CN111308075A - 多肿瘤联合检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

多肿瘤联合检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种多肿瘤联合检测试剂盒，包括：能够进行时间分辨的荧光微球，信号放大系统，第一肿瘤相关蛋白，样本待测物，第二肿瘤相关蛋白和高分子荧光编码微球。本申请还公开了所述试剂盒的使用方法，包括，加入待测样本，孵育震荡处理，形成高分子荧光编码‑第二肿瘤相关蛋白+待测物+第一肿瘤相关蛋白‑能够进行时间分辨的荧光微球的反应混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器收集荧光信号，同时第二激光器激发，短寿命背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启并采集信号用以分析处理。

Description

多肿瘤联合检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种多肿瘤联合检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)，国际癌症研究机构(IARC)，近日发布最新报告称，经估计全世界罹患癌症的人数在“迅速增长”，仅2018年一年就新增1810万病例，死亡人数高达960万，到本世纪末，癌症将成为全球头号“杀手”，也是阻碍人类预期，寿命延长的最大“拦路虎”。
其中亚洲癌症新发全球占比48.4％，相当于是全球的新发的1/2，而在960万的癌症死亡病例中亚洲则占了近60％。在1810万癌症新发病例，超过半数为男性，有950万人，其发病率为总数的50％，死亡率达60％，而癌症新发病例中有860万为女性患者，其发病率占总数的47.5％，死亡率略微超过一半。
而在我国，癌发病率也呈上升趋势，中国平均每年有超过400万人被确诊癌症，平均每天有超过1万人确诊癌症，平均每分钟有7个人得癌症，每天有6000多人死于癌症，每分钟有将近5人死于癌症。
对于日益高发的癌症，唯一的办法就是早期发现、早期治疗。据介绍，近30年来日本癌症死亡率下降了27％，五年存活率高达68％，居世界首位。在日本80％的癌症在早初期就被检查出来，其中80％的人可以得到治愈，说明早期发现才是提高生存率的关键。但在中国则是相反的，80％以上的癌症确诊发现时已是癌症中晚期，错过了最佳的治疗时机。值得注意的是，早期癌症能够被检查出来的时间机会通常只有1-2年。因此，在正确的指导下，定期接受筛查才是最有意义的。
不同的癌症有不同的筛查方法，肿瘤早筛就是以专业的筛查方法将可能患早期癌症的病人找出来。早期治疗，提高病人的生活质量和降低治疗费用。因而需要准确高效的检测诊疗手段使病情及早被发现。
目前肿瘤检测方法有很多，如化学发光法、胶体金方法、免疫荧光法、酶联免疫法等，这些方法一次只能检测一个指标，一个肿瘤项目，而Luminex的流式荧光虽然一次可以检测多个指标和项目，它采用澡红蛋白作为荧光报告物质，用532nm的绿色激光激发，因在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，澡红蛋白荧光寿命非常短，大部分背景荧光信号也同时存在，使得本底背景值过高，检测灵敏度很低。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种多肿瘤联合检测试剂盒，以解决相关技术中一次只能检测一个指标和肿瘤项目以及检测灵敏度低的问题。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了一种多肿瘤联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：能够进行时间分辨的荧光微球，信号放大系统，第一肿瘤相关蛋白，第二肿瘤相关蛋白和高分子荧光编码微球。
优选地，所述肿瘤蛋白选自肿瘤抗体、抗原和蛋白中的至少一种。
优选地，所述信号放大系统包括链霉亲和素和生物素。
优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球与所述第一肿瘤相关蛋白直接或间接相连，优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球或量子点荧光微球通过信号放大系统与所述第一肿瘤相关蛋白相连。
每个肿瘤的抗原和抗体分别与能够进行时间分辨的荧光微球通过共价键连接，相对应配对的每个肿瘤抗体或抗原分别与不同种荧光编码的的高分子荧光编码微球7通过共价键连接，连接后通过一定比例混合，形成能够进行时间分辨的荧光微球肿瘤的抗原或抗体混合液和高分子荧光编码微球的肿瘤抗体或抗原的混合液，在同一微孔的同一反应体系内加入待测样本后，不同肿瘤抗原和抗体分别与待测样本的待测物结合，形成“高分子荧光编码-抗体(或抗原)+待测物+抗体(或抗原)-能够进行时间分辨的荧光微球”的反应多元混合物。
优选地，所述高分子荧光编码微球与所述第二肿瘤蛋白直接或间接相连，优选地，所述高分子荧光编码微球通过信号放大系统与所述第二肿瘤蛋白相连。
优选地，所述第一肿瘤蛋白为至少一种肿瘤相关抗体或抗原，所述第二肿瘤蛋白为至少一种肿瘤相关抗体或抗原。
优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为量子点荧光物质或稀土镧系元素或其螯合物的液体或固体微球，优选为铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)之一或其任意组合。
本申请的另一个方面提供所述多肿瘤联合检测试剂盒的使用方法，所述使用方法的步骤包括，加入待测样本，进行孵育震荡处理，形成高分子荧光编码-第二肿瘤相关蛋白+待测物+第一肿瘤相关蛋白-能够进行时间分辨的荧光微球的反应多元混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，待短寿命的背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
本发明的技术方案具有以下优点：
本发明使用能够进行时间分辨的荧光微球替代传统的澡红蛋白，同时改变激发波长，从532nm，改为340nm或365nm，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分析，可以有效抵排除非特异性荧光，极大地提高分析的灵敏度，降低本底干扰，重复性好。既可以有时间分辨荧光技术消除本底干扰的优点，又可以高通量一次检测多个指标，实现样本的批量处理。
本发明使用的能够进行时间分辨的荧光微球指的是量子点荧光微球或稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)元素或其螯合物，荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求。
截至目前，将时间分辨荧光和流式细胞技术互补结合用于检测多肿瘤检测的试剂盒还未查到相关报告。本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种在同一反应体系内同时综合检测多种肿瘤蛋白指标的时间分辨流式荧光免疫检测试剂盒。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是根据本申请实施例提供的一种多肿瘤联合试剂盒内各组分的连接关系示意图。
附图标记
1-能够进行时间分辨的荧光微球；
2-链霉亲和素；
3-生物素；
4-第一肿瘤蛋白；
5-待测物；
6-第二肿瘤蛋白；
7-高分子荧光编码微球。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
如图1所示，不同种类编码的高分子荧光编码微球7分别与1到100种肿瘤相关的抗体或抗原进行偶联，然后按一定比例混合，形成多种肿瘤的高分子编码微球悬液A，时间分辨荧光微球或量子点荧光微球也分别与1到50种相配对的肿瘤相关抗体或抗原进行交联，按照一定比例，形成多种肿瘤的时间分辨微球悬液B，再加入待检样本，然后在加入时间分辨微球悬液B，形成微球混合液，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内即可以同时完成数十上几百种不同的生物学反应，而不相互干扰。最后用时间分辨流式荧光检测分析装置进行测定，微球混合液被两束激光进行分析。一束635nm的红色激光激发微球自身的荧光物质，用于分辨检测的不同项目，而另一束340nm或365nm的激光激发时间分辨荧光微球(镧系元素如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)等或其螯合物)，用于检测反应结合的量。高速的激光信号处理读取微球编码对其分类，同时对其表面的反应进行定量。不同之处在于，检测中在340nm或365nm激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命时间分辨荧光微球发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。过程为：第一激光器激发的微球与蛋白、抗体或核酸探针的共价交联，第二激光器激发的时间分辨荧光物质与蛋白、抗体或核酸探针的共价交联，加入待测样本后，经前置系统进行孵育震荡处理，微球混合液与鞘液一起输送到流动室，微球混合液依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，延迟一定时间后，通常10纳秒到8000毫秒，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
实施例二
不同种类的高分子荧光编码微球7分别与1到100种第二蛋白进行偶联，然后按一定比例混合，形成高分子编码微球悬液A，时间分辨荧光微球或量子点荧光微球与链霉亲和素偶联，形成时间分辨荧光微球-链霉亲和素复合物。与高分子编码微球蛋白对应的1到100种第一蛋白分别与生物素交联，形成生物素化的第一蛋白，然后按照一定比例，把生物素化的第一蛋白和时间分辨荧光微球-链霉亲和素复合物混合，形成时间分辨微球悬液B，再加入待检样本，形成微球混合液(高分子荧光编码-第二蛋白+待测物+链霉亲和素-时间分辨荧光微球(或量子点荧光微球)+生物素化的第一蛋白的反应多元混合物)，最后用时间分辨流式荧光检测分析装置进行测定，过程为：第一激光器激发的高分子编码微球与第二蛋白交联，第二激光器激发的时间分辨荧光物质与第一蛋白交联，加入待测样本后，经前置系统进行孵育震荡处理，形成的多元混合物与鞘液一起输送到流动室，微球混合液依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，延迟一定时间后，通常10纳秒到1500毫秒，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
经过时间分辨荧光微球或量子点荧光微球测得的本底信号值很低，与仪器的背景信号类似，大大低于普通的流式荧光检测试剂的信号值。同时在检测灵敏度、线性范围等性能方面也有极大提高。而且可以实现多种肿瘤标志物的联检，大大缩短时间，提高效率。
实施例三
使用本发明的试剂盒进行多肿瘤联合检测，步骤如下：
一、高分子荧光编码微球蛋白偶联
取100微升高分子荧光编码微球放到1.5毫升离心管中，离心,沉淀用去离子水和活化缓冲液各洗一次(洗时漩涡振荡并超声处理20s),重悬于活化缓冲液中。在微球中先后加入新鲜配制的偶联剂,轻轻混匀,室温下避光轻微振摇，中间漩涡振荡一次。然后将微球离心,沉淀用交联缓冲液洗涤,重悬于交联缓冲液中。在已活化的微球悬液中加入蛋白,并用交联缓冲液补足体积,室温避光温和振荡,然后4℃振荡过夜。离心微球,加入封闭液,室温避光振荡，取少量微球悬液用水适当稀释,显微镜下计数微球个数,计算微球悬液的浓度。最后避光保存于4℃。
二、时间分辨荧光微球或量子点荧光微球与蛋白偶联
取100微升时间分辨荧光微球或量子点荧光微球放到1.5毫升离心管中，离心,沉淀用去离子水和活化缓冲液各洗一次(洗时漩涡振荡并超声处理20s),重悬于活化缓冲液中。在微球中先后加入新鲜配制的偶联剂,轻轻混匀,室温下避光轻微振摇，中间漩涡振荡一次。然后将微球离心,沉淀用交联缓冲液洗涤,重悬于交联缓冲液中。在已活化的微球悬液中加入蛋白,并用交联缓冲液补足体积,室温避光温和振荡,然后4℃振荡过夜。离心微球,加入封闭液，最后避光保存于4℃。
三、生物素标记抗体的制备
取出待标记的生物素，平衡至室温，称取生物素1mg，溶于200uL超纯水，配制成5mg/mL的溶液，根据生物素试剂盒推荐的所需蛋白量，加入5mg/mL生物素溶液，4℃旋转2h，将标记好的生物素化蛋白，分装-80摄氏度保存备用。
四、检测方法
以双抗夹心的检测为例，检测过程反应在96孔板进行，将偶联了抗体的微球稀释为2000个/50uL,加入到96孔板中，50uL/孔，真空抽去液体，然后加入待测样品，室温震荡1.5h，用含有0.1％的吐温-20的磷酸缓冲液洗涤2次并抽滤，加入生物素标记的蛋白，50uL/孔，混匀后室温避光震荡1h，洗涤，加入时间分辨荧光微球或量子点荧光微球的蛋白偶联液，混匀，洗涤。用在时间分辨流式荧光仪器上检测。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：能够进行时间分辨的荧光微球，信号放大系统，第一肿瘤相关蛋白，第二肿瘤相关蛋白和高分子荧光编码微球，所述能够进行时间分辨的荧光微球选自时间分辨荧光微球和量子点荧光微球中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述肿瘤蛋白选自肿瘤抗体、抗原和蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述信号放大系统包括链霉亲和素和生物素。
4.根据权利要求1所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球与所述第一肿瘤相关蛋白直接或间接相连，优选地，所述能够进行时间分辨的荧光微球通过信号放大系统与所述第一肿瘤相关蛋白相连。
5.根据权利要求1所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述高分子荧光编码微球与所述第二肿瘤相关蛋白直接或间接相连，优选地，所述高分子荧光编码微球通过信号放大系统与所述第二肿瘤相关蛋白相连。
6.根据权利要求1所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述第一肿瘤蛋白为至少一种肿瘤相关抗体或抗原，所述第二肿瘤蛋白为至少一种肿瘤相关抗体或抗原。
7.根据权利要求6所述的多肿瘤联合检测试剂盒，其特征在于，所述能够进行时间分辨的荧光微球的荧光物质为量子点荧光微球或稀土镧系元素或其螯合物的液体或固体微球，优选为铕、铽、钐之一或其任意组合。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的多肿瘤联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步骤包括，加入待测样本，进行孵育震荡处理，形成高分子荧光编码-第二肿瘤相关蛋白+待测物+第一肿瘤相关蛋白-能够进行时间分辨的荧光微球的反应多元混合物，用时间分辨流式荧光检测装置进行高通量测试，样本液与鞘液一起输送到流动室，待测液微粒依次通过流动室毛细管检测区域，第一激光器激发，第一激光器荧光检测器通过集光器收集荧光信号，同时第二激光器激发，待短寿命的背景荧光衰变消失后，第二激光器时间分辨荧光检测单元开启通过集光器记录采集荧光信号，采集的信号经数据采集系统分析处理。
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