CN113046422A - 基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及应用 - Google Patents

基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及应用。其包括：(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合反应，获得第一产物，核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区；(2)将第一产物和环模板序列混合反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，获得扩增产物；环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，环模板杂交区和核酸适配体杂交区至少部分互补；(3)将扩增产物和荧光探针混合杂交，获得荧光标记产物，并利用流式细胞术进行检测。所提供的方法适用于多种细胞外泌体膜蛋白的检测，准确性高、灵敏度高。

Description

基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及应用。
背景技术
相较于组织活检，液体活检对于癌症的早筛、动态监测和指导用药等方面有着重要的意义。循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA/RNA(CtDNA/RNA)和外泌体是三类重要的液体活检目标靶点。其中，外泌体是最新发现的肿瘤液体活检对象，是一类由细胞分泌的直径在50～150nm的纳米级膜囊泡，携带了来自母细胞的DNA、蛋白质和代谢物等信息，存在于几乎所有类型的体液当中。相比血液中含量极少的CTCs，外泌体在每毫升血液中高达109；相较血液中易降解的CtDNA，外泌体的膜结构对其内部携带的分子起到很好的保护作用。因此，外泌体被认为是液体活检中的理想标志物，准确定量和分类肿瘤外泌体对癌症诊断、预后评估具有重要意义。
然而，纳米级的小尺寸使得外泌体的分离纯化和检测都面临着极大的挑战。近年来借助微流控芯片技术实现了外泌体的捕获和检测，但纳米级芯片设计的复杂性及高成本限制了该技术的广泛应用，难以分析大量样本。此外，研究者们基于荧光、比色和电化学等技术也发展了多种多样的检测方法。然而，这些方法主要集中在外泌体RNA或者蛋白质中的单个RNA或蛋白质检测，并没有充分利用外泌体携带的信息，导致样本消耗量和操作步骤的增加。
为更好的实现外泌体在液体活检领域的应用，开发低成本、操作简便的检测新技术十分迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种基于免疫磁珠和滚环扩增实现的外泌体膜蛋白的流式检测方法。本发明所提供的方法通过免疫磁珠快速捕获外泌体，基于核酸适配体特异性识别外泌体膜蛋白，然后借助滚环扩增策略放大检测信号，利用流式细胞仪实现外泌体膜蛋白的高通量检测。此外，借助于外泌体膜蛋白的检测结果，可有效区分肿瘤细胞和正常细胞来源的外泌体，提高疾病的诊断准确性，具有很高的临床应用价值。
为此，本发明的第一方面提供了一种外泌体膜蛋白的检测方法，包括：(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物；其中所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；其中所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
本发明利用核酸适配体上的膜蛋白特异性识别区来特异性识别通过免疫磁珠所捕获的外泌体上的膜蛋白，并利用滚环扩增的方式将信号进行放大，通过流式细胞技术实现外泌体膜蛋白的检测。本发明所提供的方法具有普适性，可运用于多种已筛出特异性核酸适配体的外泌体膜蛋白的检测，或者未来确定了核酸适配体的外泌体膜蛋白的检测。而且可以用于多种癌症细胞系外泌体膜蛋白的检测分析，通过滚环扩增的方式进行信号放大，能够提高相应疾病的诊断准确性，且灵敏度高、操作简单，具有很高的临床应用价值。
本发明的第二方面提供了一种外泌体膜蛋白的流式检测方法，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，洗涤磁珠，以便获得第一产物；
其中，所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，洗涤磁珠，以便获得第二产物；
其中，所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，洗涤磁珠，以便获得扩增产物；
(4)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，洗涤磁珠，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
在不同反应之后进行洗涤，能够降低体系中游离反应物对于反应结果的影响，使得检测更加灵敏。
在本发明的第三方面提供了一种外泌体膜蛋白的高通量流式检测方法，包括：
一种外泌体膜蛋白的高通量流式检测方法，其特征在于，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和至少两种核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物，所述至少两种核酸适配体中的每一个核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和至少两种环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；
其中所述至少两种环模板序列中的每一个环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
本发明的第四方面提供了一种在体外确定外泌体细胞来源的方法，包括：
获得待检测细胞的外泌体；
利用上述所述的方法对外泌体膜蛋白进行流式检测，以便获得流式检测结果；
基于所述流式检测结果，确定不同外泌体表面膜蛋白含量；
基于不同外泌体表面膜蛋白含量的差异，确定所述待检测细胞的类型。
通过本发明所提供的方法，可以发现癌细胞和正常细胞所分泌的外泌体膜蛋白的丰度上的差异，例如利用本发明所提供的方法验证了乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺正常上皮细胞MCF 10A分泌的外泌体膜蛋白的丰度具有显著性差异，具有很好的临床应用价值，为构建高效的乳腺癌液体活检新方法提供实验基础与理论依据。而且所检测的外泌体表面的膜蛋白的种类越多，能够判定外泌体细胞来源的准确性也就会越高。所确定的待检测细胞的类型可以为正常细胞和癌细胞。
附图说明
图1为本发明实施例的基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测原理示意图。
图2为本发明实施例1中通过(a)NTA，(b)透射电子显微镜和(c)免疫印迹实验分别表征外泌体的结果图。
图3为本发明实施例1中基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现MDA-MB-231外泌体膜蛋白CD63的流式检测图。
图4为本发明实施例2中对膜蛋白适配体浓度和封闭剂含量进行优化研究。(a)不同浓度的膜蛋白CD63核酸适配体的流式检测信噪比；(b)不同含量封闭剂鲑鱼精DNA的流式检测信噪比。
图5为本发明实施例3中不同含量的CD63一抗特异性封闭外泌体膜蛋白CD63对流式检测效果的影响图。
图6为本发明实施例4中基于免疫磁珠和滚环扩增实现的外泌体流式检测方法的灵敏度结果图。
图7为本发明实施例5中基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现MDA-MB-231外泌体膜蛋白的高通量流式检测图。
图8为本发明实施例6中基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现的MCF 10A外泌体膜蛋白的高通量流式检测图。
图9为本发明实施例6中基于免疫磁珠和滚环扩增的流式方法高通量检测MDA-MB-231外泌体及MCF 10A外泌体的四种膜蛋白含量的分析结果图。
图10为本发明实施例6中采用免疫印迹法对MDA-MB-231外泌体及MCF 10A外泌体的四种膜蛋白含量的表征图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在用于解释本发明，但所述实施不构成对本发明的限制。对于文中的一些术语进行解释和说明，这些解释和说明仅用于方便本领域技术人员理解，而不应看作是本发明保护范围的限制。
本文中，“核酸适配体”、“环模板序列”均是指一段寡核苷酸序列。核酸适配体可以通过筛选确定，环模板序列可以通过设计确定。这些序列均可以通过人工合成。所用到的核酸适配体或者环模板序列可以是已经成熟的检测外泌体膜蛋白的核酸适配体或者环模板序列，还可以根据外泌体膜蛋白的新的类型而改变。
本文中，所提到的“膜蛋白特异性识别区”指的是能够识别膜蛋白，并与膜蛋白进行特异性结合的寡核苷酸序列。膜蛋白优选为外泌体表面的膜蛋白。
本文中，环模板杂交区是指核酸适配体序列中与环模板序列互补杂交的寡核苷酸片段。
本文中，环模板序列是指参与滚环扩增的寡核苷酸序列，包含与核酸适配体杂交的寡核苷酸片段、与荧光探针杂交的寡核苷酸片段及连接两区域的寡核苷酸片段。
本文中，“核酸适配体杂交区”是指环模板序列中能够与核酸适配体的核酸互补杂交的寡核苷酸片段。
本文中，“第一”和“第二”仅用于描述目的，而不应理解为指示或者暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。用于区分第一连接区和第二连接区分别用于连接不同的片段。第一连接区和第二连接区序列可以相同，也可以不同。
本文中，所提到的％，在不进行特殊说明的情况下为质量百分比。
本发明提供了一种外泌体膜蛋白的流式检测方法，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物，所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；
其中所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
所提供的外泌体膜蛋白的检测方法原理可以参考图1所示。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(1)中所述免疫磁珠包被有下述抗体中的至少一种：CD63、CD9、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、HLA-GTim4。这些抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体，可以用来捕获外泌体。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中所述免疫磁珠包被有CD63抗体。免疫磁珠通过化学键修饰与CD63抗体连接。
在本发明的一些优选实施方式中，所述免疫磁珠为生物素-链霉亲和素偶联的免疫磁珠。例如，利用生物素-链霉亲和素特异性作用，在链霉亲和素修饰的磁珠溶液中加入生物素标记的CD63抗体，于室温下共孵育，孵育结束后磁性分离，多次洗涤磁珠以去除游离的CD63抗体，最终得到偶联有CD63抗体的免疫磁珠。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(1)中所述核酸适配体和所述封闭剂的含量比为：0.1～10μM的核酸适配体和2～40μg的封闭剂。在研究过程中发现，虽然基于免疫磁珠的固液分离能够去除未结合的反应物，但体系中仍存在难以避免的非特异性吸附，产生背景信号，造成干扰。在研究过程中发现，可以通过控制体系内核酸适配体和封闭剂的含量，有效封闭背景信号，而不会对阳性检测信号有很大影响，获得最佳的信噪比。例如，当核酸适配体的浓度在0.1～10μM、封闭剂在2～40μg之间时，可以有效封闭背景信号。根据本发明的优选实施例，所述核酸适配体的浓度为0.1～5μM，所述封闭剂的含量为5～30μg。根据本发明的优选实施例，所述核酸适配体的浓度为0.5～5μM，所述封闭剂的含量为10～30μg。
根据本发明的实施例，鲑鱼精DNA可以作为封闭剂，其能够有效封闭背景信号，而不会对阳性检测信号产生很大影响。
在至少一些实施方式中，步骤(1)中所述第一反应的温度为37摄氏度，反应时间为1～2小时。在至少一些实施方式中，步骤(2)中所述第二反应的温度为37摄氏度，反应时间为1～2小时。
在至少一些实施方式中，步骤(2)中所述滚环扩增的温度为25～37℃，所述滚环扩增的时间为0.5～2小时。
步骤(2)中所述连接酶为T4 DNA连接酶，所述聚合酶为phi29 DNA聚合酶。当核酸适配适体特异性识别外泌体膜蛋白后构型发生变化，与对应的环模板杂交，然后在T4 DNA连接酶和phi29 DNA聚合酶的作用下发生滚环扩增反应，最后与荧光探针杂交产生较强的荧光信号，利用流式细胞仪检测样品的荧光信号，根据荧光信号定量分析样品外泌体膜蛋白的含量。
在至少一些实施方式中，步骤(1)中所述膜蛋白特异性识别区能够特异性识别外泌体表面的CD63蛋白、HER-2蛋白、EpCAM蛋白、MUC1蛋白和/或PSMA蛋白。本发明可以通过设计针对多个外泌体膜蛋白的核酸适配体，以特异性识别并结合外泌体膜蛋白，并利用滚环扩增反应合成DNA，与荧光探针杂交后将核酸转化为多色的荧光信号，一次操作，即可完成多个外泌体膜蛋白的同步检测。例如可以设计不同的膜蛋白特异性识别区同时识别外泌体表面的CD63蛋白、HER-2蛋白、EpCAM蛋白、MUC1蛋白和/或PSMA蛋白等等。具体来说，可以识别这些蛋白中的一种、两种、三种或者四种等等。
在至少一些实施方式中，核酸适配体如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5所示。
在至少一些实施方式中，所述环模板序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO:10所示。根据本发明的实施例，环模板序列的浓度为0.1～10μM。
荧光探针标记的荧光染料分别对应流式细胞仪的不同检测通道。在至少一些实施方式中，所述荧光探针核酸序列如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO:14所示。根据本发明的实施例，荧光探针的浓度为0.1～10μM。
在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种外泌体膜蛋白的流式检测方法，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，洗涤磁珠，以便获得第一产物；
其中，所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，洗涤磁珠，以便获得的第二产物；
其中，所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，洗涤磁珠，以便获得扩增产物；
(4)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，洗涤磁珠，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
根据本发明的实施例，在洗涤时采用磷酸盐缓冲液进行洗涤，磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.4。
应用上述方法可以用于外泌体膜蛋白的高通量流式检测。本发明的至少一些实施方式中提供了一种外泌体膜蛋白的高通量流式检测方法，包括：(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和至少两种核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物，所述至少两种核酸适配体中的每一个核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和至少两种环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；
其中所述至少两种环模板序列中的每一个环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
例如可以同时设计针对HER-2蛋白、EpCAM蛋白、MUC1蛋白或者PSMA蛋白中的至少两种蛋白、至少三种蛋白或者至少四种蛋白的核酸适配体，相应地可以表示为AptHER-2、AptEpCAM、AptMUC1、AptPSMA，来识别HER-2蛋白、EpCAM蛋白、MUC1蛋白及PSMA蛋白。相应地，也设计对应的环模板序列，表示为P-HER-2、P-EpCAM、P-MUC1及P-PSMA，保证P-HER-2、P-EpCAM、P-MUC1及P-PSMA只特异性的和对应的核酸适配体杂交区互补配对，进行杂交扩增。同时采用多种荧光探针标记的荧光染料，例如Pacific Blue、Alexa 488、Alexa 555和Cy5分别对应流式的PB、FITC、PE和APC通道，保证外泌体膜蛋白的高通量检测。
本发明的再一目的是提供一种区分外泌体细胞来源的特异性检测方法。根据本发明的实施例，本发明提供了一种在体外确定外泌体细胞来源的方法，包括：
获得待检测细胞的外泌体；
利用上述任一项所述的方法对外泌体膜蛋白进行流式检测，以便获得流式检测结果；
基于所述流式检测结果，确定不同外泌体表面膜蛋白含量；
基于不同外泌体表面膜蛋白含量的差异，确定所述待检测细胞的类型。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
实施例1提供了一种基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法，包括如下步骤：
1、构建CD-63免疫磁珠
取10～100μL尺寸在1～10μm的链霉亲和素修饰的磁珠(22305-1，Beaver海狸)于离心管中，缓冲液清洗三次后，磁性分离，移去上清液，加入一定量的生物素修饰的CD63抗体(biotin-antiCD63,ab134331，abcam)，于涡旋混合仪上室温旋转混合0.5～2h，缓冲液清洗五次后，即获得CD63免疫磁珠。
2、外泌体的提取与表征
(1)外泌体的提取
将MDA-MB-231细胞接种在含有10％胎牛血清，1％青链霉素(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM培养基中，于5％CO2，37℃条件下培养。当细胞生长至50～75％时，更换培养液(成分组成同上，但去除胎牛血清)，继续培养24～48h后收集细胞上清液。
将收集的细胞上清液经差速离心分离提取外泌体，具体操作如下：4℃，500×g，离心15min后吸取上清液以去除残留的细胞；4℃，15000×g，离心20min后吸取上清液以去除残留的死细胞及细胞碎片；4℃，110000×g，离心70min后弃去上清液保留含有外泌体和干扰蛋白的沉淀；4℃，110000×g，离心70min后弃去上清液保留沉淀即为外泌体，将它重悬于100μL PBS中，-80℃保存备用。
(2)外泌体的表征
1)外泌体的浓度及粒径分布表征(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)
将分离得到的外泌体用PBS稀释40倍，吸取样品500μl，用Nanosight NS300系统进行纳米颗粒跟踪分析。纳米颗粒对激光的散射影像反映其布朗运动，记录捕获60s，重复记录3次。使用NTA软件对视频进行分析，获得纳米颗粒的浓度和大小分布，结果如图2中(a)所示：外泌体粒径在30～150nm以内，浓度为4.75×109个/mL。
2)外泌体的大小和形貌观察(Transmission Electron Microscope,TEM)
将分离得到的外泌体用PBS稀释成浓度约为109个/mL的样品液。取10μL外泌体样品液滴于电镜专用铜网上，室温静置2min，用滤纸从铜网的另一侧吸干液体样本。然后在铜网上滴加10μL 2％的磷钨酸染液，复染2min后吸干多余的磷钨酸染液。接着滴加双蒸水洗涤多余的磷钨酸染液并用滤纸吸干，待其干燥后使用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形貌，结果如图2中(b)所示：外泌体的形貌为具有膜结构的圆形或杯状结构，粒径分布均在50～150nm之间。
3)外泌体的特征蛋白印迹分析(Western blot,WB)
向15μL外泌体溶液中加入15μL RIPA裂解液(含1mM PMSF，R0020，索莱宝)，充分混匀，于冰上裂解1h。裂解完全后，14000g离心15min，提取上清即为外泌体蛋白，使用改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(C503051，生工生物工程有限公司)对外泌体蛋白含量进行定量分析。
吸取30μL外泌体裂解液(约15μg蛋白)于1.5mL EP管，加入10μL 4×蛋白质上样缓冲液，混匀后置于97℃恒温金属浴7min，使蛋白变性。然后在SDS-PAGE凝胶孔中加入40μL上述样品，在S-1：80V 15min(浓缩蛋白)，S-2：120V 80min(分离蛋白)的参数条件下开展电泳实验。结束后，将电泳胶置于润湿的转膜板的黑色面，剪切合适尺寸的PVDF膜用活化液活化5min，然后用转膜液润洗后覆盖在电泳胶上，组装好压膜装置并放入转膜槽，冰浴、300mA条件下转膜60min。然后用Western 1×洗涤液洗涤，7min/次共洗涤3次，然后将PVDF膜放入5％脱脂牛奶中，室温摇床封闭1h。将PVDF膜取出用1×洗涤液洗涤，7min/次共3次，然后将PVDF膜放入1:1000稀释的一抗：anti-CD63(bs-1523R，Bioss)中室温摇床封闭1h。将PVDF膜取出用1×洗涤液洗涤，7min/次共3次，将PVDF膜接着放入1:1000的二抗稀释液(bs-0295G-HRP，Bioss)中室温摇床孵育1h。结束后将PVDF膜取出用1×洗涤液洗涤，7min/次共3次。通过用ECL化学发光试剂盒对PVDF膜显色，在多功能成像分析仪进行曝光，从而得到目标蛋白显影图像，实验结果如图2中(c)所示：显示出明显的CD63蛋白条带，表明得到的囊泡具有外泌体属性。
3、基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法的建立
其中所用到的PBS缓冲液其pH值为7.4，含有0.05～0.5％吐温-20,0.01～0.1％BSA,1×protease inhibitor(蛋白酶抑制剂)。
具体步骤如下：
(1)外泌体膜蛋白的流式检测方法
取10～200μL上述制备的CD63免疫磁珠，用PBS缓冲液充分洗涤磁珠3次；然后将洗涤好的磁珠与10～200μL浓度为1×109个/mL的MDA-MB-231外泌体在涡旋混合仪上室温孵育1h；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去游离的外泌体。
然后将获得的产物重悬于适量PBS缓冲液中，加入2μl 0.5μM的核酸适配体AptCD63(其核酸序列如表1中SEQ ID NO:1所示)，在涡旋混合仪上37℃孵育1h；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去游离的适配体。然后将其重悬于适量PBS缓冲液中，加入0～10μl 0.1～10μM的环模板序列P-CD63(其序列如表1中SEQ ID NO:6所示)，在振荡涡旋混合仪上于37℃条件下孵育1h；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去游离的环模板。
然后将获得的产物重悬于适量PBS缓冲液中，加入10×连接酶缓冲液至终浓度为1×，再加入过量的T4 DNA连接酶混匀，在涡旋混合仪上37℃孵育1h；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去未反应的试剂，将其重悬于适量PBS缓冲液中，加入10×phi 29缓冲液至终浓度为1×，再加入过量的dNTP、phi29 DNA聚合酶混匀，在涡旋混合仪上37℃孵育1小时，进行滚环扩增；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去未反应的酶试剂。
将其重悬于适量杂交缓冲液(其含有20mM Tris-HCl pH 7.5，25mM NaCl，100mMKCl，20mM MgCl2，0.05％吐温-20，0.25mg/mL BSA，1×protease inhibitor(蛋白酶抑制剂))，加入1μl 0.1～1μM荧光探针混匀，在涡旋混合仪上37℃避光孵育0.5～1h；用PBS缓冲液洗涤磁珠三次，除去游离的荧光探针，将其重悬于适量PBS缓冲液中，用流式细胞仪上机测量样本的荧光信号。
同时，分别以CD63免疫磁珠、CD63免疫磁珠捕获MDA-MB-231外泌体后未发生滚环扩增反应、CD63免疫磁珠未捕获外泌体但发生滚环扩增的样本作为阴性对照组。
流式检测结果如图3所示，图3中(a)为CD63免疫磁珠对应的结果，(b)为CD63免疫磁珠捕获MDA-MB-231外泌体后未发生滚环扩增反应对应的结果，(c)为CD63免疫磁珠未捕获外泌体但发生滚环扩增对应的结果，(d)为CD63免疫磁珠捕获MDA-MB-231外泌体，且发生滚环扩增反应对应的结果。
实验结果表明，只有加入了MDA-MB-231外泌体，且滚环扩增反应发生时，才能检测到明显的阳性信号；而阴性对照组均未检测到明显的阳性信号，所获得的实验数据验证了所提供的基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法的可行性。
实施例2
实验过程对于最佳反应条件进行了摸索。实验设计了一系列实验，考察当膜蛋白核酸适配体浓度、封闭剂的含量的条件发生改变时，流式检测方法在不同反应条件下的检测效果，以探究达到最佳检测性能的反应条件。
本实验中我们以外泌体膜蛋白CD63的检测为例，参照实施例1的步骤，调整核酸适配体的反应浓度从0.1～5μM、封闭剂鲑鱼精DNA含量0～20μg产生的荧光信号作为检测信号，以无外泌体时产生的荧光信号作为背景，探究了核酸适配体及封闭剂的最佳反应条件。
检测结果见如图4所示。其中图4中(a)为不同浓度的膜蛋白CD63核酸适配体的流式检测信噪比，图4中(b)为不同含量封闭剂鲑鱼精DNA的流式检测信噪比。由图4可知在本实验体系中，随着适配体浓度的增加，由于游离适配体增多而导致背景信号逐渐增大(纵坐标为流式细胞仪检测到的荧光信号百分比)，而增加封闭剂鲑鱼精DNA的含量，体系的背景信号得到了有效的抑制，当核酸适配体的反应浓度为0.5μM、鲑鱼精DNA含量为10μg时，可以获得最佳信噪比。
实施例3
实施例3对于基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法的可行性进行了验证。
为了证明本实验设计的流式检测方法能够检测外泌体表面不同丰度的膜蛋白，以外泌体膜蛋白CD63的检测为例，研究了不同含量的CD63一抗特异性封闭膜蛋白CD63对流式检测效果的影响。参照实施例1的步骤，与实施例1的不同之处，在于CD63免疫磁珠捕获外泌体之后，用0～0.5μg的CD63一抗封闭溶液进行封闭，然后再进行后续的适配体识别及滚环扩增等检测步骤。
流式检测结果见如图5所示。图5中横坐标为CD63一抗的含量，纵坐标为流式细胞仪检测到的荧光百分比。由图5可知当溶液中加入的CD63一抗含量增加时，外泌体表面的膜蛋白CD63被更多的CD63一抗特异性封闭，流式检测的阳性信号也在逐渐降低。实验结果表明，免疫磁珠可实现对外泌体表面不同丰度膜蛋白的检测。
实施例4灵敏度实验
为评估基于免疫磁珠和滚环扩增建立的外泌体膜蛋白的流式检测方法对于细胞来源的外泌体检测的灵敏度，我们用该方法检测了一系列不同浓度的乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的外泌体。我们将MDA-MB-231分泌的外泌体进行梯度稀释，在最佳反应条件下，对不同浓度的外泌体标本进行流式检测。
图6为基于免疫磁珠和滚环扩增实现的外泌体流式检测方法的灵敏度测试结果。图6中横坐标为外泌体的浓度，纵坐标为流式细胞仪检测到的荧光百分比值。从图中可以看出，随着外泌体浓度的增加，流式的检测信号也越强，流式检测信号与外泌体浓度成正比；根据空白信号加上3倍标准差所对应的信号值计算检出限，得到该方法的最低检测限为1.32×105个/mL。流式检测结果表明，基于免疫磁珠和滚环扩增建立的外泌体膜蛋白的流式检测方法可以实现对乳腺癌细胞来源外泌体的高灵敏定量检测。
实施例5
实施例5考察了基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现的外泌体膜蛋白的高通量检测能力。
为进一步研究基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法高通量检测外泌体膜蛋白的能力，选取了HER-2、EpCAM、MUC1及PSMA四种外泌体膜蛋白标志物，并优化设计了其对应的适配体AptHER-2、AptEpCAM、AptMUC1、AptPSMA和环模板P-HER-2、P-EpCAM、P-MUC1及P-PSMA的碱基序列(如表1所示)，确保环模板只与其对应的适配体特异性杂交，参照实施例1的步骤进行流式检测，与实施例1不同之处，在于与环模板P-HER-2、P-EpCAM、P-MUC1及P-PSMA杂交的荧光探针分别标记了不同的荧光分子Pacific Blue、Alexa 488、Alexa 555和Cy5，分别适用于流式的PB、FITC、PE和APC通道，才能保证外泌体膜蛋白的多色同时检测。
图7为基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现的对MDA-MB-231外泌体膜蛋白的高通量检测的流式图。由图7可知MDA-MB-231外泌体表面不同的膜蛋白含量具有不同程度的差异，表明基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法能够实现外泌体膜蛋白的高通量检测。
表1核酸适配体、环模板、荧光探针的序列
Figure BDA0003005456500000121
Figure BDA0003005456500000131
实施例6
本实施例基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法高通量检测正常乳腺上皮细胞MCF 10A分泌的外泌体膜蛋白。参照实施例1的步骤收集MCF 10A分泌的外泌体，不同之处在于培养MCF 10A细胞需要MCF 10A专用培养基(CM-0525，Procell)。收集的外泌体参照实施例1的步骤进行流式检测，不同之处在于与环模板P-HER-2、P-EpCAM、P-MUC1及P-PSMA杂交的荧光探针分别标记不同的荧光分子Pacific Blue、Alexa 488、Alexa 555和Cy5，分别适用于流式的PB、FITC、PE和APC通道，才能保证外泌体膜蛋白的多色同时检测。
图8为基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现的对MCF 10A外泌体膜蛋白的高通量检测的流式图，由图8流式表征结果可知基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法能够同时检测MCF 10A外泌体表面四种膜蛋白，且四种膜蛋白含量具有不同程度的差异。
图9为基于免疫磁珠和滚环扩增的流式方法高通量检测MDA-MB-231细胞及MCF10A细胞分泌的外泌体膜蛋白的分析结果图，从图中可以看出膜蛋白HER-2、EpCAM、MUC1在MDA-MB-231外泌体表面的含量均高于MCF 10A外泌体，然而膜蛋白PSMA在MDA-MB-231外泌体表面的含量却低于MCF 10A外泌体，但四种标志性膜蛋白在乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞系MCF 10A分泌的外泌体表面的表达量均存在着显著性差异。实验结果表明，基于免疫磁珠和滚环扩增的流式检测方法实现了外泌体膜蛋白的同时检测，此外根据外泌体膜蛋白含量的差异，能够区分乳腺正常上皮细胞和乳腺癌细胞来源的外泌体。
本实施例进一步采用免疫印迹法对MDA-MB-231外泌体及MCF 10A外泌体的四种膜蛋白含量进行了半定量探究。参照实施例1的步骤进行免疫印迹检测，与实施例1不同之处在于孵育的一抗分别为：HER-2(18299-1-AP，Proteintech)、EpCAM(21050-1-AP，Proteintech)、MUC1(19976-1-AP，Proteintech)、PSMA(13163-1-AP，Proteintech)。检测结果如图10所示，除MDA-MB-231外泌体膜蛋白PSMA、MCF 10A外泌体膜蛋白HER-2、EpCAM含量较低外，四种膜蛋白在两个细胞系的丰度差异与流式检测结果基本是一致，表明本发明提出的基于免疫磁珠和滚环扩增建立的外泌体膜蛋白的流式检测方法的可靠性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 基于免疫磁珠和滚环扩增的外泌体膜蛋白的流式检测方法及应用
<130> BI3210405
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AptCD63
<400> 1
caccccacct cgctcccgtg acactaatgc tatttttttg ccgaatccta gactcttatg 60
ctgaatgat 69
<210> 2
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AptHER-2
<400> 2
gggccgtcga acacgagcat ggtgcgtgga cctaggatga cctgagtact gtcctttttt 60
tgccgatcgt ataactctta tgctgaatga t 91
<210> 3
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AptEpCAM
<400> 3
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgtt ttttttttaa 60
atcctagacg gttgtagtca aagta 85
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AptMUC1
<400> 4
ttgcagttga tcctttggat accctggttt ttttgccgtt tcctagactc ttaccgtgaa 60
tgat 64
<210> 5
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AptPSMA
<400> 5
gcgttttcgc ttttgcgttt tgggtcatct gcttacgata gcaatgcttt tttcccccat 60
tacctagact cttattacat tacat 85
<210> 6
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-CD63
<400> 6
agtctaggat tcggctttta actatacaac atactacctc attttaacta tacaacatac 60
tacctcattt tatcattcag cataag 86
<210> 7
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-HER-2
<400> 7
agttatacga tcggctttta ttgcgaacta ctactctctc tttttattgc gaactactac 60
tctctctttt tatcattcag cataag 86
<210> 8
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-EpCAM
<400> 8
cgtctaggat ttaaatttta actatacaac atactacctc attttaacta tacaacatac 60
tacctcattt ttactttgac tacaac 86
<210> 9
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-MUC1
<400> 9
agtctaggaa acggcttttc tcaattctgc tactgtacta cttttctcaa ttctgctact 60
gtactacttt tatcattcac ggtaag 86
<210> 10
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-PSMA
<400> 10
agtctaggta atgggttttt gcgtctattt tctggagcca taatttgcgt ctattttctg 60
gagccatttt tatgtaatgt aataag 86
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pacific Blue
<400> 11
attgcgaact actactctct ct 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alexa488
<400> 12
aactatacaa catactacct ca 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alexa555
<400> 13
ctcaattctg ctactgtact ac 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cy5
<400> 14
tgcgtctatt ttctggagcc at 22

Claims (10)

1.一种外泌体膜蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物；
其中，所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；
其中，所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述免疫磁珠包被有下述抗体中的至少一种：
CD63、CD9、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、HLA-GTim4；
优选地，步骤(1)中所述免疫磁珠包被有CD63抗体；
优选地，所述免疫磁珠为生物素-链霉亲和素偶联的免疫磁珠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述核酸适配体和所述封闭剂的含量比为：0.1～10μM的核酸适配体和2～40μg的封闭剂；
优选地，所述封闭剂为鲑鱼精DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一反应的温度为37摄氏度，反应时间为1～2小时；
任选地，步骤(2)中第二反应的温度为37摄氏度，反应时间为1～2小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述滚环扩增的温度为25～37℃，所述滚环扩增的时间为0.5～2小时；
任选地，步骤(2)中所述连接酶为T4DNA连接酶，所述聚合酶为phi29DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述膜蛋白特异性识别区能够特异性识别外泌体表面的CD63蛋白、HER-2蛋白、EpCAM蛋白、MUC1蛋白和/或PSMA蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸适配体如SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:5所示；
所述环模板序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO:10所示；
所述荧光探针如SEQ ID NO：11～SEQ ID NO:14所示。
8.一种外泌体膜蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，洗涤磁珠，以便获得第一产物；
其中，所述核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和环模板序列混合，进行第二反应，洗涤磁珠，以便获得第二产物；
其中，所述环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，洗涤磁珠，以便获得扩增产物；
(4)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，洗涤磁珠，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
9.一种外泌体膜蛋白的高通量流式检测方法，其特征在于，包括：
(1)将免疫磁珠捕获的外泌体和至少两种核酸适配体、封闭剂混合，进行第一反应，以便获得第一产物，所述至少两种核酸适配体中的每一个核酸适配体包括膜蛋白特异性识别区、第一连接区和环模板杂交区，所述膜蛋白特异性识别区和所述环模板杂交区通过所述第一连接区相连；
(2)将所述第一产物和至少两种环模板序列混合，进行第二反应，获得的第二产物和连接酶、聚合酶混合，进行滚环扩增，以便获得扩增产物；
其中所述至少两种环模板序列中的每一个环模板序列包括核酸适配体杂交区、第二连接区和荧光探针杂交区，所述核酸适配体杂交区和所述荧光探针杂交区通过所述第二连接区相连，所述环模板杂交区和所述核酸适配体杂交区至少部分互补；
(3)将所述扩增产物和荧光探针混合杂交，以便获得荧光标记产物，利用流式细胞术对所获得的荧光标记产物进行检测。
10.一种在体外确定外泌体细胞来源的方法，其特征在于，包括：
获得待检测细胞的外泌体；
利用权利要求1～9中任一项所述的方法对外泌体膜蛋白进行流式检测，以便获得流式检测结果；
基于所述流式检测结果，确定不同外泌体表面膜蛋白含量；
基于不同外泌体表面膜蛋白含量的差异，确定所述待检测细胞的类型。
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