CN102353793A - 白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，以包被融合蛋白捕获抗体的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1、包被同型对照抗体的另一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2组建检测白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列，微球1、微球2、融合蛋白、报道抗体和/或PE荧光标记的二抗共孵育后，流式细胞仪检测二元流式液相阵列，融合蛋白表达值表示为微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的二者比值。该方法能够应用于白血病病理、分子诊断和抗白血病药物发现等生物医学研究领域。本发明的方法能够有效消除系统误差，具有快速、准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白血病细胞内融合蛋白的检测方法。
背景技术
流式液相阵列(又称流式微球阵列)是能保证信息质量和提供相对高通量的分子探测平台，与其技术原理相同的液相芯片技术是美国FDA2001年批准的首个临床型阵列分析技术。流式液相阵列中，微球锚定的捕获分子(抗体或核酸探针)捕获靶点分子，荧光标记的报道分子(抗体或核酸探针)报道靶点分子，一种或几种不同浓度荧光编码的微球组建阵列即可进行多参数并行分析。阵列解码常用生物医学工程仪器流式细胞仪或专用液相芯片仪。流式液相阵列具有灵敏度高、特异性强、数据图像化及多任务定量的显著优点。
流式液相阵列已广泛应用于分子诊断、药物发现、检验检疫、免疫技术和细胞学等领域。以荧光编码微球和核酸探针构建的流式液相阵列可以实施白血病诊断和微小残留病监测；基于流式液相阵列的分子结合分析能够同步筛选配基竞争性和ATP竞争性受体酪氨酸激酶拮抗剂，“敲除”药物抵抗先导物，避免放射法污染，可以快速、准确、有效地发现抗肿瘤先导药物；此外探测细胞信号通路传导的流式液相阵列也见诸报道。相比其它生物分子检测手段，基于荧光编码微球的流式液相阵列和液相芯片具有下述突出优点：(1)相对高通量。可以并行检测多个参数；(2)灵敏度高。检测下限约为10pg/mL；(3)微量检测。所需样本少，特别是临床检验只需几微升血液样品，即可快速完成多个并行临床参数检测。
白血病存在因染色体畸变而产生的融合基因和融合蛋白，异常染色体、融合基因和融合蛋白分别是白血病细胞生物学和分子生物学特异性标志。目前白血病细胞内融合蛋白表达水平常用的检测方法为逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、定量聚合酶链反应(quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR)、细胞遗传学、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和单群微球流式分析。研究表明，RT-PCR技术简易，但检测的是mRNA逆转录cDNA拷贝，易受反应条件影响，产生假阴性或假阳性结果；Q-PCR检测敏感性超过10-4，达到10-5分子水平缓解标准，但只有管家基因mRNA拷贝数高于2.5x105，结果才有效；染色体核型分析数目少，定量困难；非流式FISH技术3％左右的假阳性率过高，不适用于白血病细胞内融合蛋白表达检测；白血病细胞内融合蛋白的单群微球流式分析方法变异系数大。
发明内容
针对现有检测方法的不足，本发明提供了一种白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，可以快速、准确地检测白血病细胞内融合蛋白含量。
术语说明：
FITC：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)；
Alexa Fluor 488荧光：一种荧光染料的商品名称，本领域公知产品；
Sulfo-NHS：N一羟基硫代琥珀酰亚胺；
EDC：碳二亚胺；
MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate，简称MES
PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)；
PE：藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)；
PBS-2％BSA溶液：含2％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)；
AEBSF：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoridehydrochloride，简称AEBSF；
wella：a孔；
wellb：b孔；
wellc：c孔；
HBSS’s液：Hank’s平衡盐溶液，Hank’s balanced salt solution，简称HBSS’s液。
本发明的技术方案如下：
白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括两种浓度FITC或两种浓度Alexa Fluor 488荧光标记的微球、融合蛋白捕获抗体、融合蛋白报道抗体、同型对照抗体、PE荧光标记的二抗、缓冲液和流式细胞仪检测，其特点在于以包被融合蛋白捕获抗体的一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1、包被同型对照抗体的另一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2组建检测白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列，流式细胞仪检测阵列所得微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的二者比值为融合蛋白表达值。
白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括步骤如下：
(1)利用现有技术抽提白血病细胞内融合蛋白；备用。
(2)二元流式液相阵列的组建：
10000～100000个一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，
10000～100000个另一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，
用200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；
wella和wellb孔中分别加入含0.0001～0.01g Sulfo-NHS和0.0001～0.01g EDC的200μL的MES缓冲液(pH 6.0)，混匀、室温、振荡、避光孵育20分钟；
wella、wellb孔中的微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入1～50μg融合蛋白捕获抗体，含微球2的wellb孔中加入1～50μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH 7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；
(3)白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测，选自下列方案之一：
方案1：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1、微球2各1000～10000个混合并加入到wellc孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀，室温、避光孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.1～10μg融合蛋白报道抗体，混匀，避光、室温孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入0.1～10μgPE荧光标记的二抗，混匀，避光、室温孵育30分钟；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度。
方案2：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1、微球2各1000～10000个混合并加入到wellc孔中，加入0.1～10μg PE荧光标记的融合蛋白报道抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪FITC或Alexa Fluor 488 versus PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度。
(4)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：
白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度，或微球2的PE荧光强度÷微球1的PE荧光强度。
上述步骤(1)中所述融合蛋白提取自白血病患者细胞、白血病细胞系、白血病细胞株的细胞质中或/和细胞核中的融合蛋白。
上述步骤(2)中所用微球的平均直径均为1～10微米，同时含有氨基和羧基集团。标记微球的荧光浓度范围为0.1～1000μg/mL；标记微球1和微球2的荧光两种浓度之差为4-2500倍。
上述步骤(2)中所述融合蛋白捕获抗体是一种能够特异性识别融合蛋白表位的抗体。依据现有技术，具体选自可识别融合蛋白的C端或N端的抗体。本发明以实施例1中anti-PML作为优选的白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα捕获抗体，以实施例2中anti-BCR作为优选的白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL捕获抗体，详见：Chan H.E.H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar M.Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry.Methods in MolecularBiology，2007，378：Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols.Edited by：M.Albitar.
上述步骤(3)中所述融合蛋白报道抗体是一种能够特异性识别融合蛋白另一个表位的抗体。依据现有技术，具体选自可识别融合蛋白的N端(捕获抗体识别C端)或C端(捕获抗体识别N端)的抗体。本发明以实施例1中anti-RARα作为优选的白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα报道抗体，以anti-ABL抗体作为优选的白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL报道抗体，详见：Chan H.E.H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar M.Detection of Chromosome Translocations byBead-Based Flow Cytometry.Methods in Molecular Biology，2007，378：Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols.Edited by：M.Albitar.
上述步骤(3)中所述PE荧光标记的二抗是一种能够识别融合蛋白报道抗体的标记PE荧光的抗体。本发明以实施例1中PE荧光标记的抗RARα抗体的抗体作为优选的可识别白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα报道抗体的抗体，详见：Chan H.E.H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar M.Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry.Methods in MolecularBiology，2007，378：Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols.Edited by：M.Albitar.
上述步骤(4)中所述微球1的PE荧光强度、微球2的PE荧光强度是指流式细胞仪测定的PE荧光染料的算术平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)或PE荧光染料的几何平均荧光强度(geo mean fluorescence intensity)。
上述步骤(1)白血病细胞内融合蛋白抽提可采用现有技术，本发明优选如下：
白血病细胞收集后，计数，用冷的PBS缓冲液洗涤白血病细胞系一次，1200～2000转/分钟离心3～10分钟，除去上清液，收集1～5×106个细胞，手指用力弹散细胞，加入含10～100mMAEBSF的1mL PBS缓冲液预处理细胞，涡旋振荡器振荡细胞10秒，冰上反应15分钟；离心收集细胞，使用现有商品化细胞蛋白抽提试剂盒提取细胞内融合蛋白，-70℃冻存，用于所述步骤(3)的流式液相阵列检测。
在本发明中，所述的微球1、微球2是使用两种不同的浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记。标记微球的荧光染料两种浓度之差约为4-2500倍。
所述的微球材料为聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物，在微球材料内部或表面携带氨基基团和羧基基团的微球，或者是在所述的微球材料内部和表面均携带氨基基团和羧基基团的微球。
优选的，所述的微球是4～10微米直径、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球。
本发明所述的荧光标记的微球可以通过市场购买，也可以使用常规方法制备，例如以下方法：
单分散法制备荧光标记的、氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，步骤如下：
在带有搅拌装置、通氮气溶液的三口烧瓶中，加入稳定剂和溶剂，升温并搅拌成无颗粒均相体系，再加入引发剂、单体、带有氨基基团(-NH2)的有机化合物、带有羧基基团(-COOH)的有机化合物、荧光染料和交联剂，保持温度、氮气气氛和搅拌速度，聚合8-72小时，反应结束后，冷却至室温，将聚合得到的样品用离心机分离，弃去上层清液，然后洗涤下层微球，再离心，如此反复3次洗涤，干燥微球，收集样品并存贮在100mL棕色瓶中。详见：冯爱玲，吴道澄，吴红，杨青艳.荧光素三元共聚纳米微粒的合成及其荧光性质.第四军医大学学报，2005；26(4)：325-329。
本发明的上述方法，使用二元流式液相阵列，可实现白血病细胞内融合蛋白的检测。
本发明的优选技术方案如下：
(1)白血病细胞内融合蛋白抽提：细胞收集后，计数，用冷的PBS缓冲液洗涤白血病细胞系一次，2000转/分钟离心3分钟，除去上清液，收集1.25×106个细胞，手指用力弹散细胞，加入含60mM AEBSF的1mL PBS缓冲液预处理细胞，涡旋振荡器振荡细胞10秒，冰上反应15分钟，离心收集细胞，使用现有商品化细胞蛋白抽提试剂盒抽提细胞内融合蛋白，-70℃冻存，用于后面的液相阵列检测。
所述的融合蛋白选自：白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα，白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL。
(2)二元流式液相阵列的组建：
微球1是浓度2.5～500μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是浓度0.2～10μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球1是浓度0.2～10μg/mL的FITC或AlexaFluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是浓度2.5～500μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；标记微球1和微球2的荧光染料两种浓度之差为12.5-50倍；
20000个微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，20000个微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分别加入含0.001g Sulfo-NHS和0.001g EDC的200μL MES缓冲液(pH 6.0)，混匀，室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入20μg融合蛋白捕获抗体，含微球2的wellb孔中加入20μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH 7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；
(3)白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测：
方案1：将步骤(1)制备的50μL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1、微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀，室温、避光孵育1小时；微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.25μg融合蛋白报道抗体，混匀，避光室温孵育1小时；微球洗涤并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入2.5μg PE荧光标记的二抗，混匀，避光、室温孵育30分钟；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度。
方案2：将步骤(1)制备的50μL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1、微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入0.25μg PE荧光标记的融合蛋白报道抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE点图检测微球1和微球2PE荧光强度。
(4)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：
白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度，或微球2的PE荧光强度÷微球1的PE荧光强度。
本发明白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，以包被融合蛋白捕获抗体的一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1、包被同型对照抗体的另一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2组建检测白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列，微球1、微球2、融合蛋白、报道抗体和/或PE荧光标记的二抗共孵育后，流式细胞仪检测二元流式液相阵列，融合蛋白表达值表示为微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度二者的比值，该方法能够应用于白血病病理、分子诊断和抗白血病药物发现等生物医学研究领域。本发明的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法能够有效消除系统误差，具有快速、准确的优点。
附图说明
图1是FITC荧光标记的二元流式液相阵列流式点图，上方微球包被anti-PML捕获抗体，下方微球包被同型对照抗体；
图2是白血病NB4细胞系融合蛋白PML-RARα的二元流式液相阵列流式检测点图，白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα表达值＝微球1(上方)的PE荧光强度÷微球2(下方)的PE荧光强度。
具体实施方式
下面给出本发明的实施例，这是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例中使用的荧光标记的微球1和微球2是按现有技术制备的，其中，微球是5.4微米氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，制备方法参见：冯爱玲，吴道澄，吴红，杨青艳.荧光素三元共聚纳米微粒的合成及其荧光性质.第四军医大学学报，2005；26(4)：325-329。利用本发明人在先申请专利文件进行微球FITC荧光标记，参见CN101846676A：一种氨基化微球的荧光编码方法，申请号201010166375.7。
实施例中使用的anti-PML、anti-RARα及其同型对照抗体为Santa cruz biotechnology公司产品，anti-BCR、anti-ABL及其同型对照抗体同样为Santa cruz biotechnology公司产品；NB4细胞系、K562细胞系和HL-60细胞系由浙江大学第二附属医院肿瘤中心提供，流式细胞仪为BD Bioscience公司产品。
实施例1、白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα的二元流式液相阵列检测方法
(1)正常人血液中单个核细胞的收集：取新鲜的抗凝样本血样，与HBSS’s液1∶1混匀后，小心加于细胞分离液的液面上，以1500转/分钟离心15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层，收集第二层细胞，细胞沉淀用HBSS’s液反复洗涤2次即得所需细胞。
(2)白血病细胞NB4内融合蛋白PML-RARα的抽提：NB4细胞、K562细胞、HL-60细胞和正常人单个核细胞收集后，计数，用冷的PBS缓冲液洗涤细胞一次，2000转/分钟、3分钟离心，除去上清液收集细胞；将NB4细胞与步骤(1)收集的正常人单个核细胞混合，NB4细胞所占百分比分别为0.01％、0.1％、1％、10％和100％；收集约1.25×106个混合细胞，移液枪尽可能吸取上清，手指用力弹散细胞，各加入含60mM AEBSF的1mL PBS缓冲液预处理细胞，涡旋振荡器振荡细胞10秒，冰上反应15分钟，离心收集细胞，取细胞核蛋白提取试剂盒中45μL冰的细胞质蛋白提取液至细胞离心管中，混匀细胞，涡旋振荡器振荡15秒，将离心管冰上孵育10分钟，加入5μL酶抑制剂，涡旋振荡器振荡15秒混匀，室温反应10分钟，然后冰上孵育1分钟，15000转/分钟、4℃离心5分钟；沉淀重悬于50μL细胞核蛋白提取液，再加入2.5μL蛋白酶抑制剂，涡旋振荡器振荡15秒，将离心管置于冰上孵育，每隔10分钟振荡混匀一次，共孵育40分钟，15000转/分钟、4℃离心5分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为细胞核蛋白抽提液，-70℃冻存，用于后续的二元流式液相阵列检测。
(3)检测白血病细胞NB4内融合蛋白PML-RARα的二元流式液相阵列的组建(图1)：
微球1按CN101846676A实施例1中2.5μg/mL FITC荧光标记方法制备，微球2按CN101846676A实施例1中0.2μg/mL FITC荧光标记制备。
20000个微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，20000个微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分别加入含0.001g Sulfo-NHS和0.001g EDC的200μL MES缓冲液(pH 6.0)，混匀、室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入20μg anti-PML抗体，含微球2的wellb孔中加入20μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH 7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；
(4)白血病细胞NB4内融合蛋白PML-RARα的二元流式液相阵列的检测(图2)：将步骤(2)制备的50μL细胞核蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(3)制备的包被抗体的微球1、微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育1小时；微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.25μg anti-RARα抗体，混匀、避光室温孵育1小时；微球洗涤并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入2.5μg PE荧光标记的二抗，混匀、避光室温孵育30分钟；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC vers PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度。
(5)按以下公式计算得白血病细胞NB4内融合蛋白PML-RARα定量数据：
白血病细胞NB4内融合蛋白PML-RARα表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度。
(6)标准曲线的绘制：log NB4细胞浓度vers log PML-RARα融合蛋白表达值绘制标准曲线，计算分析灵敏度。
本实施例的二元流式液相阵列检测中，50μL正常人单个核细胞核蛋白提取液的微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的比值为1.31±0.07(平均值±标准差)，50μL白血病细胞NB4核蛋白提取液的微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的比值为56.08±6.66(平均值±标准差)，融合蛋白PML-RARα表达值以其剂量依赖方式增加，分析灵敏度以(空白值均数+3x标准差)带入标准曲线方程计算为0.65％(NB4细胞数百分比)，未能在K562或HL-60细胞中检测到PML-RARα融合蛋白。
实施例2、本实施例中的微球和微球荧光编码同实施例1。
白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相阵列检测方法，步骤如下：
(1)正常人血液中单个核细胞的收集：取新鲜的抗凝样本血样，与HBSS’s液1∶1混匀后，小心加于细胞分离液的液面上，以1500转/分钟离心15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。收集第二层细胞，细胞沉淀用HBSS’s液反复洗涤2次即得所需细胞。
(2)白血病细胞K562内融合蛋白BCR-ABL的提取：K562细胞、NB4细胞、HL-60细胞和正常人单个核细胞收集后，计数，用冷的PBS缓冲液洗涤细胞一次，2000转/分钟、3分钟离心，除去上清液收集细胞；K562细胞与步骤(1)收集的正常人单个核细胞混合，K562细胞所占百分比分别为0.01％、0.1％、1％、10％和100％；收集约1.25×106个混合细胞，移液枪尽可能吸取上清，手指用力弹散细胞，各加入含60mM AEBSF的1mL PBS缓冲液预处理细胞，涡旋振荡器振荡细胞10秒，冰上反应15分钟；离心收集细胞，加入全细胞蛋白提取试剂盒中50μL冰的RIPA裂解液，涡旋振荡器振荡15秒，将离心管冰上孵育10分钟，15000转/分钟、4℃离心5分钟，立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的全细胞蛋白，-70℃冻存，用于后面的二元流式液相阵列检测。
(3)检测白血病细胞K562内融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相阵列的组建：
微球1按CN101846676A实施例1中2.5μg/mL FITC荧光标记方法制备，微球2按CN101846676A实施例1中0.2μg/mL FITC荧光标记制备。
20000个微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，20000个微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分别加入含0.001g Sulfo-NHS和0.001g EDC的200μL MES缓冲液(pH 6.0)，混匀，室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入20μg anti-BCR抗体，含微球2的wellb孔中加入20μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH 7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；
(4)白血病细胞K562内融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相阵列检测：将步骤(2)制备的50μL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(3)制备的包被抗体的微球1、微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入0.25μg PE荧光标记的anti-ABL抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC vers PE点图检测微球1和微球2PE荧光强度。
(5)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：
白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度。
(6)标准曲线的绘制：log K562细胞浓度vers log BCR-ABL融合蛋白表达值绘制标准曲线，计算分析灵敏度。
本实施例的二元流式液相阵列检测中，50μL正常人单个核细胞蛋白抽提液的微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的比值为1.29±0.09(平均值±标准差)，50μL白血病细胞K562蛋白抽提液的微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的比值为62.15±5.97(平均值±标准差)，融合蛋白BCR-ABL表达值以其剂量依赖方式增加，分析灵敏度以(空白值均数+3x标准差)带入标准曲线方程计算为为0.51％(K562细胞数百分比)，未能在NB4或HL-60细胞中检测到BCR-ABL融合蛋白。
Claims (10)
1.白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括两种浓度FITC或两种浓度Alexa Fluor 488荧光标记的微球、融合蛋白捕获抗体、融合蛋白报道抗体、同型对照抗体、PE荧光标记的二抗、缓冲液和流式细胞仪检测，其特点在于以包被融合蛋白捕获抗体的一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1、包被同型对照抗体的另一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2组建检测白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列，流式细胞仪检测阵列所得微球1的PE荧光强度与微球2的PE荧光强度的二者比值为融合蛋白表达值。
2.如权利要求1所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括步骤如下：
(1)利用现有技术抽提白血病细胞内融合蛋白；
(2)二元流式液相阵列的组建：
10000～100000个一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，10000～100000个另一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分别加入含0.0001～0.01g Sulfo-NHS和0.0001～0.01g EDC的200μLMES缓冲液(pH 6.0)，混匀、室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入1～50μg融合蛋白捕获抗体，含微球2的wellb孔中加入1～50μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；得包被融合蛋白捕获抗体的微球1和包被同型对照抗体的微球2；
(3)白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测，选自下列方案之一：
方案1：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1与微球2各1000～10000个混合并加入到wellc孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.1～10μg融合蛋白报道抗体，混匀、避光室温孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入0.1～10μg PE荧光标记的二抗，混匀、避光室温孵育30分钟；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，用流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE点图检测微球1和微球2PE荧光强度；
方案2：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1与微球2各1000～10000个混合并加入到wellc孔中，加入0.1～10μg PE荧光标记的融合蛋白报道抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，用流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE点图检测微球1和微球2PE荧光强度；
(4)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：
白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度，或微球2的PE荧光强度÷微球1的PE荧光强度。
3.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于所述微球的平均直径均为1～10微米，FITC或Alexa Fluor 488荧光染料浓度范围为0.1～1000μg/mL，荧光染料两种浓度之差为4-2500倍。
4.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于步骤(2)中所用的捕获抗体是以anti-PML、anti-BCR分别作为白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα、白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL的捕获抗体。
5.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于步骤(3)中所用的报道抗体是以anti-RARα、anti-ABL分别作为白血病细胞NB4融合蛋白PML-RARα、白血病细胞K562融合蛋白BCR-ABL的报道抗体。
6.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于所用微球1是一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球；所用微球2是另一种浓度FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球；标记微球1和微球2的荧光染料两种浓度之差为4-2500倍。
7.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于所述微球的材料为聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物之一或组合，在微球材料内部或表面携带氨基基团和羧基基团，或者是在所述的微球材料内部和表面均携带氨基基团和羧基基团的微球。
8.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于步骤(4)中白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度，或微球2的PE荧光强度÷微球1的PE荧光强度。
9.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于步骤(4)中所述微球1的PE荧光强度和微球2的PE荧光强度是指流式细胞仪测定的PE荧光染料的算术平均荧光强度或PE荧光染料的几何平均荧光强度。
10.如权利要求1或2所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，其特征在于步骤如下：
(1)白血病细胞内融合蛋白抽提：细胞收集后，计数，用冷的PBS缓冲液洗涤白血病细胞系一次，2000转/分钟离心3分钟，除去上清液，收集1.25×106个细胞，手指用力弹散细胞，加入含60mM AEBSF的1mL PBS缓冲液预处理细胞，涡旋振荡器振荡细胞10秒，冰上反应15分钟，离心收集细胞，使用现有商品化细胞蛋白抽提试剂盒抽提细胞内融合蛋白，-70℃冻存，用于后面的液相阵列检测；
(2)二元流式液相阵列的组建：
微球1是浓度2.5～500μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是浓度0.2～10μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球1是浓度0.2～10μg/mL的FITC或AlexaFluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是浓度2.5～500μg/mL的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的直径1～10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；标记微球1和微球2的荧光染料两种浓度之差为12.5-50倍；
20000个微球1加入到96孔微孔滤膜板wella中，20000个微球2加入到96孔微孔滤膜板wellb中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球1和微球2各2次，真空抽滤收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分别加入含0.001g Sulfo-NHS和0.001g EDC的200μL MES缓冲液(pH 6.0)，混匀，室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球1、微球2分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球1的wella孔中加入20μg融合蛋白捕获抗体，含微球2的wellb孔中加入20μg同型对照抗体，wella和wellb孔再分别加入PBS缓冲液(pH 7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；
(3)白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测：
方案1：将步骤(1)制备的50μL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1、微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育1小时；微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.25μg融合蛋白报道抗体，混匀、避光室温孵育1小时；微球洗涤并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入2.5μg PE荧光标记的二抗，混匀、避光室温孵育30分钟；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度；
方案2：将步骤(1)制备的50μL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板wellc孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球1与微球2各5000个混合并加入到wellc孔中，加入0.25μg PE荧光标记的融合蛋白报道抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE点图检测微球1和微球2的PE荧光强度；
(4)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：
白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球1的PE荧光强度÷微球2的PE荧光强度，或微球2的PE荧光强度÷微球1的PE荧光强度。
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