CN101660005A

CN101660005A - 基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101660005A
Application number: CN200910041358A
Authority: CN
Inventors: 曹以诚; 黄逸男; 李志勇; 杜正平; 陈洵; 谭惠媚; 王志强
Original assignee: GUANGZHOU HUAFENG BIOTECH CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HUAFENG BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2029-07-24
Also published as: CN101660005B

Abstract

本发明公开一种基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，所述两对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示，以上八种液体分别置于容器中。本发明的试剂盒及其检测方法可高效高特异性地检测甲型肝炎病毒，它们是基于环介导等温扩增技术，应用六个区段，四条引物，一个恒定温度，在不到1小时即可完成扩增反应，检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

Description

基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

目前对甲型肝炎病毒有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和血清学鉴定为主的国家标准(GB/T 18936-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法(GB/T 22287-2008)。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核分歧杆菌的基因快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测甲型肝炎病毒的。

本发明的另一个目的是提供上述甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一、本发明的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，其中：

所述两对引物为：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

其中，Y代表C或T；

上述反应液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L氯化钾、10～12.5mmol/L硫酸铵、8～10mmol/L硫酸镁、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L。优选的比例是：反应液含有2mmol/L dNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。(0.1～0.125％TritonX-100是：Triton X-100占反应液的体积百分比为0.1～0.125％)

上述逆转录酶优选为AMV逆转录酶。

上述阳性对照为携带甲型肝炎病毒基因的质粒DNA。

上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。

上述稳定液优选为石蜡油。

二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将逆转录酶无菌分装，抽样质检；

5、将RNA酶抑制剂无菌分装，抽样质检；

6、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

7、组装试剂盒。

三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法

1、样品处理：

样品的采集、保存和处理，可采用GB/T 18936-2003中2.1款进行；

提取样品核酸，可采用GB/T 19439-2004进行样品核酸提取获得样品模板或使用等同的商品化核酸提取试剂盒按说明书操作提取RNA模板。

2、环介导等温扩增技术反应过程

在反应管中加入反应液38～40体积％、Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积％、逆转录酶0.9～1.8体积％、RNA酶抑制剂0.9～1.8体积％、稳定液52～54.5体积％、样品模板RNA 4.5～7.3体积％，63～65℃恒温反应45～90min。所述体积百分比是指占六个组分总体积的体积百分比。

3、反应后处理

在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

本发明所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测甲型肝炎病毒的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1试剂盒的制备

(1)DNA合成仪合成如下寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器。

(3)配制反应液：反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。

(4)购置逆转录酶：AMV逆转录酶置于容器。

(5)购置RNA酶抑制剂：RNA酶抑制剂置于容器。

(6)购置稳定液：石蜡油，置于容器。

(7)购置显色液：SYBR Green I，置于容器。

(8)提取阳性对照：提取含甲型肝炎病毒基因的质粒DNA，置于容器。

(9)将上述8个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将Bst酶分装，抽样质检；

5、将逆转录酶分装，抽样质检；

6、将RNA酶抑制剂分装，抽样质检；

7、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

8、将显色液分装，抽样质检；

9、组装试剂盒。

实施例2试剂盒的制备

反应液的配方为：反应液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-Cl、10mmol/L氯化钾、10mmol/L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0.1体积％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol/L和外引物F3/B3各0.2mol/L。

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例3甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒的应用

按照GB/T 18936-2003中2.1款的方法采集样品，25g贝类样品中加入175mL甘氨酸缓冲液(pH 7.5，甘氨酸0.5mol/L，NaCL 0.3mol/L)，搅拌器充分混匀，37℃30min。4℃1000r/m20min，取上清。用8％PEG8000(含NaCl终浓度为0.75mol/L)4℃过夜沉降病毒。10000r/m15min，弃上清，用10mL PBS缓冲液(pH7.4)重悬沉淀，加入等体积3-氯-3-氟-乙烷，混匀，4℃10000r/m15min，小心吸取上清，用8％PEG8000(含NaCl终浓度为0.75mol/L)于4℃过夜沉降病毒。4℃14000r/m15min，弃上清，适量PBS缓冲液重悬沉淀。取1/4体积悬液，等体积氯仿抽提1次，小心收集上清液用于RNA提取。上清液250μL加入1.5mL离心管中，再加人750μLTrizol，室温静置5min，再加200μL氯仿，振荡混匀，室温放置10-15min，12000r/m离心15min，取上清，加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，混匀后12000r/m离心10min，去上清，加入1mL75％乙醇洗涤，猛烈振荡后，7500xg离心5min。彻底去除上清，待核酸自然干燥，用30μLDEPC水于55℃-60℃温育10min以溶解RNA。马上进行RT-LAMP。

1.核酸扩增

a)试剂盒内反应液使用前建议室温融化振荡混匀后，2000r/min离心10sec；其余室温融化后，2000r/min离心10sec即可。

b)设所需LAMP反应管数为n(n＝样本数+1管阳性对照+1管阴性对照)，每个PCR反应管中体系为：反应液21μL、AMV酶0.5μL、Bst DNA聚合酶1μL和RNase抑制剂0.5μL。

c)计算好各试剂的用量，加入一洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，2000r/m离心10sec，向设定的n个PCR反应管中分别加入23μL上述混合液，移至样本处理区加样；

d)向上述n个PCR反应管内分别加入阴性对照、待测模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，移至反应区；

e)置65℃恒温孵育90min。

2.结果检测

取出PCR反应管，冷却至室温，2000r/min离心10sec，分别加入2μL显色液，轻轻混匀，即可观察；建议在黑色背景下观察。

3.结果判断

在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：

a)待检样本反应管液体呈绿色，该样本结果检测阳性；

b)待检样本反应管液体呈橙色则可报告检验结果为阴性；

若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

本实施例的25份贝类样品，LAMP检测根据结果颜色判断结果，其中8份阳性。

采用本领域常规的PCR扩增方法，对本实施例的325份贝类样品进行核酸测序检测，结果发现其中8份样品含有甲型肝炎病毒，与上述LAMP检测的结果保持一致。

基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法序列表

SEQUENCE LISTING

<110>广州华峰生物科技有限公司

<120>基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcyttggata gggtaacagc 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccctctcac agratcccat 20

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggatgagagy cagtcctccg gcttttggcg gatattggtg agttgt 46

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tgagtggatt gaytgtcagg gcttttgttt gccctaagca cagaga 46

Claims

1、基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，

上述两对引物为：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

上述反应液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-Cl、10～12.5mmol/L氯化钾、10～12.5mmol/L硫酸铵、8～10mmol/L硫酸镁、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；

上述阳性对照为携带甲型肝炎病毒基因的质粒DNA。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述显色液为SYBR Green I或EvaGreen。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。

4、利用权利要求1所述试剂盒检测甲型肝炎病毒的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)采集样品；

(2)提取样品核酸；

(3)在反应管中加入反应液38～40体积％、Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积％、逆转录酶0.9～1.8体积％、RNA酶抑制剂0.9～1.8体积％、稳定液52～54.5体积％、样品模板DNA 4.5～7.3体积％，恒温反应；

(4)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

5、根据权利要求4所述检测方法，其特征在于步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。

6、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述稳定液为石蜡油。

7、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

8、根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述显色液为SYBR GreenI或EvaGreen。