CN112980850A - 一种甲型h1n1流感病毒核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01或02所示。本发明能够高特异性识别和高亲和性结合甲型H1N1流感病毒，可应用于检测甲型H1N1流感病毒的相关方法中，在甲型H1N1流感病毒的检测方面具有重要意义。

Description

一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体及其应用。
背景技术
甲型H1N1流感病毒是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。甲型H1N1流感病毒的宿主为鸟类和犬科动物等哺乳动物。甲型H1N1流感病毒引起的一些严重疾病大多发生在家禽和宠物身上，经过鸟类和犬类为主的哺乳动物的传播和变异可能导致其在人类中的大规模传播。据报道，甲型H1N1流感病毒是一种严重的呼吸道感染病毒，多次引起世界性大流行，每年流感季传染极强，造成损失严重。因此快速准确地诊断甲型流感对于预防流感的传播非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体。
本发明的另一目的在于提供上述甲型H1N1流感病毒核酸适配体应用。
本发明的再一目的在于提供一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒。
本发明的技术方案之一如下：
一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其为单链状或为环状。
上述甲型H1N1流感病毒核酸适配体在制备甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒中的应用。
本发明的技术方案之一如下：采用纳米金比色检测法。
一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括上述甲型H1N1流感病毒核酸适配体。
本发明的技术方案之二如下：
一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其为单链状或为环状。
上述甲型H1N1流感病毒核酸适配体在制备甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒中的应用。
本发明的技术方案之一如下：采用纳米金比色检测法。
一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括上述甲型H1N1流感病毒核酸适配体。
本发明的有益效果是：本发明能够高特异性识别和高亲和性结合甲型H1N1流感病毒，可应用于检测甲型H1N1流感病毒的相关方法中，在甲型H1N1流感病毒的检测方面具有重要意义。
附图说明
图1本发明的SELEX筛选DNA单链适配体技术方法流程示意图。
图2本发明实施例2中二条DNA适配体Apt-2(A)和Apt-6(B)的二级结构示意图。
图3本发明实施例3中的核酸适配体Apt-2的Kd值计算结果图。
图4本发明实施例3中的核酸适配体Apt-6的Kd值计算结果图。
图5本发明实施例3中的核酸适配体Circ-Apt-2的Kd值计算结果图。
图6本发明实施例3中的核酸适配体Circ-Apt-6的Kd值计算结果图。
图7本发明实施例3中Circ-Apt-2的纳米金比色法灵敏度检测结果图。
图8本发明实施例3中Circ-Apt-6的纳米金比色法灵敏度检测结果图。
图9本发明实施例3中Circ-Apt-2的纳米金比色法特异性检测结果图。
图10本发明实施例3中Circ-Apt-6的纳米金比色法特异性检测结果图。
图11本发明实施例4中Circ-Apt-2和Circ-Apt-6的纳米金比色法检测H1N1流感病毒应用结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1基于SELEX筛选H1N1流感病毒DNA适配体
本实施例的SELEX流程如图1所示，以环氧基磁珠为固定相，采用固定灭活H1N1流感病毒靶标，捕获洗脱从文库中筛选DNA适配体。本实施例具体步骤如下：
(1)环氧基磁珠结合靶标：参照环氧基磁珠使用说明书，摇匀环氧磁珠，取500μL(10mg)磁珠于1.5mLEp管中，弃去上清。使用500μL偶联缓冲液冲洗磁珠3次。再向Ep管加入200μL偶联缓冲液和500μL 1000ng/μL H1N1。将Ep管置于28℃ 230rpm摇床孵育过夜。取出Ep管，加入400μL 3％BSA溶液，28℃230rpm摇床孵育4h。弃上清，分别用1mL偶联缓冲液和1mL封闭缓冲液交替冲洗磁珠3次。用1mL PBS缓冲液冲洗磁珠，弃上清，保存于500μLPBS缓冲液中，4℃保存。
(2)从核酸文库筛选DNA适配体：取从TaKaRa公司合成的初级文库1ib干粉1OD(序列信息：5’-gatactgcgtgcttgttccata(SEQ ID NO.03)-N40-tgacagtaagtgagaagttgcc(SEQID NO.04)-3’)，放入离心机中12000rpm/min，离心10min，然后在通风橱中加入260μL DPBS(0.9mM CaCl2，2.7mM KCl，0.5mM MgCl2.6H2O，0.137M NaCl，1.1mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4)溶解。溶解后用涡旋仪震荡约1min，然后再离心12000rpm/min，10min，配制成5μM的文库溶液。
取50μL文库和150μL binding buffer混合均匀，95℃金属浴10min，4℃15min，室温放置30min。(第一轮用5μL初级文库+195μL binding buffer)取偶联有病毒的磁珠50μL，弃上清，用200μL washing buffer清洗磁珠3次。向磁珠中加入文库与binding buffer混合物，28℃230rpm摇床孵育1小时。用washing buffer冲洗冲洗数次，加入200μL Elutionbuffer，90℃热洗脱15min，离心磁液分离，收集上清，并以此作为PCR回收文库。
(3)文库富集监测及靶标适配体的筛选：将1μL模板与qPCR混合物混合，并执行qPCR。对每一轮的富集库(洗脱缓冲液)和洗涤液进行监测。将洗脱后的ssDNA进行PCR扩增。上游引物为5’-gatactgcgtgcttgttccata-3’(SEQ ID NO.05)，下游引物为：5’-biotin-ggcaacttctcacttactgtca-3’(SEQ ID NO.06)。后扩增：72℃ 5min。使用200μL超纯水清洗链霉亲和素磁珠3次，将回收产物加入磁珠中，28℃230rpm摇床孵育2h，将双链适配体固定在链霉亲和素磁珠上。离心，去上清，200μL washing buffer清洗磁珠3次，洗去未固定的适配体。向磁珠中加入50μL 0.3M NaOH，28℃230rpm摇床孵育20min。在碱性条件下(pH12.6)DNA的氢键断裂，此时EP管中的双链DNA解旋形成单链，生物素修饰的单链固定在磁珠上，无任何修饰的ssDNA悬于上清中。磁力架静置2min磁液分离，去除磁珠，将上清溶液(ssDNA次级文库)转移至一个新的EP管中，加入约5μL 3M HCl调节pH为8得到H1N1病毒适配体ssDNA，即为下一轮筛选文库。
其中，qPCR反应体系为(体系总体积为20μL)：ddH2O 14.7μL，10×r-Taq Buffer 2μL，5μM上游引物0.5μL，5μM下游引物0.5μL，dNTPs 1μL，回收文库为模板1μL，r-Taq 0.3μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃10min；4℃保存。
其中，PCR反应体系为(体系总体积为50μL)：ddH2O 36.9μL，10×r-Taq Buffer 5μL，5μM上游引物1.3μL，5μM下游引物1.3μL，dNTPs 4μL，回收文库为模板1μL，r-Taq 0.5μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min10s，循环30次；72℃ 10min；4℃保存。
实施例2核酸适配体的克隆、测序、候选适配体二级结构的预测以及候选适配体成环制备环适配体
(1)PCR产物的回收：利用上游引物5’-gatactgcgtgcttgttccata-3’(SEQ IDNO.05)和下游引物5’-ggcaacttctcacttactgtca-3’(SEQ ID NO.06)对实施例1中第12轮筛选得到的次级文库进行扩增，随后进行3％琼脂糖胶分离，切胶回收目的条带，利用Axygan牌琼脂糖胶回收试剂盒进行目的产物回收。
(2)连接及连接产物的转化：在微量离心管中加入1μL pEASY-T5 Zero载体、4μL核酸适配体PCR产物；在25℃反应10min进行连接(pEASY-T5 Zero载体试剂盒中自带有连接酶)；将连接后产物加入50μL DH5α感受态细胞中，冰中放置20min；42℃热激30s后，再冰上放置2min；加入250μL的经37℃预热的LB培养基(不含抗性)，37℃，220rpm振荡培养60min；离心使体积为100μL左右，将其涂布于含有(100μg/mL)氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养静置培养16小时以形成单菌落。
(3)单克隆筛选、测序、成环和二级结构预测：挑取上述的单菌落溶于10μL无菌蒸馏水中，取5μL用于PCR鉴定阳性克隆(克隆鉴定引物为M13F和M13R)；将阳性克隆剩余的5μL用于菌体培养，培养条件为37℃，220rpm振荡培养8小时以上，培养菌体经质粒提取后，随机挑选10个阳性克隆，送上海生工进行核苷酸序列测定。经初步筛选获得两个不同候选适配体序列，命名为：Apt-2(SEQ ID NO.01：5’-gatactgcgtgcttgttccatatcagtagcggctctcggacggacctatatccctatcccactgacagtaagtgagaagttgcc-3’)和Apt-6(SEQID NO.02：5’-gatactgcgtgcttgttccataccattcggtactacatccta，gtcctcatcctcctgtctcatgacagtaagtgagaagttgcc-3’)。
(4)Apt-2和Apt-6二级结构预测：使用RNA Structure软件进行二级结构预测。结果表明，Apt-2，Apt-6二级结构为茎环结构，具有较高的稳定性，二级结构见图2。
(5)Apt-2、Apt-6成环制备Circ-Apt-2、Circ-Apt-6：分别取1μL 40μM Apt-2、Apt-6锁式成环序列、1μL 40μM成环辅助序列(SEQ ID NO.07：5’-caagcacgcagtatcggcaacttctcactt-3’)和14μL无核酸酶水加入EP管中。混均，95℃变性5min，冷却至室温静置15min。加入2μL
Figure BDA0003031002580000041
连接酶缓冲液和2μL 25000U/mL
Figure BDA0003031002580000051
连接酶。20℃下连接反应30min。加入1.6μL 20000U/mL Exonuclease I核酸外切酶和0.8μL 100000U/mL ExonucleaseIII核酸外切酶，37℃酶切反应1h去除末成环的单链序列，85℃灭活20min。
实施例3：DNA适配体与甲型H1N1流感病毒检测亲和力和特异性
(1)ELISA法检测Apt-2、Apt-6、Circ-Apt-2和Circ-Apt-6的Kd值：将10×的ELISA包被液稀释至1×，使用1×的包被液稀释病毒颗粒，96孔板每孔加入100μL，置于4℃孵育过夜。弃掉含有病毒的包被液，加入2％BSA封闭液300μL，于37℃在烘箱中封闭2h。弃去缓冲液，加入200μL的BW buffer室温漂洗5次，每次5min，除去多余的BSA。取100μL生物素标记的适配体，95℃变性10min，冰上冷却10min，室温放置10min使其充分变构，然后加进已封闭好的孔板中，室温孵育2h。加入200μL的BW buffer室温漂洗5次，每次5min。取0.5μL链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶加入到100μL BW buffer中混合，然后加进已漂洗完毕的孔板中室温孵育40min。加入200μL的BW buffer室温漂洗5次，每次5min。向每孔中加入100μL TMB显色液，5min后，加入2M H28O4溶液每孔100μL终止反应，随后使用酶联免疫分析仪在450nm波长处测定吸光值。横轴为靶标浓度，纵轴为(F0-F)/F0，统计亲和性数据进行计算，用graphpad软件中的拟合曲线得出Kd值，结果见图9。
根据以下公式对每一个适配体的Kd值进行计算：
y＝Bmax×x/(Kd+x)
式中y表示饱和度，即适配体结合的靶标蛋白占总靶标蛋白的质量分数；x表示加入适配体的浓度，nmol/L；Bmax为适配体与靶标蛋白的最大结合数目；Kd表示二者的解离常数，nmol/L。
图3、图4、图5和图6所示是适配体不同浓度梯度0、20、40、50、60、80、100、200、400、800、1600、3200nM时颜色的变化，随着适配体浓度的增大，溶液颜色由浅黄色变为深黄色，说明结合力不断增强。当吸光度不再增加达到饱和，说明此时适配体与H1N1结合到达饱和状态。使用GraphPad Prism 6进行非线性拟合得到Kd。Kd值结果依次为：Apt-2：Kd＝48.64±12.47nmol/L；Apt-6：Kd＝29.06±5.23nmol/L；Circ-Apt-2：Kd＝31.91±7.757nmol/L；Circ-Apt-6：Kd＝3.116±0.8743nmol/L。
(2)纳米金比色法检测DNA适配体Circ-Apt-2和Circ-Apt-6与甲型H1N1流感病毒检测灵敏度和特异性：
A、纳米金粒子制备：采用柠檬酸钠还原法制备纳米金，向圆底烧瓶中加入49mLH2O和1mL 1％氯金酸溶液，放入磁力搅拌子，再使用铁架台将圆底烧瓶固定放置在油浴锅中。(打开磁力搅拌器，控制油浴温度为140℃，等待圆底烧瓶中的溶液沸腾。快速加入3.5mL1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色由无色变为深蓝色(偏黑)，随后变为红褐色，最后变成酒红色，保持加热10min。关闭仪器，将圆底烧瓶取下自然冷却至室温。将得到的产品用孔径为0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤，然后转移至棕色瓶中用锡箔纸包好，避光4℃保存。
B、Circ-Apt-2和Circ-Apt-6与甲型H1N1流感病毒灵敏度检测：在96孔板各孔中分别加入8μL 1μM Circ-Apt-2或Circ-Apt-6，150μL纳米金，再加入不同浓度(各孔病毒浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9ng/μL)H1N1，再加ddH2O至体积为189μL，孵育30min，加入1M的NaCl 11μL，放置5min后观察颜色变化，用多功能酶标仪测400-800nm的吸收光谱，计算A650/A520，以病毒浓度为横坐标，A650/A520为纵坐标，作散点图，并找到病毒浓度与A650/A520的线性关系及其范围。如图7和图8所示，Circ-Apt-2和Circ-Apt-6与甲型H1N1流感病毒灵敏度为5ng/μL以内。
C、Circ-Apt-2和Circ-Apt-6与甲型H1N1流感病毒特异性检测：为在96孔板各孔中分别加入8μL 1μM Circ-Apt-2或Circ-Apt-6，150μL纳米金，再加入同浓度的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、B。图9为Circ-Apt-2加入不同靶标纳米金颜色的变化，可以看出加入H1N1的纳米金颜色为紫色，加入其他靶标或是空白对照则为酒红色。表为靶标与其他阴性对照的ΔA650/A520对比，绘制成柱形图如图，使用spss对其进行独立样本t检验，实验组与对照组ΔA650/A520具有明显差异，故而适配体Circ-Apt-2与其他干扰靶标不结合，能与H1N1特异性结合。图10为适配体Circ-Apt-6加入不同靶标纳米金颜色的变化，可以看出加入H1N1的纳米金颜色为紫色，加入其他靶标或是空白对照则为酒红色。表为靶标与其他阴性对照的ΔA650/A520对比，绘制成柱形图如图，使用spss对其进行独立样本t检验，实验组与对照组ΔA650/A520具有明显差异，故而适配体Circ-Apt-6与其他干扰靶标不结合，能与H1N1特异性结合。
实施例4：DNA适配体Circ-Apt-2和Circ-Apt-6纳米金比色法检测甲型H1N1流感病毒的应用
在样本提取管中垂直加入400μL样本提取液，将采样后的拭子插入样本提取管中溶液中，紧靠Ep管内壁旋转约10次，使标本尽可能溶解在溶液内。沿提取管内壁挤压拭子的签头，使液体尽可能留在管内，取出并弃去拭子。
在96孔板各孔中分别加入8μL 1μM Circ-Apt-2(Circ-Apt-6)、150μL纳米金、10μL样本溶液和21μL超纯水，室温孵育30min，加入1M的NaCl 11μL，室温孵育10min后观察颜色变化。如图11所示，采用Circ-Apt-2或Circ-Apt-6纳米金比色法均能很好的检测甲型H1N1流感病毒，明显区分甲型H1N1流感病毒阳性和阴性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatactgcgt gcttgttcca tatcagtagc ggctctcgga cggacctata tccctatccc 60
actgacagta agtgagaagt tgcc 84
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatactgcgt gcttgttcca taccattcgg tactacatcc tagtcctcat cctcctgtct 60
catgacagta agtgagaagt tgcc 84
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatactgcgt gcttgttcca ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgacagtaag tgagaagttg cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatactgcgt gcttgttcca ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcaacttct cacttactgt ca 22
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagcacgca gtatcggcaa cttctcactt 30

Claims (10)

1.一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。
2.如权利要求1所述一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其特征在于：其为单链状或为环状。
3.权利要求1或2所述的甲型H1N1流感病毒核酸适配体在制备甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：采用纳米金比色检测法。
5.一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的甲型H1N1流感病毒核酸适配体。
6.一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。
7.如权利要求6所述一种甲型H1N1流感病毒核酸适配体，其特征在于：其为单链状或为环状。
8.权利要求6或7所述的甲型H1N1流感病毒核酸适配体在制备甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：采用纳米金比色检测法。
10.一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求6或7所述的甲型H1N1流感病毒核酸适配体。
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