CN111733285A

CN111733285A - 用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111733285A
Application number: CN202010512878.9A
Authority: CN
Inventors: 曹际娟; 郑秋月; 朴永哲; 杨莉莉
Original assignee: Dalian Minzu University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明提供了用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、恒温荧光试剂盒及方法，引物组包括外引物HAV‑OF、HAV‑OB，内引物HAV‑IF、HAV‑IB和环引物HAV‑LB，采用本发明的引物组在恒温条件下逆转录扩增样品的病原体RNA，通过荧光信号扩增情况进行分析，可判定样品中是否含有甲型肝炎病毒。本发明为甲型肝炎病毒的核酸检测提供了快速有效、精准可靠的方法，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

Description

用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法。

背景技术

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)甲型肝炎病毒呈全世界分布，可通过粪-口途径传播，或通过摄入受污染的食物和水，或通过人与人之间的交流传播，导致引发的甲型病毒性肝炎，从而危害人民群众健康。对于目前甲型肝炎病毒检测技术存在的问题主要在于：全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低。实时RT-PCR检测已被开发用于实验室检测甲型肝炎病毒，但是，这些检测方法有内在缺陷，要么需要高精度的放大仪器，要么需要复杂而精细的方法来检测放大产物。基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵。环介导等温扩增检测已被开发用于实验室检测甲型肝炎病毒，也存在着检测灵敏度不能完全检测出低含量甲型肝炎病毒的现象。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，灵敏度相对较低，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足食品中甲型肝炎病毒快速检测的需要。恒温扩增技术操作简单，不需要专业较高的技术人员即可进行操作，但是鉴于引物的设计难度较大，导致缺少恒温扩增的试剂。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组，该引物组可特异、灵敏扩增甲型肝炎病毒。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组，其包括外引物HAV-OF、HAV-OB，内引物HAV-IF、HAV-IB和环引物HAV-LB，其中，所述HAV-OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HAV-OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HAV-IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HAV-IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HAV-LB的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的荧光试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组。

如上所述的荧光试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。

优选地，所述BcaBEST酶浓度为102U/μL，AMV逆转录酶为5U/μL。

如上所述的恒温荧光试剂盒，优选地，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含SEQ ID NO.6所示序列在内的核苷酸序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的方法，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外引物HAV-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物HAV-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物HAV-IF，SEQ ID NO.4所示的内引物HAV-IB、SEQ ID NO.5所示的环HAV-LB；

S3、结果判定：

若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；

若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；

若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系采用25μL，含有按终浓度计的1×恒温扩增反应缓冲液，HAV-OF、HAV-OB的终浓度各0.2μM，HAV-IF、HAV-IB的终浓度各1.6μM，HAV-LB的终浓度为0.8μM，BcaBEST酶65U，AMV酶1U，0.34×TB Green及1μL样品RNA模板。

如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系25μL，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有：2×恒温扩增反应缓冲液12.5μL，34×TBGreen 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物HAV-OF和HAV-OB 0.5μL，40μM内引物HAV-IF和HAV-IB 1μL，20μM环引物HAV-LB和TE缓冲液1μL，样品RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，所述恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，同时设置以含有如SEQ IDNO.6所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为阴性对照进行检测。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测甲型肝炎病毒。本发明提供的用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的方法有效的、精准的、可靠。本发明荧光试剂盒具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。所提供的用于恒温扩增甲型肝炎病毒荧光试剂盒及方法，检测时间可在30分钟-45分钟完成，操作简便、快捷，既可以使用廉价的恒温检测仪，又可以使用荧光定量PCR仪，可适用于现场检测，性能指标与荧光定量RT-PCR具有同等水平，具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。

附图说明

图1为甲型肝炎病毒靶标基因序列种内保守型比对结果；

图2为甲型肝炎病毒靶标基因序列种间特异性比对结果；

图3为第一套引物筛选图，阳性对照出峰时间约13min，阴性对照15min有微弱翘尾，曲线倾斜向上，有引物二级结构；

图4为第二套引物筛选图，阳性对照出峰时间约8min，一个阴性对照在55min处有大幅度翘尾；

图5为第三套引物筛选图，阳性对照出峰时间约30min；

图6为第四套引物筛选图，阳性对照出峰时间很晚，约57min出峰；

图7为第五套引物筛选图，阳性出峰时间约10min，阴性对照无扩增；

图8为恒温扩增荧光反应体系的筛选优化结果；

图9为甲型肝炎病毒特异性验证结果；

图10为恒温扩增荧光方法检测灵敏度结果；

图11为采用甲型肝炎病毒试剂盒检测4份贝类水产品样品的检测结果；

图12为采用甲型肝炎病毒试剂盒检测1份水果样品的检测结果；

图13为采用甲型肝炎病毒试剂盒检测2份养殖水样品的检测结果；

图14为采用甲型肝炎病毒试剂盒检测1份甲型肝炎患者血清样本的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1甲型肝炎病毒恒温扩增检测引物组设计及筛选

1.引物组设计

本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行甲型肝炎病毒基因组特异序列的筛选，筛选在甲型肝炎病毒中保守的、在其他病毒中不存在或同源性低的基因片段作为检测分子。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。本发明根据GenBank下载26组甲型肝炎病毒靶标基因序列，选取多聚蛋白基因(polyprotein gene)，经比对分析对在甲型肝炎病毒种内序列同源保守性为100％以上，种内保守型比对结果如图1所示。种间特异性比对结果显示，在种间与其他物种仅约50％序列相似，仅有部分序列与其他物种类似，上下游引物均不在其中，靶标基因序列特异性良好。种间特异性比对结果如图2所示。选取甲型肝炎病毒的特异性基因片段(GenBankEU131373)的保守区多聚蛋白基因(polyprotein gene)，采用LAMP Primer Explorer 5软件自行设计引物，设计了五组恒温扩增引物，一组有六个的引物，包括两个外引物(OF和OB)、两个内引物(IF和IB)和一个环引物(LB)，并使用Primer blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。本发明设计的五组引物组基因序列如表1所示。

表1本发明设计的五组甲型肝炎病毒恒温扩增引物组

2.引物筛选

对本发明设计的五组引物进行筛选优化，引物筛选试验结果表明，第一套引物阳性出峰时间约13min，阴性对照15min有微弱翘尾，且曲线倾斜向上，有引物二级结构，扩增结果如图3所示；第二套引物阳性出峰时间约8min，但阴性对照55min出有大幅度翘尾，出现假阳性，扩增结果如图4所示；第三套引物阳性出峰时间约30min，扩增结果如图5所示；第四套引物较晚约57min才出现微弱扩增，结果如图6所示；第五套引物筛选图，阳性(含SEQ IDNO.6所示序列的核苷酸序列的质粒体外转录RNA)出峰时间约10min，阴性对照(采用去核酸的超纯水为模板)无扩增，扩增结果如图7所示。由此可见，第五套引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增第五套引物组具有很好的特异性。因此，确定获得第五套引物组为最佳的可供特异性检测甲型肝炎病毒恒温扩增引物组序列，其第五套引物组扩增的阳性核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6中的第318bp-第529个bp所示。

其中，阳性对照品为含基因组序列SEQ ID NO.6所示的质粒体外转录RNA，

SEQ ID NO.6：TTCAAGAGGGGTCTCCGGGAATTTCCGGAGTCCCTCTTGGAAGTCCATGGTGAGGGGACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTTCCCTTTTCCCTTTCCTATTCCCTTTGTTTTGCTTGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTAAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCATTTTTCACGCTTTCTGTCTTCTTTC227TTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCATGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACACAGATGTTTGGAACGTCACCTTGCAGTGTTAACTTGGCTTTCATGAATCTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGACTCTCATCCAGTGGATGCATTGAGTGGATTGACTGTCAGGGCTGTCTTTAGGCTTAATTCCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACATCATTTGGCCTTAAATGGGATTCTGTGAGAGGGGATCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTGTTTGCCTCTGAGGTACTCAG。

实施例2恒温扩增—实时荧光检测反应体系的优化

阳性对照品的制备：根据实施例1获得的最佳甲型肝炎病毒特异性恒温扩增基因序列，选取含SEQ ID NO.6所示序列经人工合成基因制备质粒，并经体外转录RNA作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。

将阳性对照品作为检测样本，使用第五套引物组进行恒温扩增—实时荧光检测检测体系的建立及优化测试。按照表2中的试剂组成、浓度及体积配置，设计四个组合用于筛选优化最佳的恒温扩增反应体系。

恒温扩增—实时荧光反应程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：

等温扩增仪：63℃条件下反应45min。

实时荧光定量PCR仪：荧光基团选择FAM或SYBR，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，45个循环。

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

表2恒温扩增反应体系优化的组合筛选配置表

其中，2×恒温扩增反应缓冲液(可购自宝生物工程(大连)有限公司)是将恒温扩增反应所需的含有dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、甜菜碱等反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。

按照表2恒温扩增反应体系优化的组合筛选配置表，分别对阴性对照(Negativecontrol，不含阳性序列的质粒)、0.01ngRNA，0.1ngRNA，1ngRNA(阳性对照)的模板进行恒温扩增。

恒温扩增结果见图8，图中标号1为筛选组合4的反应体系，标号2为筛选组合3的反应体系，标号3为筛选组合2的反应体系，标号4为筛选组合1的反应体系。从恒温扩增-实时荧光检测结果来看，添加AMV逆转录酶的筛选组合3和筛选组合4可以明显提高BcaBEST2.0/BcaBEST 3.0的恒温扩增的反应速率。从BcaBEST评价的反应体系中，筛选组合4的BcaBEST 2.0的效果要好于BcaBEST 3.0。最终确定筛选组合4的具有明显S形扩增曲线，且曲线光滑，Ct值较为合适的检测体系，如表3所示。

表3恒温扩增的反应体系

试剂	体积	终浓度
			2×恒温扩增反应缓冲液	12.5μL	1×
10μM外引物(HAV-OF、HAV-OB)	0.5μL	0.2μM
			40μM内引物(HAV-IF、HAV-IB)	1μL	1.6μM
20μM环引物(HAV-LB)、TE缓冲液	1μL	0.8μM
			102U/μL BcaBEST酶	0.6μL	65U
5U/μL AMV逆转录酶	0.2μL	1U
			34×TB Green	0.25μL	0.34×
1～100ng RNA模板	1.0μL	——
			去核酸的超纯水	补足25μL	——
总体积	25.0μL	——

2×恒温扩增反应缓冲液、BcaBEST酶、AMV逆转录酶、TB Green可购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例3恒温扩增—实时荧光检测特异性

1.恒温扩增荧光反应体系

恒温扩增—实时荧光反应体系中含有：2×反应缓冲液12.5μL，0.34×TB Green0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM HAV-OF和HAV-OB 0.5μL，40μM HAV-IF和HAV-IB 1μL，20μM HAV-LB和TE缓冲液1μL，1～100ng样品RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。本发明引物组中只有HAV-LB，没有HAV-LF，所以配制引物时原本加HAV-LF的要换成TE缓冲液来加入。

样品RNA模板分别为甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒和戊型肝炎病毒的RNA(这些RNA均为委托宝生物工程(大连)有限公司本人工合成的体外转录RNA)进行检测特异性验证，同时设置阳性对照。

2.进行恒温扩增—实时荧光反应。程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：

等温扩增仪：63℃条件下反应45min。

反应完成后，根据有无“S”型荧光信号扩增曲线判定结果。

无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45，判定为阴性；

有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，可报告为阳性。

可疑：Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

结果如图9所示，图中，标号1～2为甲型肝炎病毒RNA出现特异性荧光信号扩增曲线，其中1为阳性对照品，2是甲型肝炎病毒RNA，结果均为阳性；标号3～6分别轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒和戊型肝炎病毒的体外转录RNA，未检测到扩增曲线，结果均为阴性。

结果只有甲型肝炎病毒RNA出现了特异性扩增曲线，其他病毒RNA未检测到扩增曲线，说明所用引物具有较强的特异性。

实施例4灵敏度试验

分别将甲型肝炎病毒体外转录RNA质粒的阳性对照样本以10倍比浓度进行稀释，梯度浓度分别为1×10⁷copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL，经同实施例3的恒温扩增荧光反应体系进行检测，验证本发明所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增引物组所建立的恒温扩增—实时荧光检测方法的灵敏度。

扩增结果如图10所示，图中标号1～9分别为1×10⁷copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、1copies/μL的不同浓度体外转录RNA。表明5copies/μL浓度可检出阳性结果。

经多次试验显示1copies/μL浓度RNA为概率性检出(70％)；5copies/μL浓度三个平行样本均检出，均存在明显荧光扩增曲线，且曲线形态良好。采用5copies/μL RNA样本作为模板进一步进行20个重复测试，确定本发明所设计的甲型肝炎病毒恒温扩增检测的引物组和反应体系的检测灵敏度为5copies/μL。

常用的Bst DNA聚合酶只有链置换性能，而本发明使用的BcaBEST酶既有链置换性能又具有逆转录性能，结合AMV酶的逆转录作用，增强了逆转录性能效果，因而明显地提高了检测灵敏度。

实施例5恒温扩增检测甲型肝炎病毒的荧光试剂盒及使用方法

1.该试剂盒的组成包括：

引物组：包括有外引物HAV-OF的核苷酸如SEQ ID NO.1所示、外引物HAV-OB的核苷酸如SEQ ID NO.2所示、内引物HAV-IF的核苷酸如SEQ ID NO.3所示，内引物HAV-IB的核苷酸如SEQ ID NO.4所示、环HAV-LB的核苷酸如SEQ ID NO.5所示；

2×恒温扩增反应缓冲液；

102U/μL BcaBEST酶；

5U/μL AMV逆转录酶；

34×TB Green；

阳性对照质粒RNA；

去核酸的超纯水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

使用时：

(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，放置于冰盒上。

(2)依据表3中的恒温扩增—实时荧光反应体系加样于EP管。

(3)试剂配制

若有N个待检样品，则参照下表4，按照N+5个数量计算各组分用量(N个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照+1个空白对照，还有一些不必要的损失)，将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30秒，取24μL分装于0.2mL PCR管中，分别加入待测RNA样品1μL用于检测。

表4 N个待检样品的试剂配制参考表

每此反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

(4)恒温扩增的程序为63℃条件下反应45min。

结果的判定：

若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；

(5)注意事项

该试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。

反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

实施例6应用

1.病毒的收集

1.1贝类中病毒的收集

取贝类数量不得少于10只，用无菌刀剥离贝类内脏团中消化腺，匀浆，称取约2g并转移至50mL离心管中，加入1mL PBS混匀。加入10μL的蛋白酶K，漩涡混匀，37℃320r/min摇床孵育1h，而后60℃水浴摇床再次孵育15min。室温下3 000g离心5min，取上清液转移至一新的50mL离心管中，记录体积数，用于RNA的提取。

1.2硬果表面病毒的收集

将浸润PBS的无菌棉擦拭硬果表面，记录擦拭面积，适合最大擦拭面积约100cm²。无菌棉放入500μL 0.5mol/L的硫氤酸弧裂解缓冲液中，按压无菌棉，将液体全部挤出，重复上述操作3次，留取裂解液用于RNA的提取。

1.3软果表面病毒的收集

取软果6颗～12颗放入400mL体积的带滤网的均质袋中，加入40mLTGBE缓冲液、30U的黑曲霉果胶酶，室温下60r/min振荡孵育20min。对于酸性软果，在孵育过程中，每10min监测洗脱液的pH值，当pH值低于9.0，则应用NaOH溶液调节至9.5。每调节一次pH值，则需要延长10min的孵育时间。将洗脱液转移到50mL离心管中，4℃10 000g离心30min，上清液转入干净的离心管中，用1mol/L盐酸溶液将pH调节至7.0。加入0.25体积的5×PEG/NaCl溶液，振荡60s，5℃过夜或60r/min振荡孵育60min。5℃10 000g离心30min，弃上清液，50℃10 000g离心5min，弃上清液，加入500μL PBS重悬沉淀。对于浆液过多的部分软果类样品，PBS重悬沉淀后，加入500μL的氯仿-正丁醇，涡旋混合，室温下孵育5min，5℃10 000g离心15min，取上清液用于RNA的提取。

1.4蔬菜中病毒的收集

蔬菜用生理盐水或PBS或灭菌水溶解为5～10％浓度悬浊。10,000～15,000rpm离心5min，取上清液用于RNA的提取。

1.5水中病毒的收集

取水样品体积(适合0.3L～5L)，混匀。正压或抽滤方法将水体滤过直径47mm、孔径0.45μm的正离子滤膜，将滤膜转移至一新的50mL离心管A中，加入4mL TGBE缓冲液。在原盛装样品的瓶子中加入10mL TGBE缓冲液，室温下500r/min摇床振荡离心管A和瓶子20min，收集离心管A和容器中的洗脱液至新离心管B中。在瓶子中再加入TGBE缓冲液2mL，颠倒数次冲刷瓶壁，收集洗脱液至50mL离心管B中。用0.1mol/L盐酸溶液调节洗脱液至pH 7.0，收集洗脱液并转移至超滤管，4 000g离心15min。将超滤管底浓缩液转移至新的离心管，用PBS溶液补齐体积至500/L，保留用于RNA的提取。

2.RNA提取

按照磁珠法病毒RNA提取试剂盒的操作步骤提取甲型肝炎病毒样本的RNA(可购自于广州双螺旋基因科技有限公司，货号071091M)。用50μL去核酸的超纯水进行溶解并置于-80℃环境备用。

注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品RNA。3.将该检测方法应用于市场中贝类水产品、水果、蔬菜等食品以及滩涂养殖用水的检测，按照上述方法进行样品处理和提取总RNA，采用实施例5的试剂盒进行恒温扩增—实时荧光反应，检测其中是否含有甲型肝炎病毒。

用本发明的试剂盒对于获取的167份食品样品、1份甲型肝炎患者血清样本，包括冻杂色蛤、活杂色蛤、扇贝等113份贝类，草莓、红豆果等35份水果，西红柿、生菜、芹菜等6份蔬菜，养殖水等13份水样品，甲型肝炎患者血清等1份样本进行了检测。结果显示，从冻煮杂色蛤肉、冻生开杂色蛤肉、冻杂色蛤、活杂色蛤等4份贝类样品，速冻红豆果等1份水果样品，2份养殖水样品，1份甲型肝炎患者血清样本中检出甲型肝炎病毒阳性，其余为阴性。其中，4份贝类的阳性检测结果如图11所示，图中标号1～5分别为阳性对照、冻煮杂色蛤肉、冻生开杂色蛤肉、冻杂色蛤、活杂色蛤样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线，结果为阳性；标号6为空白对照未检测到扩增曲线，结果为阴性。1份水果的阳性检测结果如图12所示，图中标号1为阳性对照，标号2为速冻红豆果样品，出现了特异性荧光信号扩增曲线；标号3为空白对照未检测到扩增曲线。2份养殖水样品的阳性检测结果如图13所示，图中标号1为阳性对照，标号2和3为养殖水样品，出现了荧光信号特异性扩增曲线；标号4为空白对照未检测到扩增曲线。1份甲型肝炎患者血清样本的阳性检测结果如图14所示，图中标号1为阳性对照，标号2为甲型肝炎患者血清样本，出现了荧光信号特异性扩增曲线；标号3为空白对照未检测到扩增曲线。

同时，采用实时荧光定量RT-PCR方法《出口食品中诺如病毒和甲肝病毒检测方法实时RT-PCR方法》SN/T 4784—2017，对采用本发明的试剂盒检测上述样品的甲型肝炎病毒检测结果进行验证，阳性重复性为100％，且本发明试剂盒检测呈现的荧光信号增幅Ct值明显优于实时RT-PCR方法，具有检测灵敏度高的优势，部分Ct值比较结果见表5。

表5本发明试剂盒与实时RT-PCR法的检测Ct值比较结果

本发明的方法应用于甲型肝炎病毒检测将具有广阔的前景，广泛适用于对贝类水产品、水果、蔬菜、环境水质等领域。

上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

序列表

<110> 大连民族大学

<120> 用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggacacag atgtttggaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccactggat gagagtcagt 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgtagccta ccccttgtgg aaccttgcag tgttaacttg gc 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgccttggat agggtaacag cgctccggcg ttgaatggtt 40

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggatattg gtgagttgtt aaga 24

<210> 6

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaagaggg gtctccggga atttccggag tccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60

tgatacctca ccgccgtttg cctaggctat aggctaaatt ttccctttcc cttttccctt 120

tcctattccc tttgttttgc ttgtaaatat taattcctgc aggttcaggg ttcttaaatc 180

tgtttctcta taagaacact catttttcac gctttctgtc ttctttcttc cagggctctc 240

cccttgccct aggctctggc cgttgcgccc ggcggggtca actccatgat tagcatggag 300

ctgtaggagt ctaaattggg gacacagatg tttggaacgt caccttgcag tgttaacttg 360

gctttcatga atctctttga tcttccacaa ggggtaggct acgggtgaaa cctcttaggc 420

taatacttct atgaagagat gccttggata gggtaacagc ggcggatatt ggtgagttgt 480

taagacaaaa accattcaac gccggaggac tgactctcat ccagtggatg cattgagtgg 540

attgactgtc agggctgtct ttaggcttaa ttccagacct ctctgtgctt agggcaaaca 600

tcatttggcc ttaaatggga ttctgtgaga ggggatccct ccattgacag ctggactgtt 660

ctttggggcc ttatgtggtg tttgcctctg aggtactcag 700

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catggagctg taggagtcta 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgagtacctc agaggcaa 18

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctccggcgt tgaatggtaa cctcttaggc taatacttct atg 43

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actgactctc atccagtgga agaggtctgg aattaagcct a 41

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccaatatccg ccgctgt 17

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcattgagtg gattgactgt c 21

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttggaacgtc accttgc 17

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgagtacctc agaggcaa 18

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctccggcgt tgaatggtac ttctatgaag agatgccttg 40

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actgactctc atccagtgga agaggtctgg aattaagcct a 41

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccaatatccg ccgctgt 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcattgagtg gattgactgt c 21

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taggctctgg ccgttg 16

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgagtacctc agaggcaa 18

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtttcacccg tagcctaccc catggagctg taggagtcta 40

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cggaggactg actctcatcc aagaggtctg gaattaagcc ta 42

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccaagttaac actgcaaggt g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcattgagtg gattgactgt c 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcatggagct gtaggagtct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tccactggat gagagtcagt 20

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgtagcctac cccttgtgga aggtttggaa cgtcaccttg ca 42

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgccttggat agggtaacag cgctccggcg ttgaatggtt 40

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcggatattg gtgagttgtt aaga 24

Claims

1.一种用于恒温扩增检测食品中甲型肝炎病毒的引物组，其特征在于，其包括外引物HAV-OF、HAV-OB，内引物HAV-IF、HAV-IB和环引物HAV-LB，其中，所述HAV-OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HAV-OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HAV-IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HAV-IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HAV-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的荧光试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含SEQ ID NO.6所示序列的核苷酸序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的超纯水。

5.一种用于恒温扩增荧光检测甲型肝炎病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外引物HAV-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物HAV-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物HAV-IF，SEQ ID NO.4所示的内引物HAV-IB、SEQ ID NO.5所示的环引物HAV-LB；

S3、结果判定：

若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系采用25μL，含有按终浓度计的1×恒温扩增反应缓冲液，HAV-OF、HAV-OB的终浓度各0.2μM，HAV-IF、HAV-IB的终浓度各1.6μM，HAV-LB的终浓度为0.8μM，BcaBEST酶65U，AMV酶1U，0.34×TB Green及1μL样品RNA模板。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系25μL，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有：2×恒温扩增反应缓冲液12.5μL，34×TB Green 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物HAV-OF和HAV-OB 0.5μL，40μM内引物HAV-IF和HAV-IB 1μL，20μM环引物HAV-LB和TE缓冲液1μL，RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的程序为63℃条件下反应45min。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，同时设置以含有如SEQID NO.7所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。