CN115011603A - 手足口病主要病原ev71与ca16的dna适配体及其应用 - Google Patents

手足口病主要病原ev71与ca16的dna适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了手足口病主要病原EV71与CA16的DNA适配体及其应用。所述DNA适配体包括E21和C36中的至少一种，其中，E21的序列如SEQ ID No.1所示，C36的序列如SEQID No.2所示。同时将E21和C36成环制备了Circ‑E21和Circ‑C36。本发明的单链和环核酸适配体能够高特异性识别和高亲和性结合手足口病主要病原EV71与CA16，可应用于检测病原EV71与CA16的相关方法中，在手足口病的研究方面具有重要意义。

Description

手足口病主要病原EV71与CA16的DNA适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及手足口病主要病原EV71与CA16的DNA适配体及其应用。
背景技术
手足口病是一种急性且具有高度传染性的病毒性皮疹，通常发生在5岁以下有症状感染的儿童身上。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中主要致病原为人肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)，两者都归属于A型肠道病毒。手足口病的临床症状通常很轻微，包括发烧、食欲不振、皮疹和水泡，这些不需要特殊治疗。然而，有一些罕见的神经或心脏并发症，如脑膜炎和急性迟缓性瘫痪，可能是致命的。在过去的20年里，亚洲和太平洋地区人口的手足口病反复爆发已经导致严重的疾病、使人衰弱的并发症甚至死亡。因此，提出更加精准、快速、廉价、简便的病毒检测方法对于手足口病的临床诊断非常重要。
适配体与靶分子的结合和抗原与抗体作用相似，适配体具有明显优于抗体的许多特性，如制备相对简单、稳定性更强等。经过近十几年的发展，适配体技术开始广泛应用于分子识别、科学实验、疾病诊断、疾病治疗和药物研究。因此，如果有能高特异性识别和高亲和性结合手足口病病原的适配体，将在手足口病病原EV71与CA16的研究方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了手足口病主要病原EV71与CA16的DNA适配体及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种手足口病病原的的DNA适配体，所述DNA适配体包括E21或C36中的至少一种，其中，所述E21的序列如SEQ ID No.1所示，所述C36的序列如SEQ ID No.2所示。
优选地，还包括所述E21成环制备的Circ-E21。
优选地，还包括所述C36成环制备的Circ-C36。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种上述的DNA适配体在手足口病病原的检测、分析或研究领域中的应用，但不用于疾病诊断或治疗。
在一个优选的实施例中，为上述的DNA适配体在制备手足口病病原的检测试剂盒中的应用。
优选地，所述手足口病病原包括EV71或CA16中的至少一种。
优选地，采用滚环扩增技术和纳米金比色检测法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种手足口病病原的检测试剂盒，包括上述的DNA适配体。
优选地，所述手足口病病原包括EV71或CA16中的至少一种。
优选地，采用滚环扩增技术和纳米金比色检测法。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID No.1：
5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATACAGTGTGCACCAGGTCAGATTGTCTGGAGGACCAGTACCGTGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3’
SEQ ID No.2：
5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATATCAGTAGCGGCTCTCGGACAGACCTATATCCCTATCCCACTGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3’
SEQ ID No.3：
5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATA-3’
SEQ ID No.4：
5’-GGCAACTTCTCACTTACTGTCA-3’
SEQ ID No.5：
5’-PolyA-GGCAACTTCTCACTTACTGTCA-3’
SEQ ID No.6：
5’-CAAGCACGCAGTATCGGCAACTTCTCACTT-3’
SEQ ID No.7：
5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3’
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本发明的有益效果是：
本发明的DNA适配体的单链形式和环核酸适配体形式均能够高特异性识别和高亲和性结合手足口病主要病原EV71与CA16，可应用于检测手足口病病原EV71与CA16的相关方法中，在手足口病病原EV71与CA16的的检测方面具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的SELEX筛选DNA单链适配体技术方法流程示意图。
图2为本发明实施例2中二条DNA适配体E21(左)和C36(右)的二级结构示意图。
图3为本发明实施例3中的核酸适配体E21的Kd值计算结果图。
图4为本发明实施例3中的核酸适配体C36的Kd值计算结果图。
图5为本发明实施例3中的核酸适配体E21的特异性检测结果图。
图6为本发明实施例3中的核酸适配体C36的特异性检测结果图。
图7为本发明实施例4中加入Circ-C36与不同浓度CA16的RCA产物纳米金比色结果图，其中：1为空白对照(体系中没有加入病毒靶标，以水代替)，2－6分别为加入不同浓度(1pmol/L、100fmol/L、10fmol/L、1fmol/L、100amol/L)CA16靶标。
图8为本发明实施例4中加入Circ-E21与不同浓度EV71的RCA产物纳米金比色结果图，其中：1为空白对照(体系中没有加入病毒靶标，以水代替)，2－6分别为加入不同浓度(1pmol/L、100fmol/L、10fmol/L、1fmol/L、100amol/L)EV71靶标。
图9为本发明实施例4中加入Circ-E21与不同浓度CA16的RCA产物纳米金比色结果图，其中：1为空白对照(体系中没有加入病毒靶标，以水代替)，2－6分别为加入不同浓度(1pmol/L、100fmol/L、10fmol/L、1fmol/L、100amol/L)CA16靶标。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1 基于SELEX筛选H1N1流感病毒DNA适配体
本实施例的SELEX流程见图1，以羧基磁珠为固定相，采用固定灭活手足口病病原EV71与CA16，捕获洗脱从文库中筛选DNA适配体。
1.1羧基基磁珠结合病毒靶标
根据羧基磁珠使用说明书，将羧基磁珠涡旋振荡混匀之后，移取100μL加入到1.5mLEP管中，弃上清。加入200μL偶联缓冲液(MES)洗涤磁珠3次。向磁珠中加入120μLMES溶液，40μLEDC溶液和40μL sulfo-NHS溶液，涡旋混匀。室温下涡旋孵育15min后吸弃上清。用200μLMES溶液清洗磁珠，弃上清。加入100μLMES溶液与100μL病毒抗原，轻柔混匀之后，室温下孵育2h。加入500μL封闭缓冲液(TBS)封闭磁珠，弃上清。再加入500μL TBS，室温孵育40min后弃上清。加入500μL TBS冲洗磁珠3次，弃上清。4℃保存备用。
1.2从核酸文库筛选DNA适配体
将合成的初始文库干粉(序列信息如SEQ ID No.7所示，即为：5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATA-N40-TGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3’)以8000rpm/min的速度室温离心2min，加入无核酶水(DEPC水)溶解至浓度为100μM，移取5μL至装有195μL BindingBuffer的1.5mL EP管中，将200μL反应体系95℃变性5min，4℃冷却15min，再室温放置10min。在文库与磁珠孵育之前，先将文库加入到BSA包被过的96孔板中结合1h，即阴性筛选。最后将阴性筛选过后的文库加入到磁珠-病毒靶标的体系中，室温孵育2h。
文库靶标孵育结束后，瞬时离心，置于磁力架磁分离1min，吸取上清保留备用。向体系中加入200μL的Wash Buffer清洗，轻柔涡旋1min，然后置于磁力架磁分离1min，吸取上清保留备用。反复清洗4～5次，最后加入200μL的Elution Buffer洗脱，置于金属浴中80℃热洗脱15min，之后磁力架磁分离1min，收集上清作为PCR回收文库。
1.3富集和回收筛选文库
将洗脱后的ssDNA进行PCR扩增。上游引物为5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATA-3’(SEQID No.3)，下游引物为：5’-PolyA-GGCAACTTCTCACTTACTGTCA-3’(SEQ ID No.5)。扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，挑取凝胶放入染色液中，浸泡染色5min。挑取凝胶置于凝胶成像仪中曝光拍照保存。之后将凝胶放置在紫外切胶台上，切取目的条带放入1.5mL无菌EP管中，加入1mL超纯水清洗3次。用枪头将凝胶再EP管中旋转碾碎，加入180μL超纯水，置于金属浴中95℃热熔20min。将凝胶混合物转移至离心空柱管中，8000rpm/min室温离心5min，回收上清即为ssDNA次级文库。
其中，PCR反应体系为(体系总体积为50μL)：ddH2O 36.9μL，10×r-Taq Buffer 5μL，5μM上游引物1.3μL，5μM下游引物1.3μL，dNTPs 4μL，回收文库为模板1μL，r-Taq 0.5μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min 10s，循环30次；72℃10min；4℃保存。
实施例2 核酸适配体的克隆、测序、候选适配体二级结构的预测以及候选适配体成环制备环适配体
2.1 PCR产物的回收纯化
利用上游引物为5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATA-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为：5’-GGCAACTTCTCACTTACTGTCA-3’(SEQ ID No.4)，对第12轮筛选得到的次级文库进行扩增，随后进行8％聚丙烯酰胺凝胶分离，切胶回收目的条带，利用DNA回收试剂盒进行目的产物回收。
2.2连接及连接产物的转化
将4μL适配体PCR回收纯化产物与1μL T5质粒载体轻轻混合，瞬时离心，37℃反应5min，反应结束后迅速将离心管置于冰上备用。将5μL连接产物加入到50μL刚刚解冻的Trans1-T1感受态细胞中，混匀后冰上放置30min。将感受态细胞于42℃水浴热激30s，随后立刻冰浴2min。将500μL液态培养基加入上述Ep管中，轻柔混匀，220rpm/min 37℃摇匀1h。室温2000rpm/min离心1min，使得菌体沉降于底部，小心吸弃约450μL上清，重新混匀菌体。在超净工作台上，将剩余菌液混合物加在含有0.01％Amp的固体培养基上，使用灼烧灭菌过的玻璃涂布棒将其均匀涂布在固体培养基上，37℃培养箱倒置培养14～16小时形成单菌落。
2.3单克隆筛选、测序、成环和二级结构预测
向液体培养液中加入10％氨苄青霉素(每100mL加入100μL氨苄，使其终浓度为0.01％)，混匀后分装于12mL的摇菌管内，每管3mL。用枪头小心挑取单菌落，反复吹打将菌落浇入到含有LB培养液的摇菌管中。摇床设置200rpm 37℃培养过夜。取1μL菌液用于PCR鉴定阳性克隆(克隆鉴定引物为M13F和M13R)；将经过PCR鉴定的阳性菌液各取1mL送到上海生工总部进行DNA测序。测序引物为M13、T载体、氨苄抗性、单向向测通。经初步筛选获得两个不同候选适配体序列，命名为：E21(SEQ ID No.1：5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATACAGTGTGCACCAGGTCAGATTGTCTGGAGGACCAGTACCG TGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3’)和C36(SEQ ID No.2：5’-GATACTGCGTGCTTGTTCCATA TCAGTAGCGGCTCTCGGACAGACCTATATCCCTATCCCACTGACAGTAAGTGAGAAGTTGCC-3)。
2.4E21和C36二级结构预测
使用DNAfold网站进行二级结构预测。结果表明，E21，C36二级结构为茎环结构，具有较高的稳定性，二级结构见图2。
2.5E21、C36成环制备Circ-E21、Circ-C36
分别取1μL 20μM E21(SEQ ID No.1)、C36(SEQ ID No.2)成环核酸序列、1μL 20μM成环互补序列(SEQ ID No.6：5’-CAAGCACGCAGTATCGGCAACTTCTCACTT-3’)和14μL无核酸酶水加入EP管中。混均置于PCR仪中95℃变性10min，25℃冷却20min，之后再加入2μL T4连接酶，置于PCR仪内25℃酶连2h，然后在70℃反应12min完全灭活T4连接酶。反应结束后，在成环体系中加入1.6μL Exo I酶和0.8μL Exo III酶，置于PCR仪内37℃酶切120min，然后在80℃反应22min完全灭活Exo I酶和Exo III酶，将产物置于4℃保存。
实施例3 DNA适配体与病原EV71与CA16检测亲和力和特异性
3.1 ELISA法检测E21、C36的K d值
利用蛋白包被液将靶标浓度稀释为100ng/mL，吸取100μL加入到96孔板中，4℃孵育过夜。吸弃蛋白包被液，加入200μL PBS缓冲液(含0.1％的Tween-20)洗涤孔板3次后，加入3％BSA 300μL封闭60min，室温混匀孵育。将生物素修饰的候选适配体用PBS缓冲液稀释到不同的浓度，置于金属浴中95℃变性10min，冰浴10min后室温放置10min。封闭结束后，加入200μL PBS缓冲液(含0.1％的Tween-20)洗涤孔板3次后，吸取上述处理好的适配体100μL到孔板中，室温混匀孵育60min。孵育结束，吸取200μL PBS缓冲液洗涤孔板3次后，吸取200μL用PBS缓冲液稀释2000倍的HRP加入到96孔板中，室温混匀孵育60min。孵育结束后按上述洗涤步骤清洗三次，吸取加入100μL TMB显色液，室温混匀孵育10min后，再向孔板中加入100μL 1M HCl终止反应，最后酶标仪设定450nm吸收波长处测定吸光度。横轴为靶标浓度，纵轴为(F 0-F)/F 0，统计亲和性数据进行计算，用Origin软件中的非线性拟合曲线得出Kd值。
根据公式(1)对每一个适配体的Kd值进行计算。
Figure BDA0003715979690000081
式中y表示饱和度，即适配体结合的靶标蛋白占总靶标蛋白的质量分数；x表示加入适配体的浓度，nmol/L；Bmax为适配体与靶标蛋白的最大结合数目；Kd表示二者的解离常数，nmol/L。
如图3、图4、所示是适配体不同浓度梯度0、20、80、160、320nM时颜色的变化，随着适配体浓度的增大，溶液颜色由浅黄色变为深黄色，说明结合力不断增强。当吸光度不再增加达到饱和，说明此时适配体与靶标结合到达饱和状态。使用Origin进行非线性拟合得到Kd。Kd值结果依次为：E21：Kd＝9.638±1.250nmol/L；C36：Kd＝14.522±3.831nmol/L。
3.2纳米金比色法检测DNA适配体E241和C36与病原EV71与CA16检测灵敏度和特异性
3.2.1纳米金粒子制备
使用现配的王水溶液浸泡250mL圆底烧瓶4小时，再用超纯水润洗三次后，置于烘箱中烘干备用。实验制备纳米金的方法为柠檬酸钠还原法，加入49mL H2O和1mL 1％氯金酸溶液到圆底烧瓶中，小心放入磁力搅拌子，铁架台固定圆底烧瓶置于油浴锅中。打开电源，控制油浴温度为140℃，边加热边搅拌，将圆底烧瓶中溶液煮沸。溶液沸腾后快速加入3.5mL1％柠檬酸三钠溶液，观察到溶液从无色、深蓝色、红褐色到酒红色的转变，之后持续加热10min。之后关闭电源，取下圆底烧瓶避光放置冷却至室温，转移至棕色瓶中4℃保存。之后关闭电源，取下圆底烧瓶避光放置冷却至室温，转移至棕色瓶中4℃保存。
3.2.2 E21和C36与病原EV71与CA16特异性检测
首先在96孔板中加入100μL同批次纳米金溶液，再分别向各孔中加入40μL优化好浓度的各个候选适配体，置于摇床上室温孵育30min，之后加入40μL稀释成2ng/μL的靶标，包括EV71、CA16、H1N1和BSA溶液，并且以超纯水作为空白对照，摇床室温孵育30min后，再加入20μL的320nmol/L的NaCl溶液，总体积为200μL，室温孵育5min。观察颜色变化后通过多功能酶标仪波长在650nm和520nm处的吸光度，计算并比较各孔的A650/A520数值，各孔之间的数值差异及与空白对照的差异表明了各候选适配体与各靶标之间的结合力。
图5为E21加入不同靶标纳米金颜色的变化，可以看出加入EV71与CA16的纳米金颜色为蓝色，加入其他靶标或是空白对照则为酒红色或淡紫色。表为靶标与其他阴性对照的ΔA650/A520对比，绘制成柱形图如图，使用spss对其进行独立样本t检验，实验组与对照组ΔA650/A520具有明显差异，故而适配体E21能与EV71与CA16都具有结合力。图6为适配体C36加入不同靶标纳米金颜色的变化，可以看出加入CA16的纳米金颜色为蓝色，加入其他靶标或是空白对照则为酒红色或淡紫色。表为靶标与其他阴性对照的ΔA650/A520对比，绘制成柱形图如图，使用spss对其进行独立样本t检验，实验组与对照组ΔA650/A520具有明显差异，故而适配体C36与其他干扰靶标不结合，能与CA16特异性结合。
实施例4 单链环状适配体Circ-E21和Circ-C36双适体-纳米金比色法检测病原EV71与CA16的应用
建立双适体-RCA法，链霉亲和素磁珠使用前震荡混匀20秒，移液枪吸取5μL链霉亲和素磁珠加入到无菌的1.5mL EP管中，磁力架磁分离后吸弃保护液，之后加入100μL结合缓冲液置于混匀仪上室温孵育15min。磁力架磁分离30秒，吸弃上清，加入100μL结合缓冲液清洗2次。吸弃缓冲液后，加入5μL 10μM生物素修饰的的单链适配体，充分震荡重悬磁珠，置于混匀仪上室温孵育20min。磁力架磁分离30秒，吸弃上清，加入100μL结合缓冲液清洗3次，吸弃缓冲液后，加入不同浓度病毒靶标溶液(1pmol/L、100fmol/L、10fmol/L、1fmol/L、100amol/L；mol/L＝1012pmol/L＝1015fmol/L＝1018amol/L)，置于混匀仪上室温孵育45min。磁力架磁分离30秒，吸弃上清，加入100μL结合缓冲液清洗3次。吸弃缓冲液后，加入稀释好的环状适配体，置于混匀仪上室温孵育45min。磁力架磁分离30秒，吸弃上清，加入100μL结合缓冲液清洗3次。吸弃缓冲液后，向体系中加入20μL DEPC水。将体系作为模板进行滚环扩增。
通过纳米金对RCA产物进行检测，从而间接检测体系中病毒是否存在。实验原理为：RCA体系中存在的阳离子可以使纳米金聚集变色，而体系中的扩增引物可以保护纳米金，所以当RCA体系中没有环状模板时，经RCA后纳米金检测纳米金溶液保持酒红色；当RCA体系中存在环状模板时，经RCA后纳米金检测，因此时扩增引物被消耗导致不足以保护纳米金，导致纳米金溶液变色。
图7为双适体－RCA体系中加入不同浓度CA16与环适配体Circ-C36结合反应后，经纳米金比色法检测RCA产物的纳米金颜色变化图。从图中可以看出，空白对照不变色，2－6五管PCR管中的纳米金随着加入CA16靶标浓度的增加，颜色变化程度逐渐减弱，2－5号管与空白对照颜色差异明显，而6号管与空白对照无明显区别。从而判断环适体Circ-C36利用双适体－纳米金检测体系检测病毒CA16的最低检测限为1fmol/L。
图8为双适体－RCA体系中加入不同浓度EV71与环适配体Circ-E21结合反应后，经纳米金比色法检测RCA产物的纳米金颜色变化图。从图中可以看出，空白对照不变色，2－6五管PCR管中的纳米金随着加入EV71靶标浓度的增加，颜色变化程度逐渐减弱，2－4号管与空白对照颜色差异明显，而5、6号管与空白对照无明显区别。从而判断环适体Circ-E21利用双适体－纳米金检测体系检测病毒EV71的最低检测限为10fmol/L。
图9为双适体－RCA体系中加入不同浓度CA16与环适配体Circ-E21结合反应后，经纳米金比色法检测RCA产物的纳米金颜色变化图。从图中可以看出，空白对照不变色，2－6五管PCR管中的纳米金随着加入CA16靶标浓度的增加，颜色变化程度逐渐减弱，2－5号管与空白对照颜色差异明显，而5、6号管与空白对照无明显区别。从而判断环适体Circ-E21利用双适体－纳米金检测体系检测病毒CA16的最低检测限为10fmol/L。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 手足口病主要病原EV71与CA16的DNA适配体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatactgcgt gcttgttcca tacagtgtgc accaggtcag attgtctgga ggaccagtac 60
cgtgacagta agtgagaagt tgcc 84
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatactgcgt gcttgttcca tatcagtagc ggctctcgga cagacctata tccctatccc 60
actgacagta agtgagaagt tgcc 84
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatactgcgt gcttgttcca ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcaacttct cacttactgt ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 核苷酸之前带有PolyA
<400> 5
ggcaacttct cacttactgt ca 22
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcacgca gtatcggcaa cttctcactt 30
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatactgcgt gcttgttcca tannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nntgacagta agtgagaagt tgcc 84

Claims (10)

1.一种手足口病病原的的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体包括E21或C36中的至少一种，其中，所述E21的序列如SEQ ID No.1所示，所述C36的序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的DNA适配体，其特征在于：还包括所述E21成环制备的Circ-E21。
3.根据权利要求1所述的DNA适配体，其特征在于：还包括所述C36成环制备的Circ-C36。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的DNA适配体在手足口病病原的检测、分析或研究领域中的应用，但不用于疾病诊断或治疗。
5.一种权利要求1至3中任一项所述的DNA适配体在制备手足口病病原的检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述手足口病病原包括EV71或CA16中的至少一种。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：采用滚环扩增技术。
8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：采用纳米金比色检测法。
9.一种手足口病病原的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至3中任一项所述的DNA适配体。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：所述手足口病病原包括EV71或CA16中的至少一种。
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