CN109207641B - 一种多重rt-pcr检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种多重rt-pcr检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重RT‑PCR检测试剂盒及其在同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2中的应用。试剂盒含质控病毒MS2和三种质控模板(含NoV GI、NoV GII和MS2特异性核苷酸序列的质粒)。检测体系含诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2各自的正向引物、反向引物和特异性探针。本发明的多重检测体系及其试剂盒与传统方法相比不需要采用常规单一检测，可在同一反应体系内直接对检测样品中混合病毒进行同步检测和分析，检测信号干扰性小，灵敏度高，第一时间为医院食源性疾病监测及食品样品提供全面、精确、高效的诺如病毒检测结果及参考。

Description

一种多重RT-PCR检测试剂盒及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种多重PCR检测试剂盒，特别涉及一种同时检测诺如病毒GI、GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的多重PCR检测试剂盒及方法。
(二)背景技术
诺如病毒(Norovirus,NoV)属于杯状病毒科(Caliciviruses)的诺瓦克病毒属。1972年由Kapikian等学者首次用电镜的方法发现。该病毒基因组分子大小为7.3-7.6Kb，通常根据NV病毒RNA聚合酶编码区核苷酸或外壳蛋白区氨基酸序列的差异，可将NV分为5个不同的基因型(GGI、GGII、GGIII、GGIV和GGV)，其中GGI和GGII为常见的致病型。诺如病毒对外界的抵抗力较强，通常能引起自限性、轻中度的胃肠道感染症，其特点是高发病率、低致病剂量。诺如病毒目前被认为是世界范围内流行性、非细菌胃肠炎暴发的主要原因。
大肠杆菌噬菌体MS2属于非细胞原生物的细菌病毒，专性感染和寄生于相应的活细菌体内，具有作为水体中肠道病毒指示物的基本条件；对人没有致病性，且在有肠道病毒污染的水环境中普遍存在；可实验室培养，数量高于肠道病毒，在形态特征、理化特性、对自然环境条件和消毒剂的抗性等方面与肠道病毒类似；检测操作具有简便快速、安全可靠、受环境影响小和设备简单等优点。基于以上几点考虑，在目前的病毒检测中通常加入MS2作为食品以及水体中病毒样本的提取及PCR检测的质量控制标品。
近年来，随着当前国际贸易、国际旅游业的快速增长，食品市场的全球化引发了食品的高风险性，并使食源性疾病有在全球蔓延的趋势。全球食源性疾病和恶性食品污染事件频频的发生，使食品安全已成为一个严重并不断扩大的世界卫生问题，并日益成为全球关注的热点。作为食品安全的头号问题，食源性疾病的发生中多数是由诺如病毒引起的。2006年11月，日本、新加坡、意大利等地相继发生了与食品有关的诺如病毒集体感染事件，特别是日本，不到两个月累计发生了35.76万人感染了诺如病毒。中国自1995年报告首例诺如病毒感染病例后，国内许多地区多次暴发诺如病毒感染性急性胃肠炎(疫情主要集中在广东和浙江省)。诺如病毒已日益成为重要的公共卫生问题。
长期以来，由于病毒检测技术落后，且病毒个体较小(直径约为50-300nm)，难于直接检测等原因，阻碍了病毒检测的发展。近年来，随着分子生物学技术的进步，常规核酸PCR和半数组织细胞感染量(TCID50)成为了病毒的主要方法。随着新技术的发展，相对于常规核酸PCR而言，新出现的多重荧光定量PCR技术使得病毒的整个检测过程具有了实时检测、定量准确、高效、高灵敏度和重复性好等优点。目前，由于诺如病毒还不能够完全在实验室条件下进行培养，荧光定量PCR技术已成为诺如病毒的主要检测方法。发达国家应用该技术对诺如病毒检测研究已从单纯的检测诺如病毒GI/GII型到同时检测两种或者三种不同类型的病毒。而我国对诺如病毒检测技术研究起步较晚，多重荧光定量PCR技术的引入，将进一步增强诺如病毒检测的范围、高效性和灵敏度。
综上所述，尽管目前国际上关于不同诺如病毒检测的方法已有不少报道，但由于病毒往往附着在食品、水以及其他物品的表面或者内部，在具体操作过程中往往需要加入质控样品MS2，才能保证每次操作的准确性和重复性。因此，我们针对混合病毒样本(目的病毒和质控病毒)中的核酸扩增进行了优化，提高了检测效率和准确性，对控制诺如病毒感染，保障人民生命健康具有重要的理论和实践意义。
(三)发明内容
本发明目的是克服现有检测方法的不足，提供一种高效、快捷、同时检测诺如病毒GI、GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的多重RT-PCR检测试剂盒及方法，为环境检测、商品检验检疫、食品卫生等领域中大通量的样品的诺如病毒检测提供技术支持。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种多重RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)RNA提取试剂，以大肠杆菌噬菌体MS2为样品RNA提取质控，即向待检测样品中加入大肠杆菌噬菌体MS2(优选加入量1.3×105PFU/mL≈1.27×108Copies/mL)，提取含MS2和待测样品的混合病毒RNA作为PCR反应模板；
(2)PCR反应体系：含诺如病毒GI型(简称NoV GI)、诺如病毒GII型(简称NoV GII)和大肠杆菌噬菌体MS2(简称MS2)各自的正向引物、反向引物和特异性探针；
本发明以诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的RNA多聚酶高保守区为靶序列设计诺如病毒GI型(SEQ ID NO.10)、诺如病毒GII型(SEQ ID NO.11)和大肠杆菌噬菌体MS2(SEQ ID NO.12)正向、反向引物和特异性探针，其碱基序列分别为：
诺如病毒GI型引物、特异性探针：
正向引物GI-F：5’-GGCAGATGATGAGCGTGAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物GI-R：5’-AGAAACCCCATCCAGACCCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)；
特异性探针Probe-P:5-HEX-CACTTTATGGAGCAGAGTGAC-BHQ-3’(SEQ ID NO.3)；
诺如病毒GII型引物、特异性探针：
正向引物GII-F：5’-CTAGAAACGCTCCAGGTGAAAT-3’(SEQ ID NO.4)；
反向引物GII-R：5’-TCTGGCCAAATGGGAAAGGTAA-3’(SEQ ID NO.5)；
特异性探针Probe-P:5’-FAM-CCCTTGGGCCCTGATTTGA-TAMRAR-3’(SEQ ID NO.6)；
大肠杆菌噬菌体MS2引物和特异性探针：
正向引物MS-F：5’-ATTCCGACTGCGAGCTTATTGTT-3’(SEQ ID NO.7)；
反向引物MS-R：5’-GGAGTTTGCTGCGATTGCTGAGG-3’(SEQ ID NO.8)；
特异性探针Probe-P:5’-ROX-AATCGGGTTTCCATCTTTTAG-BHQ2-3’(SEQ ID NO.9)；
(3)PCR质控反应体系：以含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GI(2.5×108Copies/mL,7545bp)、含SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GII(1.5×108Copies/mL,7521bp)及含SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的质粒pcDA-MS2(1.3×108Copies/mL,6556bp)的混合质粒作为PCR质控反应模板：
诺如病毒GI型引物对应的序列：Norovirus GI(NCBI accession numbersMG599789.1)(SEQ ID NO.10)：
5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgac aaagtttgggtctggatggggtttct-3’(3191bp-3294bp)；
诺如病毒GII型引物对应的序列：Norovirus GII(NCBI accession numbersMF140656.1)(SEQ ID NO.11)：
5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’(5271bp-5350bp)；
大肠杆菌噬菌体MS2引物对应的序列：Enterobacteria phage MS2(ATCC15597-B1)(GenBank accession numbers NC 001417)(SEQ ID NO.12)：
5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagca aactcc-3’(1630bp-1715bp)。
进一步，所述的多重RT-PCR检测试剂盒，PCR反应体系还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶和DEPC水。
再进一步，本发明所述PCR反应体系组成为：2×buffer 12.5μL，逆转录酶和DNA聚合酶各0.5μL，20μmol/L正向引物各0.1μL，20μmol/L反向引物各0.1μL，20μmol/L特异性探针各0.05μL，模板5μL，DEPC水补齐至25μL；所述模板为含有待测样品和MS2混合病毒RNA。所述PCR质控反应体系组成同PCR反应体系，不同在于质控体系以含目的基因的混合质粒pcDA-NoV-GI、pcDA-NoV-GII及pcDA-MS2为模板。
本发明还提供一种所述多重RT-PCR检测试剂盒在同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2中的应用，所述应用方法如下：
(1)RNA提取：向待测样本中加入大肠杆菌噬菌体MS2作为质控，提取混合病毒RNA；所述大肠杆菌噬菌体MS2加入量为1.3×105PFU/mL≈1.27×108Copies/mL；
(2)PCR扩增：以步骤(1)混合病毒RNA为模板，加入PCR反应体系中(反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶和DEPC水)进行PCR扩增；PCR扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号；同样条件下，以混合质粒作为PCR质控反应模板进行PCR扩增，以校准混合病毒RNA的扩增效率；
(4)步骤(2)中HEX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GI型；若FAM荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GII型；若ROX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体MS2，Ct值小于等于30时，测定结果为有效阳性，Ct值在30到40之间，可重复2次，如扩增曲线有明显对数增长期，测定结果为有效阳性，其它情况视为检测结果阴性。
本发明为了进一步验证阳性结果，取步骤(2)Ct值小于等于30的有效阳性扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以溴化银为染料，以100bp标准分子量对照，如果104bp出现扩增条带，则样品存在诺如病毒GI型；如果80bp出现扩增条带，则样品存在诺如病毒GII型；如果86bp出现扩增条带，则样品存在大肠杆菌噬菌体MS2。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种高效、快捷、同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒与现有技术相比，检测信号干扰性小，灵敏度高，可达到101个拷贝数，为环境检测、商品检验检疫、食品卫生等领域中大通量的样品的诺如病毒检测提供技术支持。
(四)附图说明
图1NoV GI、GII和MS2阳性病毒样本RT-qPCR荧光检测结果(A)和电泳图(B)。
图2诺如病毒(NoV GI和GII)浓度与Ct值的标准曲线。A:诺如病毒GII型；B:诺如病毒GI型；C:大肠杆菌噬菌体MS2。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：多重RT-PCR检测试剂盒
1、试剂盒组成
(1)RAN提取试剂：以大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC15597-B1)为待测样本RNA提取的质控病毒，即向待检测样品中加入大肠杆菌噬菌体MS2(优选加入量1.3×105PFU/mL≈1.27×108Copies/mL)，提取含MS2和待测样品的混合病毒RNA作为PCR反应模板；
(2)PCR反应体系组成：2×buffer 12.5μL，逆转录酶和DNA聚合酶各0.5μL，引物(20μmol/L NoV GI、NoV GII、MS2)各0.1μL，探针(20μmol/L NoV GI、NoV GII、MS2)各0.05μL，模板5μL，DEPC水补齐至25μL；所述模板含待测样品和质控病毒的混合病毒RNA。
本发明以诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的RNA多聚酶高保守区为靶序列(SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)设计诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2正向、方向引物和特异性探针，其碱基序列分别为：
诺如病毒GI型引物、特异性探针：
正向引物GI-F：5’-GGCAGATGATGAGCGTGAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物GI-R：5’-AGAAACCCCATCCAGACCCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)；
特异性探针Probe-P:5’-HEX-CACTTTATGGAGCAGAGTGAC-BHQ-3’(SEQ ID NO.3)；
诺如病毒GII型引物、特异性探针：
正向引物GII-F：5’-CTAGAAACGCTCCAGGTGAAAT-3’(SEQ ID NO.4)；
反向引物GII-R：5’-TCTGGCCAAATGGGAAAGGTAA-3’(SEQ ID NO.5)；
特异性探针Probe-P:5’-FAM-CCCTTGGGCCCTGATTTGA-TAMRAR-3’(SEQ ID NO.6)；
大肠杆菌噬菌体MS2引物、特异性探针：
正向引物MS-F：5’-ATTCCGACTGCGAGCTTATTGTT-3’(SEQ ID NO.7)；
反向引物MS-R：5’-GGAGTTTGCTGCGATTGCTGAGG-3’(SEQ ID NO.8)；
特异性探针Probe-P:5’-ROX-AATCGGGTTTCCATCTTTTAG-BHQ2-3’(SEQ ID NO.9)。
(3)PCR质控体系组成：2×buffer 12.5μL，逆转录酶和DNA聚合酶各0.5μL，引物(20μmol/L NoV GI、NoV GII、MS2)各0.1μL，探针(20μmol/L NoV GI、NoV GII、MS2)各0.05μL，质控模板5μL，DEPC水补齐至25μL；所述质控模板是以含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GI、含SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GII及含SEQ IDNO.12所示核苷酸序列的质粒pcDA-MS2组成的混合质粒；
所述诺如病毒GI型的RNA多聚酶高保守区为靶序列：Norovirus GI(NCBIaccession numbers MG599789.1)
5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgac aaagtttgggtctggatggggtttct-3’(3191bp-3294bp)(SEQ ID NO.10)；
诺如病毒GII型的RNA多聚酶高保守区为靶序列：Norovirus GII(NCBI accessionnumbers MF140656.1)
5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’(5271bp-5350bp)(SEQ ID NO.11)；
大肠杆菌噬菌体MS2的RNA多聚酶高保守区为靶序列：Enterobacteria phage MS2(ATCC15597-B1)(GenBank accession numbers NC 001417)
5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagca aactcc-3’(1630bp-1715bp)(SEQ ID NO.12)。
2、试剂盒的使用方法：
(1)提取病毒核酸：向待测样品中加入1.3×103PFU/mL的大肠杆菌噬菌体MS2(ATCC15597-B1)，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书提取待测样品与MS2的混合RNA；
(2)PCR扩增：按上述步骤1的PCR反应体系(2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，20μmol/L引物(MS2，NoV GI和NoV GII)各0.1μL，20μmol/L探针(MS2，NoV GI和NoVGII)各0.05μL)配置反应液，并加入含有5μL待测样品与MS2的混合RNA的反应管中，DEPC水补齐至25μL，逆转录和扩增反应所需的试剂一次性加入反应管中，两步反应在一个反应管内完成，整个PCR扩增过程无需开盖。PCR扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号。
(3)PCR扩增质控：以步骤1(3)含有目的片段的质粒pcDA-NoV-GI(7545bp)、pcDA-NoV-GII(7521bp)和pcDA-MS2(6556bp)为混合质粒为质控模板，按步骤1(3)质控体系，与待测病毒样本参与同一批次PCR扩增反应，作为PCR扩增反应质控，PCR反应条件与待测病毒相同，以校准混合待测病毒RNA的扩增效率。
3、特异性判断：步骤(2)中HEX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GI型；若FAM荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GII型；若ROX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体MS2。取步骤2中(2)和(3)中Ct值小于等于30的有效阳性扩增产物5ul，制备2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以溴化银为染料，凝胶成像分析系统观察结果，与100bp标准分子量对照，如果出现104bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在诺如病毒GI型；如果出现80bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在诺如病毒GII型；如果出现86bp扩增条带，切胶回收测序后可证明该样品存在MS2。
4、灵敏性判断：以含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GI(7545bp)、含SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GII(7521bp)及含SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的质粒pcDA-MS2(6556bp)的混合质粒为质控模板，梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6后，各个浓度取5μL模板，按照步骤(2)质控体系和扩增条件进行多重RT-PCR扩增，以Ct值为横坐标，以拷贝数(Copies)为纵坐标，分别获得诺如病毒GI型标准曲线(图2中B)、诺如病毒GII型标准曲线(图2中A)和大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线(图2中C)；扩增结束后所检测到最低稀释度病毒核酸的Ct值定位最高灵敏度值。本发明中将Ct值小于等于30时，测定结果定义为有效阳性。Ct值在30到40之间，可重复2次，如扩增曲线有明显对数增长期，测定结果为有效阳性，其它情况视为检测结果阴性。
实施例2、果蔬中诺如病毒的快速检测和定量方法
在浓缩蓝莓样品中病毒之前，先对病毒浓缩容器等进行消毒处理(高温高压灭菌处理)。
1、生菜和蓝莓样品中诺如病毒的洗脱
NoV GI和NoV GII病毒液的制备：分别取诺如病毒NoV GI和NoV GII腹泻病人粪便标本0.5g，加入PBS缓冲液1mL后涡旋振荡器上混匀5min，之后于8000g离心10min，去沉淀，将上清液经0.45μm膜过滤，收集滤液并采用RT-qPCR方法(同实施例1PCR扩增)检测滤液中诺如病毒含量(Ct值)，并根据实施例1诺如病毒GI型标准曲线(图2中B)、诺如病毒GII型标准曲线(图2中A)，得到诺如病毒NoV GI浓度为1.6×105Copies/mL；NoV GI浓度为3.5×105Copies/mL。
新鲜生菜(Lettuces)和蓝莓(Blueberries)各一份，每份10g分装。分别取10μL质控病毒MS2(130PFU)、10μL诺如病毒NoV GI(1600Copies)和10μL诺如病毒NoV GII(3500Copies)混合液，点状涂布于生菜和蓝莓表面(0.5μL每点)，置于二级生物安全柜中30-60min。待室温下风干后，装入50ml离心管中，加入15ml洗脱液(Tris12.11g，甘氨酸3.75g，牛肉浸膏20g，ddH2O 1L，pH＝9.5)，加入果胶酶(30000U/g，0.02g/mL)和纤维素酶(10000U/g，0.01g/mL)各150μl，室温下漩涡振荡30min，10000rpm离心15min，上清转移至另一个50ml离心管中。
2、利用负电荷膜浓缩洗脱液中诺如病毒
用1mol/L的盐酸调节步骤1上清使pH＝3.5，将调整后的上清移入超滤杯中，采用真空抽滤使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜，再次往超滤杯中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)缓冲液使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜(该步骤可达到去除部分果蔬中RNA抑制剂的目的)，取出滤膜，剪碎后，放入1.5ml的EP管中，待下一步核酸提取。
3、RNA提取
采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取负电荷滤膜上的病毒RNA，首先向装有滤膜碎片的EP管中加入560μl AVL裂解液，混匀后放入振荡器中剧烈振荡30min，8000g离心后取上清至另一个EP管中，余下步骤按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书进行RNA的提取，提取完毕的混合(MS2、NoV GI和GII)病毒RNA于－20℃保存备用。
4、一步法荧光定量PCR
(1)PCR扩增反应：以步骤3提取的含有MS2、NoV GI和NoV GII混合病毒RNA为共同模板5μL，加入实施例1试剂盒中PCR反应体系(2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，20μmol/L引物(MS2，NoV GI和NoV GII)各0.1μL，20μmol/L探针(MS2，NoV GI和NoV GII)各0.05μL)，DEPC水补齐至25μL)中，在荧光定量PCR仪(ABI 7500Real Time，美国ABI)上进行RT-PCR，扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，56℃退火、延伸35s，39个循环，分别获得MS2(ROX荧光)、NoV GI(HEX荧光)和NoV GII(FAM荧光)荧光值。
(2)PCR质控反应：以实施例1质控体系进行相同条件的RT-PCR扩增，通过对质控模板和混合病毒RNA模板扩增效率(E)的比较，以校准混合病毒RNA的扩增效率，并将Ct值带入实施例1质控模板的标准曲线获得相应的浓度值，用于计算检测效率。以上实验重复三份。
表1诺如病毒(NoV GI和GII)和大肠杆菌噬菌体MS2特异性引物与探针
Figure BDA0001852198320000091
5、RT-qPCR对果蔬中诺如病毒GI和GII的定量(Copies/mL)分析
每份果蔬样品检测时均包含1份检测样本(加入已知浓度的MS2(130PFU)、NoV GI(1600copies)和NoV GII(3500copies))、1份阴性对照(不加病毒的果蔬样品)、1份空白对照(实时荧光RT-qPCR体系中以ddH2O代替RNA)。三种荧光信号Ct值≤30则判定为检出MS2、NoV GI和NoV GII，以上实验重复三份。
检出限的计算：分别取1份已知浓度的(130PFU)MS2、(1600Copies)NoV GI和(3500Copies)NoV GII病毒液，按1:10进行梯度系列稀释(100、10-1、10-2、10-3、……)后，将各稀释度的病毒混合液分别污染果蔬，再洗脱回收病毒，并提取病毒RNA，以上每个稀释度样品重复六份，每份按照步骤3方法提取RNA和步骤4方法检测病毒浓度，以每个稀释度中的六份检测样品首次出现全为阴性时，上一个稀释度所对应的病毒含量为本方法在果蔬样本中的检出限。
6、诺如病毒检测效率计算
相关公式如下：
(1)
Figure BDA0001852198320000101
(2)
Figure BDA0001852198320000102
(3)E＝10[-1/slope]-1E为扩增效率；Slope为曲线斜率
7、结论
根据RT-qPCR的结果，生菜和蓝莓样品中诺如病毒的提取率和检出限的计算结果如表2所示，使用该方法检测生菜样品中诺如病毒NoV GI的检测率和检出限分别为4.72±2.56％和160Copies/10g；NoV GII检测率和检出限分别为13.46±3.53％和350Copies/10g；MS2的检测率和检出限分别为10.46±5.65％和13PFU/10g。检测蓝莓样品中诺如病毒NoV GI的检测率和检出限分别为8.22±1.62％和160Copies/10g；NoV GII检测率和检出限分别为18.43±6.65％和350Copies/10g；MS2的检测率和检出限分别为21.68±7.83％和13PFU/g。与传统方法相比，该方法该试剂盒检测信号干扰性小，灵敏度高，可达到101个拷贝数，具有显著的优越性。
实施例3：贝类中诺如病毒的快速检测和定量方法
在浓缩贝类样品中病毒之前，先对病毒浓缩容器等进行消毒处理(高温高压灭菌处理)。
1、贝类样品中的诺如病毒的洗脱
牡蛎(Oyster)和文蛤(Clam)去壳后每份10g分装。分别将10μL质控病毒MS2(130PFU)、10μL诺如病毒NoV GI(1600Copies)和10μL NoV GII(3500Copies)混合液(诺如病毒NoV GI和GII过滤液采用案例2的方法制备)，点状涂布于牡蛎和文蛤表面(0.5μL每点)，置于二级生物安全柜中30-60min。待室温风干后，剪碎，装入50ml离心管中，加入30ml洗脱液(甘氨酸3.75g，NaCl 8.775g，ddH2O 1L，pH＝9.5)，调节洗脱液pH值在9.2-9.5之间，室温下漩涡振荡30min，10000rpm离心15min，上清转移至另一个50mL离心管中，如发现油脂状物质漂浮于上清，可按特定比例(上清：混合液＝3:1，v/v)加入氯仿-正丁醇(1:1v/v)混合液的，振荡离心后取水相备用。
2、利用负电荷膜浓缩洗脱液中诺如病毒
用1mol/L的盐酸调节步骤1上清使pH＝3.5，将调整后的上清移入超滤杯中，采用真空抽滤使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜，再次往过滤漏斗中加入500mL PBS(0.1mol/L，pH＝3.5)缓冲液使之通过孔径为0.45μm负电荷滤膜(该步骤可达到去除部分食品中RNA抑制剂的目的)，取出滤膜，剪碎后，放入1.5mL的EP管中，待下一步核酸提取。
3.RNA提取
采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取负电荷滤膜上的诺如病毒RNA，首先向装有滤膜碎片的EP管中加入560μL AVL裂解液，混匀后放入振荡器中剧烈振荡10min，8000g离心30s后取上清至另一个EP管中，余下步骤按照其说明书进行RNA的提取，提取完毕的待测混合病毒RNA于－20℃保存备用。
4.一步法荧光定量PCR
(1)PCR扩增反应：以步骤3提取的含有MS2、NoV GI和NoV GII混合病毒RNA为共同模板5μL，加入实施例1试剂盒中PCR反应体系中(2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，20μmol/L引物(MS2，NoV GI和NoV GII)各0.1μL，20μmol/L探针(MS2，NoV GI和NoVGII)各0.05μL)，DEPC水补齐至25μL)，在荧光定量PCR仪(ABI 7500Real Time，美国ABI)上进行RT-PCR扩增反应，扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，56℃退火、延伸35s，39个循环，对结果荧光检测。
(2)PCR质控扩增：以实施例1质控体系进行相同条件的RT-PCR扩增。以上实验重复三份。
检出限的计算：分别取1份已知浓度的(130PFU)MS2、(1600Copies)NoV GI和(3500Copies)NoV GII病毒液，按1:10进行梯度系列稀释(100、10-1、10-2、10-3)后，将各稀释度的病毒混合液分别污染贝类，再洗脱回收病毒，并提取病毒RNA，以上每个稀释度样品重复六份，每份按照步骤3方法提取RNA和步骤4方法检测病毒浓度，以每个稀释度中的六份检测样品首次出现全为阴性时，上一个稀释度所对应的病毒含量为本方法在贝类样本中的检出限。
5.诺如病毒检测效率的计算，同实施例2。
6.结论
根据RT-qPCR的结果，牡蛎和文蛤样品中诺如病毒的提取率和检出限的计算结果如表2所示，使用该方法检测牡蛎样品中诺如病毒NoV GI的检测率和检出限分别为2.57±1.68％和1600Copies/10g；NoV GII检测率和检出限分别为1.32±0.53％和3500Copies/10g；MS2的检测率和检出限分别为4.56±1.42％和130PFU/10g。文蛤样品中诺如病毒NoVGI的检测率和检出限分别为3.43±1.94％和1600Copies/10g；NoV GII检测率和检出限分别为2.84±1.32％和3500Copies/10g；MS2的检测率和检出限分别为3.83±1.51％和130PFU/10g。如表2所示，与传统方法(SN/T 2626-2010和SN/T 4055-2014)中分别对MS2、NoV GI和NoV GII病毒进行单一检测比，该方法可同时检测以上三种病毒，在检测效率和时间上显著优于传统方法。
表2粪便标本及三种污染食品中诺如病毒(NoV GI和GII)和MS2的回收率与检测限
Figure BDA0001852198320000121
a检测含有不同浓度诺如病毒和MS2病毒的食品样本的实验重复5次
b诺如病毒采用Copies/10g为计量单位
c MS2病毒采用PFU/10g为计量单位
d.括号中的数值代表回收率％
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其构架形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出简单的推演活替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
序列表
<110> 浙江省疾病预防控制中心
<120> 一种多重RT-PCR检测试剂盒及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ggcagatgat gagcgtgagg 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
agaaacccca tccagaccca aact 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
cactttatgg agcagagtga c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ctagaaacgc tccaggtgaa at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tctggccaaa tgggaaaggt aa 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
cccttgggcc ctgatttga 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
attccgactg cgagcttatt gtt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
ggagtttgct gcgattgctg agg 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
aatcgggttt ccatctttta g 21
<210> 10
<211> 104
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
ggcagatgat gagcgtgagg tggattacaa tgagaagatc agttttgagg cgccccccac 60
tttatggagc agagtgacaa agtttgggtc tggatggggt ttct 104
<210> 11
<211> 80
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
ctagaaacgc tccaggtgaa atactatgga gcgcgccctt gggccctgat ttgaatcctt 60
acctttccca tttggccaga 80
<210> 12
<211> 86
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
attccgactg cgagcttatt gttaaggcaa tgcaaggtct cctaaaagat ggaaacccga 60
ttccctcagc aatcgcagca aactcc 86

Claims (5)

1.一种多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
(1)RNA提取试剂，以大肠杆菌噬菌体MS2为RNA提取质控；
(2)PCR反应体系：含诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2各自的正向引物、反向引物和特异性探针；
诺如病毒GI型引物、特异性探针：
正向引物GI-F：5’-GGCAGATGATGAGCGTGAGG-3’
反向引物GI-R：5’-AGAAACCCCATCCAGACCCAAACT-3’
特异性探针Probe-P:5’-HEX-CACTTTATGGAGCAGAGTGAC-BHQ-3’；
诺如病毒GII型引物、特异性探针：
正向引物GII-F：5’-CTAGAAACGCTCCAGGTGAAAT-3’
反向引物GII-R：5’-TCTGGCCAAATGGGAAAGGTAA-3’
特异性探针Probe-P:5’-FAM-CCCTTGGGCCCTGATTTGA-TAMRAR-3’；
大肠杆菌噬菌体MS2引物、特异性探针：
正向引物MS-F：5’-ATTCCGACTGCGAGCTTATTGTT-3’
反向引物MS-R：5’-GGAGTTTGCTGCGATTGCTGAGG-3’
特异性探针Probe-P:5’-ROX-AATCGGGTTTCCATCTTTTAG-BHQ2-3’；
(3)PCR质控反应体系：以含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GI、含SEQID NO.11所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GII及含SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的质粒pcDA-MS2的混合质粒作为PCR质控反应模板；
SEQ ID NO.10所示核苷酸序列：
5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgacaaagtttgggtctggatggggtttct-3’；
SEQ ID NO.11所示核苷酸序列：
5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’；
SEQ ID NO.12所示核苷酸序列：
5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactcc-3’。
2.如权利要求1所述的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶和DEPC水。
3.如权利要求1所述的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于PCR反应体系为2×buffer12.5μL，逆转录酶和DNA聚合酶各0.5μL，20μmol/L正向引物0.3μL，20μmol/L反向引物0.3μL，20μmol/L特异性探针0.15μL，模板5μL，DEPC水补齐至25μL。
4.一种权利要求1所述多重RT-PCR检测试剂盒在制备同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法如下：
(1)RNA提取：向待测样本中加入大肠杆菌噬菌体MS2，提取混合病毒RNA；所述大肠杆菌噬菌体MS2加入量为1.3×105PFU/mL；
(2)PCR扩增反应：以步骤(1)混合病毒RNA为模板，加入反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶和DEPC水构成PCR反应体系，进行PCR扩增；PCR扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号；同样条件下，以混合质粒作为PCR质控反应模板进行PCR扩增，以校准混合病毒RNA的扩增效率；
(3)步骤(2)中HEX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GI型；若FAM荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GII型；若ROX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体MS2。
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