CN109868332A - 一种检测海洋食品中gⅱ型诺如病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法。所述方法包括如下步骤：S1、取海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示。本申请方法中使用的引物组合具有特异性好、灵敏度高、覆盖度高的优点，在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。

Description

一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NoV)又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses)，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒，具有高度传染性和快速传播能力。诺如病毒为单股正链RNA病毒，直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称，属于杯状病毒科。诺如病毒基因组全长约7.7kb，分为三个开放阅读框(ORFs)，两端是5’和3’非翻译区(UTR)，其中，ORF1编码6个非结构蛋白，主要包括核苷酸水解酶、3C样蛋白酶和RNA依赖的RNA聚合酶；ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(VP1)和次要结构蛋白(VP2)。VP1包含两个区域，分别为外壳区(S区)和突出区(P区)，两者通过灵活的铰链相连，S区由VP1的N端的225个氨基酸残基构成，形成光滑的病毒衣壳，围绕病毒RNA，P区由226位氨基酸到羧基末端构成，从衣壳向外二聚化在衣壳表面上形成拱状突起结构，分为亚区P1(拱干，由226-278位氨基酸残基以及406-520位氨基酸残基构成)和亚区P2(拱顶，由279-405位氨基酸残基构成)，P2是最可变区，包含碳水化合物结合序列和血型组织抗原(HBGAs)结合序列。VP2位于病毒粒子内部，被认为参与衣壳的聚集。

诺如病毒按照VP1蛋白编码序列的不同，分GⅠ～GⅦ七种基因型，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ是目前已知可以感染人的基因型，而GⅢ、GⅤ分别感染牛和鼠。我国目前最常见的诺如病毒为GⅡ、GⅠ型。目前，GⅠ型含有至少9个基因亚型，GⅡ型含有至少21个基因亚型。GⅡ.4亚型及其突变株是目前全球广泛流行的优势毒株，但2014年冬季以来，GⅡ.17变异株所致的暴发疫情大幅增加。

诺如病毒传染性强，感染剂量可以低至10—100个病毒粒子，且不同基因型之间的基因组重组频繁发生，使诺如病毒具有相当高的变异性，开发针对所有变异株或基因亚型的检测方法很难，常常导致假阴性的发生。诺如病毒的传播途径主要有人传人(接触)、食源性传播和水源性传播。诺如病毒主要来源于海洋产品，通常栖息于海洋生物如牡蛎等贝类中，人若生食这些受污染的海洋生物会被感染。因此，对海洋食品进行诺如病毒检测十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，该方法中使用的引物组合具有特异性好、灵敏度高、覆盖度高的优点，在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。

一方面，本发明提供了一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，包括如下步骤：

S1、取海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；

S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；

S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；

所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ IDNo.2所示。

在一种优选的实施方式中，为了进行如荧光定量PCR或数字PCR等需要通过检测信号大小的方法检测靶基因数量时，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；

优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列。

在上述方法中，优选的，所述探针为Taqman探针；

更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。

在一种优选的实施方式中，所述PCR为实时荧光PCR，所述实时荧光PCR的反应体系包含：qPCR缓冲液、dNTPs、MgSO₄、二甲基亚砜、所述引物对的上游引物、所述引物对的下游引物、所述探针、DNA聚合酶、模板DNA和水；

所述实时荧光PCR的反应体系中，所述MgSO₄的终浓度为1mmol/L，二甲基亚砜的终浓度为8％、所述引物对的上游引物的终浓度为2μmol/L、所述引物对的下游引物的终浓度为2μmol/L、所述探针的终浓度为0.2μmol/L、DNA聚合酶的终浓度为0.5U/μL。

在一种优选的实施方式中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预热5min；95℃变性25s，60℃退火延伸50s，42个循环。

在一种优选的实施方式中，待测样品的Ct值大于或等于42时，判定为GⅡ型诺如病毒阴性；待测样品的Ct值小于或等于37时，判定为GⅡ型诺如病毒阳性；待测样品的Ct值大于37且小于42时，应重新检测。

另一方面，本发明还提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示，

优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；

更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测GⅡ型诺如病毒的PCR试剂盒，所述试剂盒包括：检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ IDNo.2所示；优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；

优选的，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、二甲基亚砜、和DNA聚合酶。

本发明保护所述引物组合或所述试剂盒在检测GⅡ型诺如病毒中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明方法使用实时荧光PCR方法检测GⅡ型诺如病毒，具有特异性好，与GⅡ型诺如病毒之外的病毒无交叉反应，假阳性和假阴性低；灵敏度高，最低检测限可达0.005pg/μL；覆盖度高，可以检测目前所有已知亚型的GⅡ型诺如病毒毒株。本发明在检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒方面具有广泛应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的商业化病毒RNA提取试剂盒为天根生化科技公司的TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒。

下述实施例中实时荧光PCR使用Bio-rad公司PCR仪进行。

实施例1、实时荧光PCR引物设计

从NCBI检索获取所有GⅡ型诺如病毒VP1基因序列信息，经序列分析和比对，找到GⅡ型诺如病毒所具有的高度保守区域，设计8对引物及其探针，并进行BLAST序列比对，筛选出特异性较好的4对引物及其探针组合，然后进行序列的生物合成，其中，在每条探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1，各组合序列如表1所示。

表1、引物及其探针组合的序列

实施例2、实时荧光PCR检测GⅡ型诺如病毒的特异性

使用实施例1中表1所示的4对引物及其探针组合，分别进行实时荧光PCR检测被如下不同病毒感染的牡蛎样品：轮状病毒、星状病毒、甲肝病毒，不同亚型GI.1～9的GI型诺如病毒，不同亚型GⅡ.1～21的GⅡ型诺如病毒，GⅢ～Ⅶ型诺如病毒，每个样品设三次重复，结果：

空白对照和阴性对照使用不同引物及其探针组合的检测结果均为阴性；

表1中的引物及其探针组合1和2对所有不同亚型的GⅡ型诺如病毒毒株感染样品的检测结果为阳性，而其它样品均为阴性；

表1中的引物及其探针组合3对所有不同亚型的GⅡ型诺如病毒感染样品的检测结果为阳性，对GⅢ型诺如病毒感染样品的检测结果也为阳性，对其余样品的检测结果均为阴性；即引物及其探针组合3会检测出假阳性；

表1中的引物及其探针组合4对亚型GⅡ.19的GⅡ型诺如病毒感染样品的检测结果为阴性，对其余亚型的GⅡ型诺如病毒感染样品的检测结果为阳性，对其余样品的检测结果均为阴性；即引物及其探针组合4会检测出假阴性；

上述结果表明，表1中的引物及其探针组合1和2的特异性很好，与GⅡ型诺如病毒之外的病毒无交叉反应，可以特异性检测所有不同亚型的GⅡ型诺如病毒。

上述实时荧光PCR检测的方法如下：

1、模板的制备

无菌条件下，取贝类(以牡蛎为例)软体组织中的消化腺，进行匀浆处理后，按每克消化腺加入1.0mL蛋白酶K溶液，混匀；37℃300rpm振荡1h，再60℃温育15min；室温3000rpm离心5min，取上清，使用商业化病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取。然后将RNA进行反转录获得cDNA溶液，用于实时荧光PCR检测。

2、实时荧光PCR检测

实时荧光PCR检测的反应体系(已经过优化)如表2所示。

表2.实时荧光PCR的反应体系

实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预热5min；95℃变性25s，60℃退火延伸50s，42个循环；扩增过程中在60℃时收集荧光信号，选择收集荧光信号通道为FAM。

设置ddH₂O做空白对照，未被任何病毒感染的贝类(以牡蛎为例)为阴性对照，含有GⅡ型诺如病毒VP1基因序列的质粒溶液(10³copies/μL)为阳性对照，每个样品每种反应设三个重复。

结果判定：待测样品的Ct值大于等于42时，判定为GⅡ型诺如病毒阴性；待测样品的Ct值小于等于37时，判定为GⅡ型诺如病毒阳性；待测样品的Ct值大于37、小于42时，应重新检测。

实施例3、实时荧光PCR检测GⅡ型诺如病毒的灵敏度

将实施例2中鉴定为GⅡ型诺如病毒阳性的样品的DNA溶液，测定OD260/OD280的值，并计算DNA浓度，使用RNase-free Water稀释至一定浓度，然后再梯度稀释成浓度分别为1pg/μL、0.1pg/μL、0.01pg/μL、0.005pg/μL、0.001pg/μL的不同标准样品。

以上述不同标准样品为模板，分别使用表1中的引物及其探针组合1和2，按照实施例2中所述实时荧光PCR检测中步骤2的方法进行检测。

结果：表1中的引物及其探针组合1在标准样品浓度为0.005pg/μL及以上时，检测结果为阳性，标准样品浓度为0.001pg/μL时，检测结果为阴性；

表1中的引物及其探针组合2在标准样品浓度为0.1pg/μL及以上时，检测结果为阳性，标准样品浓度为0.01pg/μL、0.005pg/μL和0.001pg/μL时，检测结果为阴性。

以上结果表明，表1中的引物及其探针组合1的灵敏度最高，最低检测限为0.005pg/μL。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东时进检测服务有限公司

<120> 一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法

<130> QH-CNP190289

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccaccagggg cttgtacaaa 20

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<212> DNA

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acaargaggt tatggctttg gag 23

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cagccaacct cgtcccag 18

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<400> 9

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ctctccacca ggggcttgta 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgttgtcggt gccgccattg cgg 23

Claims (9)

1.一种检测海洋食品中GⅡ型诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取待测海洋食品作为待测样品，提取病毒RNA；

S2、以所述RNA或所述RNA的cDNA为模板，使用检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合进行PCR检测；

S3、对所述PCR的产物进行检测，判断待测海洋食品中是否污染了GⅡ型诺如病毒；

所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ IDNo.2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；

优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述探针为Taqman探针；

优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR为实时荧光PCR，所述实时荧光PCR的反应体系包含：qPCR缓冲液、dNTPs、MgSO₄、二甲基亚砜、所述引物对的上游引物、所述引物对的下游引物、所述探针、DNA聚合酶、模板DNA和水；

所述实时荧光PCR的反应体系中，所述MgSO₄的终浓度为1mmol/L，二甲基亚砜的终浓度为8％、所述引物对的上游引物的终浓度为2μmol/L、所述引物对的下游引物的终浓度为2μmol/L、所述探针的终浓度为0.2μmol/L、DNA聚合酶的终浓度为0.5U/μL。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预热5min；95℃变性25s，60℃退火延伸50s，42个循环。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：待测样品的Ct值大于或等于42时，判定为GⅡ型诺如病毒阴性；待测样品的Ct值小于或等于37时，判定为GⅡ型诺如病毒阳性；待测样品的Ct值大于37且小于42时，应重新检测。

7.一种检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQID No.2所示，

优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；

更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列。

8.一种用于检测GⅡ型诺如病毒的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：检测GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合，包括特异性扩增GⅡ型诺如病毒VP1基因的引物对，所述引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.2所示；优选的，所述GⅡ型诺如病毒的特异性PCR引物组合还包括特异检测所述PCR的产物的探针；更优选的，所述特异检测所述PCR的产物的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；

优选的，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、二甲基亚砜、和DNA聚合酶。

9.权利要求7所述引物组合或权利要求8所述试剂盒在检测GⅡ型诺如病毒中的应用。