CN103525947A - 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法 - Google Patents

一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103525947A
CN103525947A CN201310404375.XA CN201310404375A CN103525947A CN 103525947 A CN103525947 A CN 103525947A CN 201310404375 A CN201310404375 A CN 201310404375A CN 103525947 A CN103525947 A CN 103525947A
Authority
CN
China
Prior art keywords
norovirus
gii
primer
nasba
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310404375.XA
Other languages
English (en)
Inventor
周德庆
赵峰
马丽萍
苏来金
刘慧�
姚琳
孟松松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN201310404375.XA priority Critical patent/CN103525947A/zh
Publication of CN103525947A publication Critical patent/CN103525947A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种海洋食品中GII型诺如病毒NASBA检测引物、探针和检测方法，正向引物序列为SEQ ID NO1，反向引物序列为SEQ ID NO2，GII型诺如病毒检测用分子信标探针引物序列为SEQ ID NO3，检测方法，包括下列步骤：(一)GII诺如病毒标准cRNA的构建，(二)实时NASBA反应，(三)定性定量分析。本发明设计的引物和探针对GII诺如病毒的检测有高度的特异性，本发明的检测方法操作步骤简单，检测时间短，可以进行定性定量分析，特异性和灵敏度高。

Description

一种海洋食品中GII型诺如病毒NASBA检测引物、探针和检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术的快速检测海洋食品中GII型诺如病毒技术。 
背景技术
诺如病毒(Norovirus，NVs)是一种存在于海洋食品中，又可导致成人和儿童急性胃肠炎的病毒。诺如病毒基因组是单股正链RNA，全长7642nt，包括3个开放阅读框(open reading frames，ORFs)ORFs1、ORFs2和ORFs3。ORFs1编码保守的具有RNA多聚酶活性的非结构蛋白；ORFs2编码分子量约为56Kda的衣壳蛋白；ORFs3编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白，部分区域与衣壳蛋白发生交互作用，共同形成衣壳。人们感染诺如病毒主要是通过接触污染的是食物和水源等引发感染，尤其是海洋食品是诺如病毒的重要污染源。尽管诺如病毒引起的急性胃肠炎症状(呕吐、腹泻和腹部痉挛等)呈自限性，但若治疗不及时仍会导致死亡，因此，一种简便快速、特异性强的检测海洋食品中诺如病毒方法，有利于提高我国海洋食品质量安全水平，也有利于保障消费者的身体健康。 
诺如病毒根据其RNA多聚酶区(RDRP)和衣壳蛋白编码区核苷酸和氨基酸序列特征，可被分为5个遗传组(GGI～V)，其中GI、GII和GIV型可以感染人类。依据病毒部分衣壳及RNA聚合酶(RDRP)区序列的不同，GI又可分为14个基因型，GII分为17个基因型，GIV有1个基因型。20世纪90年代中期，研究人员确定GII型可以在世界范围内流行，直到现在，GII型NVs一直是世界范围内NVs最主要的感染性基因型。我国感染的诺如病毒也以GII为主，GGI及GGIV型较为罕见。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于NASBA检测技术对GII型诺如病毒基因组具有特异性检测作用的引物和分子信标探针，同时提供一种快速、方便、实用的利用上述引物和分子信标探针检测GII型诺如病毒的NASBA检测方法。 
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 
一种GII型诺如病毒检测引物，其特征在于： 
正向引物序列为SEQ ID NO1：5’-TGGAATTCCATCGCCCACT-3’； 
反向引物序列为SEQ ID NO2： 
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。 
一种GII型诺如病毒检测用分子信标探针，其特征在于，引物序列为SEQ ID NO3： 
5’-FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3’； 
所述分子信标探针在5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。 
一种定量检测GII型诺如病毒的方法，包括下列步骤： 
(一)GII诺如病毒标准cRNA的构建 
利用所述的引物，通过常规RT-PCR对GII诺如病毒扩增并优化，特异性产物片段大小为119bp；然后分别进行目的片段的克隆、质粒提取、酶切线性化、体外转录与cRNA准确性验证、CopyRNA浓度的测定与拷贝数计算；将GII诺如病毒RAN进行10倍梯度稀释后，分装作为标准品于-80℃保存； 
(二)实时NASBA反应 
(1)对步骤(一)中保存的标准品共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝；并提取待测样品中RNA，其中RNA的浓度为50-100ng/μL； 
反应体系如下： 
(2)将NASBA反应液用无RNA酶的二次水稀释，取18μL，然后加入5μL上述步骤(1)中的各种浓度梯度的标准品cRNA和待测样品RNA，65℃恒温5min；然后冷却至41℃； 
(3)将酶混合液用无RNA酶的二次水稀释，与步骤(2)中的反应液混匀后加入Roche专用石英毛细管中，并设置阴性对照；在Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)进行扩增，反应条件41℃，1min，然后收集荧光信号，共99个循环，反应时间为100min； 
其中，所述的NASBA反应液中NOR-FAM如上述。 
(三)定性定量分析 
根据9个梯度浓度的标准品cRNA的扩增结果制作标准曲线，将待测样品的扩增结果代入标准曲线，即可得到待测样品中的诺如病毒的含量。 
本发明设计的引物和探针对GII诺如病毒的检测有高度的特异性，与其他常见的致腹泻病毒轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒等均无交叉反应； 
本发明的检测方法操作步骤简单，检测时间短，可以进行定性定量分析，特异性和灵敏度高。 
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。 
图1是引物Nor-F/Nor-R的常规RT-PCR结果。其中：M：DL2000；1-2为阳性NVs扩增结果；4-5为克隆重组质粒扩增结果；7-9为构建的cRNA的扩增结果；3，6，10，11为阴性对照。 
图2是实时NASBA扩增曲线。 
图3为阈值的调整曲线。 
图4是实时NASBA标准曲线。 
图5是实时NASBA方法的特异性。其中：1：NVs；2-4：RV、HAV和阴性对照。 
图6是实时NASBA方法的灵敏度。 
具体实施方式
实施例1 
一种GII型诺如病毒检测引物， 
正向引物Nor-F序列为SEQ ID NO1：5’-TGGAATTCCATCGCCCACT-3’； 
反向引物Nor-R序列为SEQ ID NO2： 
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’； 
实施例2 
一种GII型诺如病毒检测用分子信标探针，引物序列为SEQ ID NO3： 
5’-FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3’. 
所述分子信标探针在5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。 
实施例3 
一种定量检测GII型诺如病毒的方法，包括下列步骤： 
(一)GII诺如病毒标准cRNA的构建 
利用所述的引物，通过常规RT-PCR对GII诺如病毒扩增并优化，特异性产物片段大小为119bp；然后分别进行目的片段的克隆、质粒提取、酶切线性化、体外转录与cRNA准确性验证、CopyRNA浓度的测定与拷贝数计算；将GII诺如病毒RAN进行10倍梯度稀释后，分装作为标准品于-80℃保存； 
(二)实时NASBA反应 
(1)对步骤(一)中保存的标准品共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝；并提取待测样品中RNA，其中RNA的浓度为50-100ng/μL； 
反应体系如下： 
(2)将NASBA反应液用无RNA酶的二次水稀释，取18μL，然后加入5μL上述步骤(1)中的各种浓度梯度的标准品cRNA和待测样品RNA，65℃恒温5min；然后冷却至41℃； 
(3)将酶混合液用无RNA酶的二次水稀释，与步骤(2)中的反应液混匀后加入Roche专用石英毛细管中，并设置阴性对照；在Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)进行扩增，反应条件41℃，1min，然后收集荧光信号，共99个循环，反应时间为100min； 
其中，所述的NASBA反应液中NOR-FAM如上述。 
(三)定性定量分析 
根据9个梯度浓度的标准品cRNA的扩增结果制作标准曲线，将待测样品的扩增结果代入标准曲线，即可得到待测样品中的诺如病毒的含量。 
1常规RT-PCR 
使用本发明所述的引物对GII型诺如病毒进行常规RT-PCR扩增并优化，特异性产物片 段大小为119bp。 
反转录反应采用25μL反应体系。反应体系包含10μL DEPC水，2.0μL5×AMV Buffer，6.0μL2.5mmol/L dNTP，0.5μL下游引物，1.25μL DMSO，0.25μL RNA酶抑制剂(Ribonclease Inhibitor，RI)，0.5U AMV反转录酶以及4.5μL RNA模板。在PCR仪中42℃反应60min，65℃，5min灭活酶，结束反应。 
PCR体系为2.5μL10×Buffer，2.0μL2.5mmol/L dNTP，0.5U Taq酶，0.3μmol/L引物，反应条件为：94℃预变性10min；94℃30s，53℃30s，72℃30s，40个循环，72℃终延伸7min。 
2标准cRNA的构建 
(1)目的片段的克隆 
RT-PCR产物电泳切取特异性DNA片段，用胶回收试剂盒回收后，与pGEM-T载体体外重组，反应体系为10μL，包括5.5μL二次水，1μLT4DNA Ligase10×buffer，0.5μL pGEM-T载体，2μL PCR纯化产物，1μLT4DNA连接酶，混匀后7℃过夜。 
大肠杆菌的转化：准备氨苄LB固体培养基，每板涂IPTG和X-gal各40μL，室温下放置2～3h。在1.5mL离心管中加入2μL连接产物，其中一管加入2μL H2O作为对照。将感受态细胞轻轻混匀，取30μL与连接产物轻轻混合，冰浴中放置20-30min。42℃，热击70～90s，然后立即冰浴2min。加入950μL LB液体培养液(不含ampicillin)，37℃振荡培养1h(150r/min)。)离心1min(8000～10000r/min)，沉淀用100μL的LB液体培养基回溶。取适量涂于培养基上，37℃倒置培养12～20h，至长出蓝白斑。无菌条件下，挑取白斑(单菌落)，于5mL液体LB培养基中(含50mg/mLAmp)37℃，150r/min震荡过夜。 
取1μL菌液做常规PCR初步鉴定，看是否有特异性目的片段产生。然后由上海博尚生物科技公司测序，测序结果使用DNAMan软件，比对克隆插入片段序列与阳性NoVs片段序列的同源性，证实目的基因正确克隆入pGEM-T载体。 
(2)质粒提取 
质粒提取采用TIANGEN质粒小提试剂盒进行。具体步骤如下： 
1)取3mL菌液，室温6000g离心4min。 
2)弃尽上清，然后向管中加入溶液I250μL(其中含RNase A)，上下震荡至菌体彻底悬浮起来。 
3)向离心管中加入溶液II250μL，缓慢颠倒离心管数次，此时裂解液变澄清。室温条件下静置2min左右。 
4)向离心管中加入溶液III350μL，轻轻上下颠倒离心管数次，此时出现白色絮状沉淀，室温12000rpm，离心10min。 
5)小心用枪吸取上清，将上清移至干净的吸收柱中。吸附柱放入1.5mL离心管中，室温12000rpm离心1min。 
6)弃滤过液，然后向吸附柱中加入Wash Buffer750μL，12000rpm离心1min。 
7)重复步骤6)。 
8)12000rpm离心2min，以彻底清除乙醇。 
9)将吸收柱放入干净的1.5mLEP管中，悬空向柱中加入50μL洗脱缓冲液，12000rpm离心2min。 
10)琼脂糖电泳检测质粒提取结果。 
(3)酶切线性化 
用Nde I酶切质粒，体系如下： 
Figure DEST_PATH_GSB0000118005750000061
线性化产物使用新配制的1×TAE电泳液电泳后，切取目的片段，用胶回收试剂盒回收线性DNA片段。 
胶回收步骤如下： 
1)用刀片将凝胶上目的片段条带切下，放入1.5mLEP管中。 
2)加入3倍胶体积的溶胶液。 
3)50℃水浴约10min，至凝胶完全溶解。 
4)冷却至室温后，将溶胶液转入收集管中，室温放置2min。 
5)12000rpm离心60s。 
6)加入600μL洗脱缓冲液，12000rpm离心60s。 
7)重复步骤6。 
8)直接向柱中加入30μL水，放入新的1.5ml离心管中，12000rpm离心2min。 
9)1％琼脂糖凝胶电泳检测胶回收产物。 
(4)体外转录与cRNA准确性验证 
使用T7RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System kit(Promega，USA)进行体外转录。反应体系为20μL，其中包括0.5μg线性DNA，2μL的10×buffer，1U的T7酶， 4U的RNase抑制剂，离心混匀后37℃过夜；加入无RNase的DNaseI酶，反应15min，出去残留的DNA，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀干燥后用无RNase二次水溶解转录的RNA。将体外转录的cRNA与NVs的RNA同时进行常规RT-PCR，看有无特异目的片段扩增，以验证cRNA合成序列的准确性。 
(5)Copy RNA浓度的测定与拷贝数计算 
使用NanoDrop ND-2000(Thermo)spectrophotometer对copy RNA进行浓度和纯度测定，根据以下公式计算copy RNA的拷贝数： 
待测样本浓度(ng/μL)=OD260×40×稀释倍数 
样本分子量=碱基数×324 
测定样本拷贝数(copies/μL)=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
10倍梯度稀释后，分装作为标准品于-80℃保存。 
3实时NASBA反应 
共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝。 
反应体系为20μL，优化体系后，加入5μLcRNA标准品，65℃恒温5min。 
将反应液与酶混合液混匀后加入Roche专用石英毛细管中，并设置阴性对照(模板以二次水代替)。在Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)进行扩增，反应条件41℃1min，然后收集荧光信号，共99个循环，反应时间为100min。 
反应体系如下： 
Figure DEST_PATH_GSB0000118005750000071
Figure DEST_PATH_GSB0000118005750000081
4.定性定量分析 
根据9个梯度浓度的标准品cRNA的扩增结果制作标准曲线，将待测样品的扩增结果代入标准曲线，即可得到待测样品中的诺如病毒的含量。 
5特异性与灵敏度实验 
为验证本方法的特异性，在相同条件下检测贝类品中常含的NVs、RV、HAV的RNA，观察反应特异性。提取NVs的RNA，10倍梯度稀释后测定反应的灵敏度。 
6结果与讨论 
6.1实时NSABA引物Nor-F/Nor-R的常规RT-PCR 
自行设计引物Nor-F/Nor-R对阳性NVs进行RT-PCR检测，通过优化体系，扩增反应结果见图1，从图1可以看出，引物扩增具有高度的特异性，克隆重组质粒与转录后的cRNA均能扩增出119bp的特异条带，特异产物经上海博尚生物科技公司测序，与阳性的NVs序列片段同源性97％以上，说明cRNA标准品构建准确。 
6.2扩增曲线 
9个梯度浓度的标准品cRNA在Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)扩增曲线见图2，从图中可以看出，所有浓度的标准品均有NASBA扩增。 
6.3基线确定与标准曲线 
选择Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)荧光检测模式F1/F2进行定量分析，选用Fit Points方式，在Noise Band界面上设定阈值(Noise band cursor)，阈值设定应高于阴性扩增线和样本噪音线的最高点。阈值的调整曲线如图3所示。 
在Analysis界面调整基线使定量校准品呈现线性，且Error<0.1；或用“Minimize Error” 自动调整，得出标准曲线见图4。从图中可以看出，标准曲线在标准品100～108拷贝之间呈现较好的线性关系，R2=0.9893。可以明显看出，实时NASBA方法比荧光定量RT-PCR更灵敏，能够检测到单拷贝的cRNA标准品。 
6.4方法的特异性 
利用本方法同时对NVs、RV和HAV病毒RNA进行实时NASBA扩增，结果见图5，从图中看出反应只对NVs有扩增现象，而RV，HAV均为阴性，特异性良好。 
6.5方法的灵敏度 
对病毒RNA梯度稀释进行一步法实时定量RT-PCR扩增，结果如图6，从图中可以看出，可以扩增到10-7的稀释度的RNA，比TaqMan实时定量RT-PCR的灵敏度高10倍，可能由于TaqMan扩增受到RT效率的影响，而降低了灵敏度，同时根据标准品扩增曲线的比较，TaqMan探针法荧光定量RT-PCR能够准确检测到100拷贝，而实时NASBA方法能够检测到单拷贝的cRNA标准品，可见实时NASBA方法具有更高的敏感性。 
Figure ISA0000094864840000011

Claims (3)

1.一种海洋食品中GII型诺如病毒检测引物，其特征在于： 
正向引物序列为SEQ ID NO1：5’-TGGAATTCCATCGCCCACT-3’； 
反向引物序列为SEQ ID NO2： 
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。 
2.一种海洋食品中GII型诺如病毒检测用分子信标探针，其特征在于，引物序列为SEQ ID NO3：5’-FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3’； 
所述分子信标探针在5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。 
3.一种定量检测海洋食品中GII型诺如病毒的方法，包括下列步骤： 
(一)GII诺如病毒标准cRNA的构建 
利用权利要求1所述的引物，通过常规RT-PCR对GII诺如病毒扩增并优化，特异性产物片段大小为119bp；然后分别进行目的片段的克隆、质粒提取、酶切线性化、体外转录与cRNA准确性验证、CopyRNA浓度的测定与拷贝数计算；将GII诺如病毒RAN进行10倍梯度稀释后，分装作为标准品于-80℃保存； 
(二)实时NASBA反应 
(1)对步骤(一)中保存的标准品共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为108，107，106，105，104，103，102，101，100拷贝；并提取待测样品中RNA，其中RNA的浓度为50-100ng/μL； 
反应体系如下： 
Figure RE-FSB0000118005740000011
(2)将NASBA反应液用无RNA酶的二次水稀释，取18μL，然后加入5μL上述步骤(1)中的各种浓度梯度的标准品cRNA和待测样品RNA，65℃恒温5min；然后冷却至41℃； 
(3)将酶混合液用无RNA酶的二次水稀释，与步骤(2)中的反应液混匀后加入Roche专用石英毛细管中，并设置阴性对照；在Roche定量PCR仪中(LightCycler2.0)进行扩增，反应条件41℃，1min，然后收集荧光信号，共99个循环，反应时间为100min； 
其中，所述的NASBA反应液中NOR-FAM如权利要求2所述。 
(三)定性定量分析 
根据9个梯度浓度的标准品cRNA的扩增结果制作标准曲线，将待测样品的扩增结果代入标准曲线，即可得到待测样品中的诺如病毒的含量。 
CN201310404375.XA 2013-09-09 2013-09-09 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法 Pending CN103525947A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310404375.XA CN103525947A (zh) 2013-09-09 2013-09-09 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310404375.XA CN103525947A (zh) 2013-09-09 2013-09-09 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103525947A true CN103525947A (zh) 2014-01-22

Family

ID=49928293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310404375.XA Pending CN103525947A (zh) 2013-09-09 2013-09-09 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103525947A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107385111A (zh) * 2017-08-18 2017-11-24 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN109868332A (zh) * 2019-03-29 2019-06-11 山东时进检测服务有限公司 一种检测海洋食品中gⅱ型诺如病毒的方法
CN112760423A (zh) * 2021-03-03 2021-05-07 大连民族大学 用于检测诺如病毒gi型和gii型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法
CN113215327A (zh) * 2021-06-25 2021-08-06 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测gⅱ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101297037A (zh) * 2005-11-02 2008-10-29 株式会社岛津制作所 Rna的提取方法及rna的检测方法
CN102965452A (zh) * 2012-09-25 2013-03-13 珠海国际旅行卫生保健中心 一种诺如病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101297037A (zh) * 2005-11-02 2008-10-29 株式会社岛津制作所 Rna的提取方法及rna的检测方法
CN102965452A (zh) * 2012-09-25 2013-03-13 珠海国际旅行卫生保健中心 一种诺如病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOXIA KOU ET AL.: "Rapid Detection of Noroviruses in Fecal Samples and Shellfish by Nucleic Acid Sequence-based Amplification", 《THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 *
余丽丽等: "新型核酸分子荧光探针—分子信标的研究进展", 《化学与生物工程》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107385111A (zh) * 2017-08-18 2017-11-24 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN107385111B (zh) * 2017-08-18 2020-12-08 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN109868332A (zh) * 2019-03-29 2019-06-11 山东时进检测服务有限公司 一种检测海洋食品中gⅱ型诺如病毒的方法
CN112760423A (zh) * 2021-03-03 2021-05-07 大连民族大学 用于检测诺如病毒gi型和gii型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法
CN112760423B (zh) * 2021-03-03 2022-06-14 大连民族大学 用于检测诺如病毒gi型和gii型恒温扩增的引物组、试剂盒及方法
CN113215327A (zh) * 2021-06-25 2021-08-06 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测gⅱ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gregory et al. Rapid one-step quantitative reverse transcriptase PCR assay with competitive internal positive control for detection of enteroviruses in environmental samples
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
CN102839223B (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用
CN103866050B (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物
CN103525947A (zh) 一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法
CN102154516B (zh) 猪传染性胃肠炎病毒s基因荧光定量pcr检测方法及其引物
CN110951916A (zh) 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒
CN102409109B (zh) 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法
CN105002298A (zh) 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量pcr检测方法
CN104017901B (zh) 一种同时检测人a型、b型呼吸道合胞病毒及人偏肺病毒的方法及试剂盒
Gilbert et al. Detection of equine arteritis virus in the semen of carrier stallions by using a sensitive nested PCR assay
CN105296674A (zh) 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法
CN109913591A (zh) 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN107338328B (zh) 一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法
Li et al. Fast detection of duck circovirus by real-time fluorescence-based recombinase-aided amplification
CN111041128B (zh) 一种基于实时荧光定量pcr检测鸭星状病毒3型用引物探针组、试剂盒及检测方法
CN114574630A (zh) 一种快速检测多种呼吸道病原体的试剂盒及探针、引物组合
CN102943116B (zh) 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN103205512A (zh) 检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒
CN115725788A (zh) 一种用于检测猫细小病毒的引物和TaqMan探针及其应用
CN111471801A (zh) 检测tc07-2型鸡传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量pcr试剂盒及其应用
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
CN116083654A (zh) 鲤疱疹病毒2型与3型双重pcr检测方法
CN111411169A (zh) 用于恒温扩增检测麻疹病毒的核酸序列、试剂盒及方法和应用
CN110607404B (zh) 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination