するようにプログラミングされ且つ問
題の粒子が有効試料容量中を通過することに相当する蛍
光の鋭い変動を表示するコンピュータにインターフェー
スで拶続される。これは光検知器からの信号がいかにデ
ジタル的に解析しうるかの１つの例である。他に、検知
器からアナログ信号を受け、高域フィルターで鋭い変化
を検知してもよく、或いはアナログとデジタルの技術を
組合せて使用してもよい。
いき値を越える信号の変動の頻度を計算し、公知のカリ
プレータ（Ｃα１ｉｂｒａｔｏｒ ）と関連づける。
プレータ（Ｃα１ｉｂｒａｔｏｒ ）と関連づける。
次いで例えば第１及び２表において上述した如く蛍光放
射の種々の組合せを有する観察された粒子のパーセント
を決定することができる。この時コンピュータは予じめ
決めたいき値以上の観察された蛍光組合せに従って自動
的に血液型を報告するようにプログラミングできる。
射の種々の組合せを有する観察された粒子のパーセント
を決定することができる。この時コンピュータは予じめ
決めたいき値以上の観察された蛍光組合せに従って自動
的に血液型を報告するようにプログラミングできる。
本発明を行なう場合、１つ又は複数の、普通３つよシ多
くない蛍光体が必要である。赤血球に配位しうる蛍光体
は次の理由のために蛍光体の最小の基準である。第１に
蛍光体（Ｆ３ ）は赤血球に対して比較的多量に配位で
きる。それ故に、そのような蛍光体が比較的低い蛍光効
率を有する場合、より多量の蛍光体が使用できる。第２
に他の蛍光体との組合せにおいてその存在を保証せしめ
るのに十分な量が赤血球に結合していることだけが必要
である。それ故に、主に他の２つの蛍光体の検知を妨害
しないことによって制限されるだけで、広範囲の蛍光体
を選ぶことができる。便宜上ｐ゛３は放射特性を有して
いてよい。どの場合、最大放射は７００以下、好ましく
は６００、及び更に好捷しくは４５０〜５１０？ｚ１′
ｎ、である。
くない蛍光体が必要である。赤血球に配位しうる蛍光体
は次の理由のために蛍光体の最小の基準である。第１に
蛍光体（Ｆ３ ）は赤血球に対して比較的多量に配位で
きる。それ故に、そのような蛍光体が比較的低い蛍光効
率を有する場合、より多量の蛍光体が使用できる。第２
に他の蛍光体との組合せにおいてその存在を保証せしめ
るのに十分な量が赤血球に結合していることだけが必要
である。それ故に、主に他の２つの蛍光体の検知を妨害
しないことによって制限されるだけで、広範囲の蛍光体
を選ぶことができる。便宜上ｐ゛３は放射特性を有して
いてよい。どの場合、最大放射は７００以下、好ましく
は６００、及び更に好捷しくは４５０〜５１０？ｚ１′
ｎ、である。
他の蛍光体は、一般に少くとも約２０ｎｍ、好ましくは
少くとも約２５ｎｍだけ最大放射波長の差を有する妨害
しない最大放射を有すべきであり、址だ高蛍光効率を有
し、結合によって致命的に影響されない並びに非特異的
干渉によって最小にしか影響されないで蛋白に結合でき
るべきである。
少くとも約２５ｎｍだけ最大放射波長の差を有する妨害
しない最大放射を有すべきであり、址だ高蛍光効率を有
し、結合によって致命的に影響されない並びに非特異的
干渉によって最小にしか影響されないで蛋白に結合でき
るべきである。
蛍光体は４５０以上、好捷しくは４７５以上、更に好捷
しくに５００以上の最大放射を有すべきであり、この場
合望ましくは１つの最大放射は約５００〜５７５に及び
他の最大放射は約５５０〜６２５ ｎｍの範囲にあるで
あろう。特に興味ある蛍光体は公開ヨーロッパ特許願第
８０１０６５８７．１号及び第８０１０５２５３．１号
に見出すことができる。他の興味ある蛍光体はテキサス
・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコビリプロチン
（ｐｈｙ−ｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ）、ローダミ
ンの誘導体、例えばＸ −ＲＩ Ｔ Ｃなどを含む。蛍
光体の赤血球又は抗体への配合の様子は広く文献に記述
されているから、ここに例示する必要はない。例えば米
国特許第４．１９９．５５９号及び第４，３１８，８４
６号を参照。
しくに５００以上の最大放射を有すべきであり、この場
合望ましくは１つの最大放射は約５００〜５７５に及び
他の最大放射は約５５０〜６２５ ｎｍの範囲にあるで
あろう。特に興味ある蛍光体は公開ヨーロッパ特許願第
８０１０６５８７．１号及び第８０１０５２５３．１号
に見出すことができる。他の興味ある蛍光体はテキサス
・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコビリプロチン
（ｐｈｙ−ｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ）、ローダミ
ンの誘導体、例えばＸ −ＲＩ Ｔ Ｃなどを含む。蛍
光体の赤血球又は抗体への配合の様子は広く文献に記述
されているから、ここに例示する必要はない。例えば米
国特許第４．１９９．５５９号及び第４，３１８，８４
６号を参照。
３種の染料を用いて例示すると、第１の染料はフルオレ
ツセツ又はサクシニルフルオレラセン；第２の染料は２
，７−シメトキシー４，５−ジクロル−３′、６′−ジ
クロル−４′又は５′−カルボキシフルオレラセン；及
び第３の染料はテキサス・レッドであってよい。これら
の染料は４４２ｎηＬ（Ｈｅ−Ｃｄレーザー）で励起す
ることができる。
ツセツ又はサクシニルフルオレラセン；第２の染料は２
，７−シメトキシー４，５−ジクロル−３′、６′−ジ
クロル−４′又は５′−カルボキシフルオレラセン；及
び第３の染料はテキサス・レッドであってよい。これら
の染料は４４２ｎηＬ（Ｈｅ−Ｃｄレーザー）で励起す
ることができる。
放射の測定はそれぞれ５１０±５．５６０±１５及び６
１０±１５ｎ？＋？、で行なわれる。
１０±１５ｎ？＋？、で行なわれる。
他に染料を組合せて用いてもよい。即ち第１の染料又は
増感剤はより短い波長で光を吸収し、そしでこのエネル
ギーを蛍光を発生しうる第２の染料に伝達する組合せで
ある。この場合には、１つの染料が高吸収効率を有し且
つそれよシ高い波長で吸収し、高蛍光効率を有する他の
染料を励起するという染料の組合せを用いるとよい。有
用であることかわかった増感剤は次の構造の化合物であ
る： ６２ノｌ、 Ｃ２Ｈ５ 増感剤は蛍光体に直接結合させることによシ或いは蛍光
体が結合した分子に結合させることによって使用できる
。
増感剤はより短い波長で光を吸収し、そしでこのエネル
ギーを蛍光を発生しうる第２の染料に伝達する組合せで
ある。この場合には、１つの染料が高吸収効率を有し且
つそれよシ高い波長で吸収し、高蛍光効率を有する他の
染料を励起するという染料の組合せを用いるとよい。有
用であることかわかった増感剤は次の構造の化合物であ
る： ６２ノｌ、 Ｃ２Ｈ５ 増感剤は蛍光体に直接結合させることによシ或いは蛍光
体が結合した分子に結合させることによって使用できる
。
不配合体の製造において、次のものは工程の例である：
ｐ ｕ ｓ、 ｏの０．５ Ｍ Ｐ Ｏ”；−ｇ衝液０
．５ ｍｅ中抗ｌｉ（７，５Ｅ：９ ）の冷却した溶液
（０〜５°Ｃ）に、Ｊ） ＭＦ２５μノ中フルオレツセ
ン（０，０７ｖ＋夕）のＮ−ヒドロキシツークシニミド
（ｆＪ）ＪＳ）エステルの溶液を２０分間に亘ってゆっ
くり添加する。攪拌を冷室において夜通し継続する。翌
日溶液を２分間遠心分離にかけ、黄色の溶液をｐ １１
８．０の００５ｍ ｐ ｏ ２− （Ｈ衝液によｆ）セ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムで積
装する。速く移動する配合体（１５にＩｅ ）は容易に
分離される。この配合体は入ご４９０ｎｒｎをイアする
。
．５ ｍｅ中抗ｌｉ（７，５Ｅ：９ ）の冷却した溶液
（０〜５°Ｃ）に、Ｊ） ＭＦ２５μノ中フルオレツセ
ン（０，０７ｖ＋夕）のＮ−ヒドロキシツークシニミド
（ｆＪ）ＪＳ）エステルの溶液を２０分間に亘ってゆっ
くり添加する。攪拌を冷室において夜通し継続する。翌
日溶液を２分間遠心分離にかけ、黄色の溶液をｐ １１
８．０の００５ｍ ｐ ｏ ２− （Ｈ衝液によｆ）セ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムで積
装する。速く移動する配合体（１５にＩｅ ）は容易に
分離される。この配合体は入ご４９０ｎｒｎをイアする
。
メロシアニン化合物のようなＪ￥ｉ′感剤は、次に示す
ように一〇〇、、Ｅ酸誘導体を通して連結することがで
きる： １１０２Ｃ’−Ｃｊ：ｌ、、−Ｃ１ｉ２−Ｎ３）−ＣＤ
＝ＯＲＧ−０−− 上記化合物１ｔｉＮＪｉＳエステルとして活性化され、
ＮＨＳエステルは染料を標識するために上述したように
標識抗体に対して使用される。
ように一〇〇、、Ｅ酸誘導体を通して連結することがで
きる： １１０２Ｃ’−Ｃｊ：ｌ、、−Ｃ１ｉ２−Ｎ３）−ＣＤ
＝ＯＲＧ−０−− 上記化合物１ｔｉＮＪｉＳエステルとして活性化され、
ＮＨＳエステルは染料を標識するために上述したように
標識抗体に対して使用される。
血液の分類を行なう場合には、試剤組成物を連続的に又
は同時に血液試料と一緒にするとよい。
は同時に血液試料と一緒にするとよい。
血液試料は全体の−１ま使用しうるが、普通には分析媒
体中において１０ｓまで、普通約ｌｏ２までの桁で希釈
される。試料と試剤は普通には安定剤、塩、不活性な粉
末、蛋白質などのような種々の他の物質を含んでいてよ
い、一般に約５．０〜９５の範囲のｐＢの、水性緩衝溶
液中で混合される。次いで混合物を、種々の抗体を決定
部位に結合せしめるのに十分な時間保温する。普通少く
とも３０秒が使用され、約１時間を越えない、一般に３
゜分で十分である。主たる関心は正の決定に対して反応
を平衡に達しせしめる必要はない。次いで試料を適当な
光で励起し、蛍光放射を測定し、そして適当ならば光散
乱又は吸収を決定する。おｌ子を区別するマーカーと組
合せて蛍光の組合せ物を分析することにより、血液型及
びＡＢＯ系のだめの抗原決定子に対する抗体の存在を決
定することができる。或いは所急により他の被験体の組
合せ物も分析できる。
体中において１０ｓまで、普通約ｌｏ２までの桁で希釈
される。試料と試剤は普通には安定剤、塩、不活性な粉
末、蛋白質などのような種々の他の物質を含んでいてよ
い、一般に約５．０〜９５の範囲のｐＢの、水性緩衝溶
液中で混合される。次いで混合物を、種々の抗体を決定
部位に結合せしめるのに十分な時間保温する。普通少く
とも３０秒が使用され、約１時間を越えない、一般に３
゜分で十分である。主たる関心は正の決定に対して反応
を平衡に達しせしめる必要はない。次いで試料を適当な
光で励起し、蛍光放射を測定し、そして適当ならば光散
乱又は吸収を決定する。おｌ子を区別するマーカーと組
合せて蛍光の組合せ物を分析することにより、血液型及
びＡＢＯ系のだめの抗原決定子に対する抗体の存在を決
定することができる。或いは所急により他の被験体の組
合せ物も分析できる。
本発明によれば、迅速で効果的な方法は単一の試料での
血液の分類におけるようにマルチパラメータ分析に使用
される。本方法は自動化に近く、測定を迅速に、効果的
に、そして技術者の処理を最小にして行なうことができ
る。結果は自動的にコンピュータにかけられ且つ印刷さ
れるから、試料と結果を容易に且つ正確に関連づけるこ
とができる。
血液の分類におけるようにマルチパラメータ分析に使用
される。本方法は自動化に近く、測定を迅速に、効果的
に、そして技術者の処理を最小にして行なうことができ
る。結果は自動的にコンピュータにかけられ且つ印刷さ
れるから、試料と結果を容易に且つ正確に関連づけるこ
とができる。
以上理解を明確にする目的で例示によっていくらか詳細
に不発明を記述してきたけれど、ある噌４Ｘの変化及び
改変は喘・許請求の範囲内に含まれて実施しうるという
ことは明らかであろう。
に不発明を記述してきたけれど、ある噌４Ｘの変化及び
改変は喘・許請求の範囲内に含まれて実施しうるという
ことは明らかであろう。
特許用ｊ幀人 シバ・カンパニー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 複数のパラメータを決定するための方法で心って、
該パラメータは特異的結合具のエピトープ部位及び結合
部位であり、該結合具はそれぞれ配位体及び相反的受体
であり、但し少くとも１つのパラメータを貧有する員又
はその相反的結合具は粒子に結合しておシ、 上記方法は結合具に結合した少くとも１つの蛍光標識な
宮んでおり、そして少くとも１つの粒子、異なる蛍光標
識及び異なる粒子は放射、吸収及び光散乱という分光学
的特性によって区別でき、上記方法は、 （ａ） 測定されるべき２つのパラメータをもつ試料
； （ｂ） 粒子に結合した結合具に相反的な第１の蛍光で
標識されｆｃ結合員； （Ｃ） 第２の粒子又はめ２の蛍光で標識した結合具の
少くとも１方、 を液体媒体中で一緒にし、但し該パラメータを含有する
特異的結合具が粒子に結合している場合相反的結合具は
蛍光で標識されておシ及び該パラメータを含有する特異
的結合具が結合していない場合該蛍光で標識された特異
的結合具は同族員で多り； 該粒子を光で照射し、但し該粒子は連続媒体中に懸濁し
ておシ、そしていき値から異なる電磁気信号を有する粒
子の少くとも２つの集団を決定し；該集団を該試料中の
該パラメータの存在と関連づける、 ことを含んでなる上記複数のパラメータを決定する方法
。 ２ 該試料が全血である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３、 該パラメータが赤血球における決定部位である特
許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、光の面射時に生ずる区別しうる電磁気信号によって
異なる２種の粒子を有する特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ５ 該粒子の１方が蛍光体で標識され、該粒子の他方が
蛍光で標識されてない特許請求の範囲８１毛４項記載の
方法。 ６．２種の粒子が存在し、１つの粒子が該試料からの赤
血球であり、他の粒子が蛍光体で標識された赤ｓ（、ｎ
球である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７１つの粒子を有するか又は有さガい高い確率を持つの
に十分な少量の試料を監視することにより、個々の粒子
を、予じめ決められた波長範囲内の蛍光に関して監視す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 異なる最大放射を有する２つの蛍光体ｌ・１及びＦ
２を用いることにより、人間の血液型に対するＡＢＯ、
αＡ及びαＢを年−の分析媒体中で決定する方法であっ
て、該蛍光体がαＡ及びαＢに結合してαＡ−Ｆ、及び
αＢ−Ｆ２ｆ与え、そしてＡ及びＢの表現型粒子が検知
しりる光信号ｉｚｃよって元の赤血球から区別すること
ができ、血液、αＡ −ｐ Ｈ及びαＢ−ｐ２、そして
該Ａ及びＢの表現型粒子から得られる試料を分析媒体中
で一緒にし； 該分析媒体の少くとも一部分をＦｌ及びＦ２に対する励
起光で照射し； 該血液中の該粒子及び赤血球と１４Ｕ連するｆ゛１及び
Ｆ２からの蛍光を検知して、Ｆｌ及びＦ２がそれぞれ該
粒子に及び該赤血球に結合しているがどうかを決定し、
そして 該蛍光を血液型に及びαＡ及びαＢの存在に関連づける
、 ことを含んでなる該血液型に対するＡＢＯ、αＡ及びα
Ｂの惨舖法。 ９ 該分析媒体が花釈され、緩衝された全血である特許
請求の範囲第８項記載の方法。 １０、該Ａ及び８表現型の粒子が１・１及びＦ２の蛍光
放射から区別しうる波長で放射する蛍光体１′”ｓ’Ｔ
標識された赤血球である特許請求の範囲第８項記載の方
法。 １ ］、、 Ｆ３が該Ａ及び８表現型粒子に共有的に
配合している特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ αＡ−Ｆ、、αＢ−Ｆ２及びＡ及び８表現型粒子
を、検知しうる光信号によって赤血球から区別しうる相
対量で含んで麿る特許請求の範囲第８項記ＴＷ＜の方法
で使用するためのキット。 １３ 複数のパラメータを決定する方法であっテ、該ハ
ラメータは特異的結合具のエピトープ部位及び結合部位
であり、該結合具ｄ−それぞれ配位体及び相反的受体で
るシ、但し少くとも１つのパラメータを含有する結合具
は粒子に結合しており、−Ｆ配力法は少くとも１つの員
及び少くとも１つの粒子に結合した１つの蛍光標識を言
んでおり、上記方法は、 （ａ） 測定されるべき２つのパラメータをもつ試料； （ｂ） 各パラメータに関して連続的々添加順序で、 （ｉ） パラメータを含む結合具が粒子に結合してい
る場合には、蛍光体で標識された相反的結合具； （１１）パラメータを含む結合具が結合していない場合
には、相反的結合具を有する粒子及び該パラメータを含
む結合具に同族の蛍光体で標識された結合具、 を液体媒体中において一緒にし、但し 第２の添加において蛍光体で標識された結合具だけを添
加する場合結合事象がすでに起こっている結合事象に関
して少くとも約２倍増大し；且つ第２の添加において粒
子を添加する場合媒体中の粒子の数が少くとも約２倍に
なり； 該粒子を光で照射し、但し該粒子は連続的媒体中に懸濁
され； 第１の添加後いき値から異なる粒子の集団を電磁気シグ
ナルに関して及び第２の添加後いき値から異なる粒子の
集団を電磁気シグナルに関して決定し；そして 該集団を該試料中の該パラメータの存在に関連づける、 ことを含んでなる複数のパラメータの決定法。 １４ 該試料が血液に由来し、該ノ々ラメータがＡ 、
）３ 、αＡ及びαＢである特許請求の範囲第１３項
記載の方法。
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