CN101297037A - Rna的提取方法及rna的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使普遍存在于生物样本(特别是排泄物样本)等样本中或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本(特别是排泄物来源样本)等样本中的RNase失活的方法、从该样本提取及检测RNA的方法。该RNA的提取方法包括：在加热条件下得到含有RNA包含体及RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂的pH为8.1以上的混合物的工序；通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活和从RNA包含体提取RNA的工序。该RNA检测方法混合含有利用该提取方法提取的RNA的样本处理液和扩增用反应液，进行RNA扩增反应。

Description

RNA的提取方法及RNA的检测方法

技术领域

本发明涉及一种使存在于样本等中的RNA分解酶失活的方法、简易而且稳定地从存在于该样本中的RNA包含体(细胞、真菌、细菌、病毒等)或者从该样本中分离的RNA包含体中提取RNA的方法、检测该RNA的方法以及在这些方法中使用的试剂。本发明涉及RNA扩增法，尤其涉及利用逆转录-聚合酶链反应((Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，以下简称为RT-PCR)法的RNA扩增法。

背景技术

为了配制在分子生物学分析中使用的RNA，必须在RNA分解酶(RNase)不发挥作用的环境下配制RNA。通常必需从被检验物中分离回收细胞、真菌、细菌、病毒等(以下总称为RNA包含体。)，然后从该RNA包含体内部提取RNA，纯化提取的RNA的过程。但是，RNase是不均匀存在而且很难失活的物质。所以，在从生物等样本中的RNA包含体中纯化RNA时，不得不进行从RNA包含体内部提取RNA过程中的RNase控制(活性的抑制)和RNase除去，必需极为严格而且烦杂的方法。因此，作为进行该过程的方法，过去使用的是用苯酚或苯酚·氯仿等提取及纯化RNA的方法。最近，在RNA提取及纯化的过程中，还有使用离子交换树脂、玻璃过滤器、玻璃珠、磁珠或者具有蛋白凝集作用的试剂等方法的报告。RNA的提取及纯化法在Chomczynski&Sacchi(1987)分析化学(Analytical Biochemistry)，162：156-159.(酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法：AGPC法)；或分子克隆(Molecular Cloning)：实验室手册第三版(ALaboratory Manual Third Edition)(2001)Joseph.Sambrook，David W.Russell等中有记载。

RT-PCR法是使用逆转录酶(Reverse Transcriptase)将RNA转换成互补的DNA(cDNA)之后，用PCR法扩增cDNA的方法。RT-PCR由于可以用微量的RNA进行定量分析，所以目前被用作检测灵敏度最高的定量性出色的分析法之一。正在成为在例如保有RNA作为基因的病毒的检测、mRNA的定量检测、利用mRNA的碱基序列决定的表达基因的分析、进而利用cDNA的克隆的表达产物的分析以及生产等中不可缺少的技术。

在RT-PCR法中，接着RT反应进行的PCR法是可以通过反复进行夹持DNA链中的特定区域的引物(primer)之间的DNA合成反应，而将目的DNA片断扩增至数十万倍的方法。PCR法在作为マリス氏等的发明的特开昭61-274697号公报中有记述。

但是，以所述方法为主的RNA扩增法由于全部以酶反应作为基础，所以存在于生物样本中的色素、蛋白、糖类或者未知的夹杂物强烈地妨碍反应已被广泛认识。

进而，RNA容易被普遍存在于全部生物样本中的RNA分解酶(RNase)分解。

因此，如上所述，在所述的RNA扩增之前，必须从被检验物分离细胞、真菌、细菌、病毒等(以下称为RNA包含体)，然后从该RNA包含体提取纯化RNA的过程。例如，在美国专利第6825340号说明书或美国专利第6777210号说明书中公开了在还原剂的存在下通过进行加热处理，进行RNase的失活以及从用PBS清洗后的培养细胞中的RNA提取和RT-PCR。

另一方面，在特开2001-29078号公报中还公开了从含有RNA包含体的样本直接进行RT-PCT。

关于不伴随RNA扩增的病毒检测技术，在特开2004-301684号公报中公开了使用碱性缓冲剂的诺罗病毒标本用稀释液以及使用该稀释液的利用抗原抗体反应的诺罗病毒检测。

非专利文献1：Comczynski以及Sacchi，“分析化学”，1987年，第162卷，p.156-159.

非专利文献2：Joseph.Sambrook以及David W.Russell，“分子克隆：实验室手册第3版”，2001年

专利文献1：特开昭61-274697号公报

专利文献2：美国专利第6825340号说明书

专利文献3：美国专利第6777210号说明书

专利文献4：特开2001-29078号公报

专利文献5：特开2004-301684号公报

发明内容

RNA当然在生物内，经常被暴露在普遍存在于该生物存在的所有环境中的RNase分解的危险性之中。因而，在从RNA包含体内部提取RNA时，当然应该迅速地进行RNase失活处理，无论在纯化过程中还是在纯化后，都需要不混入RNase的严格的操作或管理。

但是，使用以往的方法进行样本中的RNA的纯化时，大多很难除去夹杂物或者样本中的RNA的回收量不一定。尤其在样本中的目的RNA的含量少的情况下，有时难以接着进行RNA分析。另外，这些纯化法的操作烦杂，需要时间，操作中的污染机会高。由于这些原因，所以以往的纯化法需要熟练。因而，为了解决这些问题点，需要更简便且有效的样本前处理法。

本发明的目的在于提供一种使普遍存在于生物样本、排泄物样本、环境样本等样本中或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本、排泄物来源样本、环境来源样本等样本中的RNase失活的方法。

本发明的目的还在于提供一种有效地从存在于生物样本、排泄物样本、环境样本等样本中或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本、排泄物来源样本、环境来源样本等样本中的RNA包含体中提取RNA的方法。

本发明的目的还在于提供一种通过有效地从该样本提取RNA，进而通过抑制对核酸合成反应有妨碍的物质的作用从而使该样本中的RNA有效地扩增，来简便、迅速且稳定地检测存在于样本中的RNA的方法。

本发明的目的还在于提供一种可以在这些方法中使用的处理试剂。

本发明人等进行了潜心研究，结果发现通过在一个工序中进行生物样本中的RNase的失活和从RNA包含体中的RNA提取，接着进行RNA扩增，可以实现所述本发明的目的，以至完成本发明。

<RNA分解酶失活方法>

下面涉及RNA分解酶(RNase)的失活方法。下述RNA分解酶失活方法是对含有RNA分解酶的样本，使用至少含有还原剂的碱性处理试剂，在加热条件下，进行所述RNA分解酶的失活的RNA分解酶的失活方法。

一种RNA分解酶的失活方法，其中，包括：

在加热条件下得到含有RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂(treating reagent)的pH为8.1以上的混合物的工序；

通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活的工序。

所述处理试剂的碱性程度为与样本混合成为混合物时混合物的pH成为8.1以上(25℃的情况下)的程度。是在30℃以上的加热条件下使用所述处理试剂的所述RNA分解酶的失活方法。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述处理试剂含有从Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液构成的组中选择的碱性缓冲液(alkali buffer)。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述处理试剂含有从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择的碱性物质。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述氢氧化物为氢氧化钠及/或氢氧化钾。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述碱性物质以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述RNA分解酶的失活方法中，作为所述碱性物质，氢氧化钠及/或氢氧化钾以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述还原剂为硫醇型还原剂。

在此，硫醇型还原剂是具有硫醇基的还原剂的总称。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述硫醇型还原剂从二硫苏糖醇(dithiothreitol)及巯基乙醇构成的组中选择。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述还原剂以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述RNA分解酶的失活方法中，作为所述还原剂，二硫苏糖醇以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述样本从生物样本、生物来源样本、环境样本以及环境来源样本构成的组中选择。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述样本从排泄物样本及排泄物来源样本构成的组中选择。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述RNA包含体从细胞、真菌、细菌以及RNA病毒构成的组中选择。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述RNA病毒从逆转录酶病毒(retrovirus)、诺罗病毒(norovirus)(SRSV)、轮状病毒(rotavirus)以及丙型肝炎病毒(HCV)构成的组中选择。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述RNA病毒为逆转录酶病毒的情况下，所述逆转录酶病毒为艾滋病毒(HIV)。

在所述RNA分解酶的失活方法中，所述RNA为mRNA。

在所述RNA分解酶的失活方法中，包括：

在至少含有还原剂的溶液中混杂含有RNA分解酶的样本的工序；

将所述样本与所述还原剂的混合液调节至25℃下pH为8.1以上的工序；

通过将已调节pH的所述混合液提供到加热条件下，来进行所述RNA分解酶的失活的工序。

即，所述方法中的RNA分解酶的失活是通过将样本提供到存在还原剂的pH为8.1以上的碱性环境中进行的。

<RNA提取方法>

下述(1)～(11)涉及RNA的提取方法。即，本发明的提取方法是在加热条件下，对含有RNA包含体及RNA分解酶的样本，使用至少含有还原剂的碱性处理试剂，进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体的RNA提取的RNA的提取方法。

此外，在本发明的方法中，从RNA包含体内部的RNA提取被定义为通过破坏RNA包含体的膜结构来提取被包含在膜结构中的RNA，使其向膜外的环境露出。那么，对露出的RNA或露出的RNA所暴露的外部环境进行的任何处理都不被包括在本发明中的提取的定义中。

(1)一种RNA提取方法，其中，包括：

在加热条件下得到含有RNA包含体及RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂(treating reagent)的pH为8.1以上的混合物的工序；

通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活和从RNA包含体的RNA提取的工序。

在所述的RNA提取方法中，所述处理试剂的碱性程度为与样本混合成为混合物时混合物的pH成为8.1以上(25℃的情况下)的程度。

在所述的RNA提取方法中，所述加热条件为30℃以上。

(2)在(1)中记载的RNA提取方法中，所述处理试剂含有从Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液构成的组中选择的碱性缓冲液。

(3)在(1)或(2)中记载的RNA提取方法中，所述处理试剂含有从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择的碱性物质。

在所述的RNA提取方法中，所述氢氧化物为氢氧化钠及/或氢氧化钾。

在所述的RNA提取方法中，所述碱性物质以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述的RNA提取方法中，作为所述碱性物质，氢氧化钠及/或氢氧化钾以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

(4)在(1)～(3)的任意一项中记载的RNA提取方法中，所述还原剂为硫醇型还原剂。

在此，硫醇型还原剂是具有硫醇基的还原剂的总称。

在所述的RNA提取方法中，所述硫醇型还原剂从二硫苏糖醇及巯基乙醇构成的组中选择。

在所述的RNA提取方法中，所述还原剂以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述的RNA提取方法中，作为所述还原剂，二硫苏糖醇以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

(5)在(1)～(4)的任意一项中记载的RNA提取方法中，所述样本从生物样本、生物来源样本、环境样本以及环境来源样本构成的组中选择。

(6)在(1)～(5)的任意一项中记载的RNA提取方法中，所述样本从排泄物样本及排泄物来源样本构成的组中选择。

(7)在(1)～(6)的任意一项中记载的RNA提取方法中，所述RNA包含体从细胞、真菌、细菌以及RNA病毒构成的组中选择。

(8)在(7)中记载的RNA提取方法中，所述RNA病毒从逆转录酶病毒、诺罗病毒(SRSV)、轮状病毒以及丙型肝炎病毒(HCV)构成的组中选择。

(9)在(8)中记载的RNA提取方法中，所述RNA病毒为逆转录酶病毒的情况下，所述逆转录酶病毒为艾滋病毒(HIV)。

(10)在(1)～(9)的任意一项中记载的RNA提取方法中，所述RNA为mRNA。

(11)在所述的RNA提取方法中，包括：

在至少含有还原剂的溶液中混杂含有RNA包含体及RNA分解酶的样本的工序；

将所述样本与所述还原剂的混合液调节至25℃下pH为8.1以上的工序；

通过将已调节pH的所述混合液提供到加热条件下，来进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体的RNA提取的工序。

即，所述(1)～(10)中的RNA分解酶的失活及RNA提取是通过将样本提供到存在还原剂的pH为8.1以上的碱性环境中进行的。

<RNA检测方法>

下面(12)～(22)涉及RNA检测方法。本发明的RNA检测方法是在加热条件下，对含有RNA包含体及RNA分解酶(RNase)的样本，使用至少含有还原剂的碱性处理试剂，进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体内部的RNA提取，获得样本处理液，混合所述样本处理液和扩增用反应液，进行RNA扩增反应的RNA的检测方法。

在本发明的方法中，从RNA包含体内部的RNA提取被定义为通过破坏RNA包含体的膜结构来取出被包含在膜结构中的RNA，使其向膜外的环境露出。那么，对露出的RNA或露出的RNA所暴露的外部环境进行的任何处理都不被包括在本发明中的提取的定义中。

(12)一种RNA检测方法，其中，包括：

在加热条件下得到含有RNA包含体及RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂(treating reagent)的pH为8.1以上的混合物的工序；

通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活和从RNA包含体的RNA提取，从而获得含有提取的RNA的样本处理液(treated sample liquid)的工序；

混合所述样本处理液和扩增用反应液，进行RNA扩增反应。

在所述的RNA检测方法中，所述处理试剂的碱性程度为与样本混合成为混合物时混合物的pH成为8.1以上(25℃的情况下)的程度。

在所述的RNA检测方法中，所述加热条件为30℃以上。

(13)在(12)中记载的RNA检测方法中，所述处理试剂含有从Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液构成的组中选择的碱性缓冲液。

(14)在(12)或(13)中记载的RNA检测方法中，所述处理试剂含有从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择的碱性物质。

在所述的RNA检测方法中，所述氢氧化物为氢氧化钠及/或氢氧化钾。

在所述的RNA检测方法中，所述碱性物质以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述的RNA检测方法中，作为所述碱性物质，氢氧化钠及/或氢氧化钾以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

(15)在(12)～(14)的任意一项中记载的RNA检测方法中，所述还原剂为硫醇型还原剂。

在此，硫醇型还原剂是具有硫醇基的还原剂的总称。

在所述的RNA检测方法中，所述硫醇型还原剂从二硫苏糖醇及巯基乙醇构成的组中选择。

在所述的RNA检测方法中，所述还原剂以0.1mM～饱和浓度含有于所述处理试剂中。

在所述的RNA检测方法中，作为所述还原剂，二硫苏糖醇以1mM～100mM含有于所述处理试剂中。

(16)在(12)～(15)的任意一项中记载的RNA检测方法中，所述样本从生物样本、生物来源样本、环境样本以及环境来源样本构成的组中选择。

(17)在(12)～(16)的任意一项中记载的RNA检测方法中，所述样本从排泄物样本及排泄物来源样本构成的组中选择。

(18)在(12)～(17)的任意一项中记载的RNA检测方法中，所述RNA包含体从细胞、真菌、细菌以及RNA病毒构成的组中选择。

(19)在(18)中记载的RNA检测方法中，所述RNA病毒从逆转录酶病毒、诺罗病毒(SRSV)、轮状病毒以及丙型肝炎病毒(HCV)构成的组中选择。

(20)在(19)中记载的RNA检测方法中，所述RNA病毒为逆转录酶病毒的情况下，所述逆转录酶病毒为艾滋病毒(HIV)。

(21)在(12)～(20)的任意一项中记载的RNA检测方法中，所述RNA为mRNA。

在所述的RNA检测方法中，所述样本处理液与所述扩增用反应液的混合液进一步含有从硫酸酯化多糖、聚胺、白蛋白以及非离子性表面活性剂构成的组中选择的添加物。

在所述的RNA检测方法中，所述非离子表面活性剂从聚氧乙烯山梨糖醇酐一月桂酸酯及聚氧乙烯异辛基苯醚构成的组中选择。

在所述的RNA检测方法中，所述处理试剂进一步含有硫酸酯化多糖。

(22)在所述的RNA检测方法中，包括：

在至少含有还原剂的溶液中混杂含有RNA包含体及RNA分解酶的样本的工序；

将所述样本与所述还原剂的混合液调节至25℃下pH为8.1以上的工序；

通过将已调节pH的所述混合液提供到加热条件下，来进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体的RNA提取，从而获得含有提取的RNA的样本处理液的工序；

混合所述样本处理液和扩增用反应液，进行RNA扩增反应的工序。

即，所述(12)～(21)的方法中的RNA分解酶的失活及RNA提取是通过将样本提供到存在还原剂的pH为8.1以上的碱性环境中进行的。

<处理试剂>

下面涉及相对含有RNA分解酶的样本的处理试剂。

一种含有RNA分解酶的样本的处理试剂，其是至少含有碱性物质及/或碱性缓冲液和还原剂的处理试剂。

所述的含有RNA分解酶的样本的处理试剂是在所述RNA分解酶的失活方法、在(1)～(11)的任意一项中记载的RNA提取方法或在(12)～(22)的任意一项中记载的RNA检测方法中使用的、至少含有碱性物质及/或碱性缓冲液和还原剂的处理试剂。

如果利用本发明，可以提供一种使普遍存在于生物样本、环境样本等样本或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本等样本中的RNase失活的方法。

本发明还可以提供一种有效地从存在于生物样本、环境样本等样本中或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本等样本中的RNA包含体中提取RNA的方法。

本发明还可以提供一种通过在一个工序中进行该样本中的RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取，使简便·稳定地·有效地而且迅速地扩增存在于样本中的RNA成为可能。接着，通过抑制对核酸合成有妨碍的物质的作用，使简便·稳定地·有效地而且迅速地扩增存在于样本中的RNA成为可能。这样，可以提供一种简便·稳定地·有效地而且迅速地检测样本中的RNA的方法。

本发明还可以提供一种可以在这些方法中使用的处理试剂。

附图说明

图1是表示在本实施例1中，对在人血清中添加RNA包含体的标本，使用蒸馏水或组成不同的3种处理试剂进行处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图2是表示在本实施例2中，将在实施例1中用蒸馏水或组成不同的3种处理试剂进行处理之后的标本冷藏保存1天，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图3是表示在本实施例3中得到的加热处理的温度及时间与RNA检测量的关系的曲线图。

图4是表示在本实施例4中得到的在85℃下加热处理的时间与RNA检测量的关系的曲线图。

图5是表示在本实施例5中得到的加热处理的温度及时间与RNA检测量的关系的曲线图。

图6是表示在本实施例8中，对在人血清中添加RNA包含体的标本，使用组成不同的15种处理试剂进行处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图7是表示在本实施例9中，对在人血清中添加RNA包含体的标本，在各种加热条件下进行使用实施例8中的处理试剂之一的处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图8是表示在本实施例9中，对在人血清中添加RNA包含体的标本，在各种加热条件下进行使用在实施例8中的处理试剂之一中进一步含有EGTA的处理试剂的处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图9是表示在实施例10中，对混合有疑似诺罗病毒阳性的粪便样本的粪便样本液，使用具有NaOH的浓度彼此不同的组成的8种处理试剂进行处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图10是表示在实施例11中，对混合有疑似诺罗病毒阳性的粪便样本的粪便样本液，使用具有DTT的浓度彼此不同的组成的7种处理试剂进行处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图11是表示在实施例12中，对病毒浓度不同的感染粪便样本，以RNA非纯化实施的RNA检测的结果的电泳图。

图12是表示在实施例12中，对病毒浓度不同的诺罗病毒感染粪便样本，纯化RNA并实施的RNA检测的结果的电泳图。

图13是表示在实施例13中，使用分别来源于感染诺罗病毒的18个不同的标本的诺罗病毒感染粪便样本的RNA检测结果的电泳图。

图14是表示在实施例13中，使用分别来源于没有感染诺罗病毒的10个不同的标本的诺罗病毒感染粪便样本的RNA检测结果的电泳图。

图15是表示在实施例14中，对混合有疑似诺罗病毒阳性的粪便样本的粪便样本液，在各种加热条件下进行使用处理试剂的处理，然后进行RNA扩增，由此检测RNA的结果的电泳图。

图16是表示在实施例14中，利用实时定量(Real-time)PCR对已扩增的RNA进行定量的结果的曲线图。

图17是实施例8中的将模型标本与15种各处理试剂混合，进行热处理之后的样子的照片。上段为使用0mMDTT的处理试剂的结果，从左开始是使用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]的处理试剂的结果。下段为使用DTT 20mM处理试剂的结果，从左开始是使用[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]的处理试剂的结果。

具体实施方式

本发明的RNase失活方法以及RNA提取方法是在碱性环境以及还原剂的存在下实现的。本发明的RNA检测方法包括进行样本中的RNase失活以及从RNA包含体内部的RNA提取的工序和进行RNA扩增反应的工序。

利用进行样本中的RNase失活以及从RNA包含体内部的RNA提取的工序得到的样本处理液与RNA扩增用反应液直接混合，提供到RNA扩增反应。所以，可以不进行RNA的特别纯化而直接从样本使RNA扩增。

1.样本

作为成为处理对象的样本，只要是能够含有RNase的样本，本发明可以适用于任意样本。作为这样的样本，可以举出生物样本、生物来源样本、环境样本、环境来源样本、排泄物样本、排泄物来源样本等。

作为成为处理对象的样本，为除了RNase还含有RNA包含体的情况下，本发明尤其适用。作为这样的样本，可以举出生物样本、生物来源样本、环境样本、环境来源样本、排泄物样本、排泄物来源样本等。这种情况下，可以用一个工序进行RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取。

在本发明中，RN包含体是指被膜结构包围而且在内部具有RNA的结构体。具体而言，指细胞、真菌、细菌、病毒等。细胞包括从血液或脑脊髓液等来源的白细胞、口腔粘膜细胞等。另外，细胞还包括食品来源细胞、来自体内的剥离细胞等。在本发明中，这样的细胞成为RNA包含体的情况下，可以对mRNA等RNA进行提取以及检测。作为病毒，可以举出RNA病毒。作为RNA病毒，可以举出逆转录酶病毒(艾滋病毒(HIV)等)、诺罗病毒(SRSV)、轮状病毒、丙型肝炎病毒(HCV)等。

作为生物样本，可以举出动植物组织或体液等。体液包括血液样本、脑脊髓液、唾液、乳汁等。在本发明中，血液样本包括全血、血浆、血清等。

另一方面，作为生物来源样本，包括对所述生物样本进行了某些处理的样本。

作为环境样本，只要是含有RNA包含体的样本即可，可以举出包括大气、土壤、水等所有样本。

另一方面，作为环境来源样本，包括对所述环境样本进行某些处理的样本。

排泄物包括尿、粪便、吐物等。

排泄物样本包括从生物排泄的排泄物本身或者在水、生理盐水、pH缓冲液等中悬浮排泄物本身的样本。作为所述生物，可以举出人、家畜、昆虫、其他所有动物。

另一方面，在排泄物来源样本中还包括对所述排泄物样本进行了某些处理的样本。

作为对所述样本可以进行的某些处理，可以举出RNA包含体的回收处理。作为RNA包含体的回收方法，只要是能够从所述样本中分离RNA包含体的方法，可以使用任意方法。例如，可以使用离心·超速离心操作、过滤·超滤操作；在该操作中并用聚乙二醇等共沉剂·抗体等吸附载体等的方法；以及使用结合了该吸附载体的磁珠或膜等进行分离的方法等。这其中的任意方法在可能残存RNase的RNA包含体的回收处理的情况下，本发明均有效。

另外，在本发明中的样本中允许含有妨碍RNA扩增反应的物质。妨碍RNA扩增反应的物质在生物样本、生物来源样本、环境样本、环境来源样本、排泄物样本、排泄物来源样本等样本中通常含有。作为妨碍RNA扩增反应的物质，可以举出在生物样本中存在的色素、蛋白质、糖类、未知的夹杂物等在细胞内·外均存在的物质。

2.处理试剂

2-1.处理试剂一样本混合物的pH

为了进行样本中的RNase失活、进而从样本中的RNA包含体内部的RNA提取，只要向至少含有还原剂的碱性环境中提供样本即可。只要配制至少还原剂与样本最终混合的碱性混合液即可，不分混合的顺序等。

进而，在本发明中，由于该混合液应该被提供到加热条件(后述项目3.)下，所以该混合液的配制操作和加热操作不分顺序。即，所述混合液在被提供到加热条件下时，只要是在至少含有还原剂的碱性溶液中混杂样本的状态即可。

例如，可以加热样本及处理试剂的一方或双方，然后混合二者。即，在配制该混合液的同时提供到加热条件下。

另外，也可以例如在室温下配制样本与处理试剂的混合液，将得到的混合液提供到加热条件下。这种情况下，处理试剂通常用作水溶液。

进而，也可以例如在室温下混合至少含有还原剂的溶液和样本，调节得到的还原剂-样本混合液的pH(后述)，将pH调节后的还原剂-样本混合液提供到加热条件下。这种情况下，虽然没有使用下述组成的处理试剂本身，但pH调节后的还原剂-样本混合液相当于所述的样本-处理试剂混合物。在下述中，在记载成样本-处理试剂混合物的情况下，也包括该pH调节后的还原剂-样本混合液。

处理试剂与样本的混合物(处理试剂-样本混合物)的pH在25℃下为pH8.1以上，可以为pH8.1～11.1。根据样本不同，有时优选为pH9.0～11.1。作为这样的情况，可以举出使用排泄物样本(特别是粪便样本)或从其来源的样本作为样本的情况。

为了调节成这样的碱性环境，只要在处理试剂中含有碱性缓冲液及/或碱性物质即可。

作为可在处理试剂中含有的碱性缓冲液，没有特别限定，可以举出Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液。作为构成Good缓冲液的缓冲剂，没有特别限定，可以举出Tricine、MOPS、HEPES、CHES等。

作为可在处理试剂中含有的碱性物质，从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择即可。例如，作为氢氧化物，可以举出氢氧化钠或氢氧化钾等。作为胺，可以举出三羟基甲基氨基甲烷等。它们可以单独或组合使用多种。

作为处理试剂中的碱性物质的浓度，根据碱性物质的种类或样本的种类或浓度、与样本的混合比等而不同，可以为0.1mM～饱和浓度(室温下的饱和浓度)，优选为1mM～饱和浓度(室温下的饱和浓度)。

2-2.还原剂

作为在处理试剂中含有的还原剂，可以使用硫醇型还原剂。硫醇型还原剂是具有硫醇基的还原剂的总称。

作为硫醇型还原剂，可以举出二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇等。巯基乙醇通常为2-巯基乙醇。这些还原剂可以单独或组合使用多种。

作为处理试剂中的还原剂的浓度，根据还原剂的种类或样本的种类或浓度、与样本的混合比等而不同，可以为0.1mM～饱和浓度(室温下的饱和浓度)，优选为1mM～饱和浓度(室温下的饱和浓度)。

作为处理试剂与样本的混合物中的还原剂的浓度，例如为0.1mM～1mM，优选为1mM～100mM。在样本为血液样本的情况下，有时更优选0.05mM～20mM。另外，样本为排泄物样本或排泄物来源样本的情况下，根据还原剂的种类、样本的种类·浓度等而不同，有时更优选为2.5mM～25mM。

2-3.添加物

处理试剂可以进一步含有螯合剂。已知2价金属离子促进RNA的加水分解。因而，在处理试剂中添加螯合2价金属离子的螯合剂(EGTA或EDTA等)是有效的。

另外，处理试剂也可以进一步含有硫酸酯化多糖。

3.加热条件

对于加热处理中的温度及时间的条件而言，因样本中的RNase存在量的不同、RNA包含体的种类的不同引起的膜结构的破坏的容易程度的不同、碱性物质使用量的不同引起的pH的不同等而不同，所以没有特别限定。处理时间例如可以为1秒～60分钟左右，优选为30秒～30分钟，进而优选为30秒～15分钟左右。

处理温度优选为30℃以上。

样本为排泄物样本或排泄物来源样本的情况下，处理温度例如可以为30～100℃左右，或者45℃～100℃左右，优选温度因加热时间而不同，优选为55℃～80℃左右，进一步优选的温度因加热时间而不同，进一步优选60℃～75℃左右。

为其他样本的情况下，处理温度为60℃以上，例如可以为60℃以上、100℃以下左右，优选为70℃～90℃左右，进而优选80℃～85℃左右。在80～85℃下处理的情况下，处理时间可以为30秒～5分钟。

4.RNA分解酶失活及RNA提取

通过使用所述的处理试剂加热处理，可以实现样本中含有的RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取的双方处理。RNA提取与RNase的失活同时或者接着RNase的失活发生。在本发明中，利用只有使用所述的处理试剂的加热处理的简便操作，可以进行所述双方的处理，所以可以迅速地而且稳定地提取RNA。

此外，在RNase的失活中，使RNase变性，酶活性部位变成不发挥作用的状态。即使放置在加热条件下，RNase通常对热稳定，所以不会简单地失活。但是，利用使用本发明的处理试剂的加热操作，这样的RNase的失活成为可能。

接着，从RNA包含体内部的RNA提取是指RNA包含体的膜结构被破坏，被包含在膜结构中的RNA向膜外的环境露出。在RNA包含体膜外结构中存在的RNase可以利用相同的处理试剂失活。所以，露出的RNA尽管暴露于本来受到分解的危险性极高的RNA包含体膜外环境中，但受到分解的危险性变得极低。所以，在本发明中，为了实现从RNA包含体内部的RNA提取，RNA在RNA包含体的膜外环境中露出即可，即使不立即纯化露出的RNA，RNA也可以稳定地存在。

5.样本处理液

这样地进行，可以得到RNase失活、RNA露出的样本处理液。此外，样本处理液可以提供到各种工序中。例如，可以提供到用于进行RNA分析进行的RNA扩增法、杂交(hybridization)法等工序中。用本发明的方法得到的样本处理液的RNase失活。因而，由于稳定地含有RNA，所以不进行任何处理也可以提供到所述工序中。当然，用本发明的方法得到的样本处理液即使是进一步通过提供到某些处理得到的样本处理液，也可以提供到所述工序中。例如可以举出中和等用于调节pH的处理或者离心分离或RNA分离等RNA纯化处理。

6.扩增反应液

用已述的方法可以得到RNase失活、RNA露出的样本处理液。得到的样本处理液可以用于扩增反应液的配制。

如上所述，在扩增反应液中使用的样本处理液可以在所述的加热处理后作为不进行任何处理的状态得到，也可以在加热处理后作为通过进行离心操作得到的上清液或者作为通过进行过滤(filtration)得到的滤液得到。

另外，样本处理液与RNA扩增用反应液混合，成为最终反应液，但由于所述样本处理液为碱性，所以在样本处理液与扩增用反应液的混合物的pH偏离酶的反应条件的情况下，必需在从所述加热处理之后到扩增反应开始为止之间的适当的阶段，将混合物的pH调节至最适宜条件内。关于最适宜pH或pH的调节法，可以由从业者适当决定。作为pH的最适宜条件，如后所述，在反应系统中存在妨碍RNA扩增反应的物质的情况下，为了抑制该妨碍物质的作用而将pH调节至碱性区域也是有效的。对于该最适宜pH，可以参考特许(专利)3494509号公报或特许(专利)3452717号公报。

6-1.扩增反应液的基本组成

作为RNA扩增反应法，可以举出RT-PCR法，只要是进行RNA扩增的方法，则没有限定，可以使用任意一种方法。作为扩增反应液的组成，没有特别限定，可以由从业者适当决定。

作为RNA扩增反应，实行RT-PCR的情况下，作为其方式，可以举出在管(tube)内准备样本处理液与RT用反应液的混合物，在所述管内进行RT反应，在其他管内准备的PCR反应液中添加RT反应产物的一部分，进行PCR反应，由此实行的反应方式(2管-2步(Two tube-Two step))；在管内准备样本处理液与RT反应液的混合物，在所述管内进行RT反应，相对所述管内的RT反应产物添加PCR用反应液，进行PCR反应，由此实行的反应方式(1管-2步(One tube-Two step))；以及在管内准备RT用反应液和PCR反应液的双方，通过与样本处理液混合，连续地进行RT反应和PCR反应，由此实行的反应方式(1管-1步(One tube-One step))。

因而，实行RT-PCR的情况下，与样本处理液混合的RNA扩增用反应液根据所述实行方式不同，包括为RT反应液的情况或者为RT反应液与PCR反应液的混合反应液的情况。

RT反应液可以没有限定地使用公知的RT反应液。通常含有pH缓冲液、盐类、引物、脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)类以及逆转录酶。所述盐类可以使用MgCl₂或KCl等，但也可以适当地变更成其他盐类。引物是指起到作为合成cDNA时的合成开始点的功能的寡核苷酸(oligonucleotide)。在RT反应中使用的逆转录酶是指能够将RNA逆转录成cDNA的酶。作为逆转录酶，可以举出Rous相关病毒(Rous associatedvirus)(RAV)或禽成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus)(AMV)等鸟的逆转录酶病毒来源的逆转录酶病毒；鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)(MMLV)等小鼠的逆转录酶病毒来源的逆转录酶病毒；以及Thermus thermophilus来源的Tth DNA聚合酶(polymerase)等，但不被这些所限定。

可以没有限定地使用公知的PCR反应液。通常含有pH缓冲液、盐类、引物、脱氧核糖核苷酸类以及耐热性DNA聚合酶。所述盐类可以使用MgCl₂或KCl等，但也可以适当地变更成其他盐类。引物是指起到作为核酸扩增时的合成开始点的功能的寡核苷酸。在PCR中使用的耐热性DNA聚合物是指以引物为基点合成DNA的耐热性出色的聚合酶。作为适当的耐热性DNA聚合酶，可以举出Thermus aquaticus来源的Taq DNA聚合酶；Thermus thermophilus来源的Tth DNA聚合酶；Pyrococcus来源的KODDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶；以及这些耐热性DNA聚合酶的混合物等，但不被这些所限定。

此外，由于Tth DNA聚合酶具有RT活性和PCR活性的双方，所以在用1管-1步进行RT-CPR时，具有可以用1种酶维持的特征。

6-2.扩增反应液中的添加物

作为含有RNA包含体及RNase的样本使用生物样本或生物来源样本的情况下，有时在用于所述的RNase失活·从RNA包含体内部的RNA提取的处理后得到的样本处理液中，含有妨碍RNA扩增反应的物质。接着，如果与扩增用反应液混合这样的样本处理液，则在反应系统中存在妨碍RNA扩增反应的物质，扩增反应可能因此而没有充分地进行。

具体而言，妨碍RNA扩增反应的物质可以举出例如生物样本中的色素、某种蛋白质或糖等在细胞内外均存在的物质。

因此，为了抑制这样的妨碍物质的作用，在本发明中，可以使用从硫酸酯化多糖及聚胺中选择的添加物。

作为硫酸酯化多糖，可以从肝素、葡聚糖硫酸酯、硫酸乙酰肝素、软骨素硫酸、硫酸软骨素、海萝胶(funoran)、硫酸化琼脂糖、角叉菜胶、金属卟啉、墨角藻聚糖、硫酸化凝胶多糖(cardlan)以及它们的盐中选择使用。其中，优选肝素及其盐、葡聚糖硫酸酯及其盐。硫酸酯化多糖可以单独或组合使用数种以上。

硫酸酯化多糖只要在RNA扩增反应时在反应系统中含有即可。因而，硫酸酯化多糖可以在例如所述的加热处理中使用的处理试剂、加热处理后的样本处理液、扩增用反应液以及样本处理液与扩增反应液的混合物的任意一种中添加。

对于硫酸酯化多糖的使用量而言，根据硫酸酯化多糖的分子量、扩增反应妨碍物质的存在量等不同而有效的浓度范围发生变动。

例如，作为硫酸酯化多糖的一例的肝素被频繁用于血液的抗凝血剂，而其自身已知为PCR妨碍物质，所以成为最好不在PCR反应液中存在的物质。但是，在本发明中，使用肝素等硫酸酯化多糖的情况下，作为其使用量，除了硫酸酯化多糖自身成为RT反应及PCR反应的妨碍物质的量，所述的抑制RT反应及PCR反应的妨碍物质的作用的量被没有限定地允许。作为硫酸酯化多糖的相关具体量，关于硫酸酯化多糖的所述事项被记载于特开2000-93176号公报中。

具体而言，作为肝素的使用量，在样本处理液与RNA扩增反应液混合而成的最终反应液中例如添加0.1μg/ml以上，优选添加0.3μg/ml～50μg/ml。

聚胺是具有2个以上伯或仲氨基的烃的总称。某种聚胺存在于生物内，在蛋白质或核酸合成旺盛的组织中含有很多，具有多样的生理作用。但是，本发明中的聚胺不需要这样的作用，只要是在1分子内具有2个以上伯或仲氨基的烃即可，没有特别限定。作为聚胺的具体例，可以举出乙二胺、三甲烯二胺、精胺、精脒、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、三缩四乙二胺以及五亚乙基六胺等。

聚胺只要在RNA扩增反应时在反应系统中含有即可。因而，聚胺例如可以在加热处理后的样本处理液、扩增用反应液以及样本处理液与扩增用反应液的混合物的任意一种中添加。关于聚胺的所述事项在特开平6-277061号公报中有详述，对于聚胺的使用量，也可以参考该公报。

在本发明中，可以在样本处理液与RNA扩增反应液混合而成的最终反应液中进一步含有从白蛋白(牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin；BSA))以及非离子性表面活性剂中选择的添加物。这些添加物也可以与所述聚胺一起使用。

白蛋白是动·植物的细胞·体液中含有的一组可溶性蛋白质的总称。作为代表性的白蛋白，可以举出卵清蛋白、乳汁中的乳清蛋白、血清白蛋白、小麦·大麦的麦清蛋白、蓖麻(蓖麻)种子中的蓖麻蛋白等。其中，特别优选血清白蛋白，进而优选牛血清白蛋白。不过，不被这些白蛋白所限定。白蛋白在RNA扩增反应时只要在反应系统中含有即可。因而，白蛋白可以在例如加热处理及pH调节后的样本处理液、扩增用反应液以及加热处理及pH调节后的样本处理液与扩增用反应液的混合物的任意一种中添加。另外，白蛋白即使没有在最终反应液中均一地加入的状态(例如在加热处理及pH调节后的样本处理液中加入白蛋白，没有进行搅拌而使其与RNA扩增反应液混合的情况等)下，也具有相同的效果。关于白蛋白的所述事项在特开2001-8685号公报中有详述，对于白蛋白的使用量，也可以参考该改变。

作为非离子性表面活性剂，例如可以从聚氧乙烯山梨糖醇酐一月桂酸酯及聚氧乙烯异辛基苯醚中选择。作为聚氧乙烯山梨糖醇酐一月桂酸酯，可以举出聚氧乙烯山梨糖醇酐(20)一月桂酸酯(Tween20)。作为聚氧乙烯异辛基苯醚，可以举出聚氧乙烯(9)异辛基苯基醚(Nonidet P-40，(NP-40))、聚氧乙烯(10)异辛基苯甲醚(Triton×100)。

关于非离子性表面活性剂的所述事项在特开平10-80279号公报中有详述，对于非离子表面活性剂的使用量，可以参考该公报。

作为RNA扩增法的顺序，可以使用所述记载的处理试剂加热处理样本，混合得到的样本处理液和反应液，适当地调节pH，然后基于公知的方法进行扩增反应。

在RT反应中，在适合选择的引物和逆转录酶的反应温度下，进行30分钟～1小时左右的反应。在PCR中，通过反复进行利用热变性使DNA成为1根链的DNA的变性(denaturation)工序；使夹持需要扩增的区域的引物杂交的退火(annealing)工序；以及在脱氧核糖核苷酸类的共存下使DNA聚合物发挥作用，进行引物的延长反应的聚合(polymerization)工序的3个工序，扩增引物夹持的区域。

7.效果

如果利用本发明的RNase失活方法以及RNA提取方法，可以进行生物样本中的RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取，所以可以不进行生物样本中的RNA包含体的纯化而简便·稳定地得到RNA的样本处理液。进而，对于提取的RNA而言，可以抑制生物样本中含有的蛋白等夹杂物引起的吸附·包埋之类的影响。所以，本发明的RNA提取方法在之后的RNA的检测或分析等中是有效的。即，对样本处理液，可以不进行任何处理或者只进行稀释、pH的调节、加入添加物等最低限度的处理，提供到RNA检测或分析等接下来的工序。因而，通过进行本发明的方法，不必担心在以往进行的RNA的提取、纯化时等中担心的RNase引起的RNA的分解的影响，简便·迅速地进行那样的工序成为可能。例如，本发明可以作为用于RNA纯化的前阶段使用。

如果利用本发明的RNA检测方法，通过进行生物样本时的RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取，简便·稳定地·有效地扩增样本中存在的RNA成为可能。接着，即使在样本处理液中含有核酸合成的妨碍物质的情况下，通过稀释、pH的调节、在扩增反应液中含有适合的添加物等，缓和或抑制相对核酸合成的妨碍物质的作用，简便·稳定地·有效地扩增样本中存在的RNA成为可能。

另外，通过使用本发明在，简便·迅速地分析生物样本中隐藏的外来生物(例如作为RNA病毒，逆转录酶病毒(艾滋病毒(HIV)等)、诺罗病毒(SRSV)、轮状病毒、丙型肝炎病毒(HCV)等以及真菌、细菌等)或变异细胞(例如癌细胞等)成为可能。进而，通过使用本发明，简便·迅速地进行在在细胞中转录的mRNA等的检测或利用碱基序列决定的表达基因的分析、进而利用cDNA的克隆的表达产物的分析以及生产等成为可能。进而，如果对大气·土壤·水等环境样本使用本发明，则也可以向环境样本中的微生物检查等开展。

另外，利用本发明的处理试剂提取的RNA在本处理试剂中的保存或中和处理之后的保存等中是可能的。

实施例

以下利用实施例对本发明进行更详细说明，但本发明不被这些所限定。

<实施例1>

在本实施例中，将在人血清(含有RNase)中添加RNA包含体的模型标本用作样本，在样本中添加蒸馏水(比较用)、NaOH水溶液(比较用)、DTT水溶液(比较用)或作为本发明的处理试剂的NaOH-DTT水溶液，加热处理，然后进行RNA提取的确认。

具体而言，作为RNA包含体，使用Ambion公司Armored RNA丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)(基因类型(Genotype)2b)目录(Catalog)#：42011。准备等量混合人血清和Armored RNA丙型肝炎病毒液体(v/v)而成的模型标本作为样本。在0.5ml管中加入4μl，准备4管，在各管内加入(1)蒸馏水(比较用)、(2)10mMNaOH水溶液(比较用)、(3)10mMDTT水溶液(比较用)或(4)含有作为本发明的处理试剂的10mM NaOH以及10mM DTT的水溶液16μl，在85℃下加热1分钟。

作为RNA提取的确认，将加热处理后的各样本处理液作为模板，使用对HCV-RNA特异的引物，进行RT-PCR。

具体而言，在加热处理后立即在每50μl的反应液中加入所述样本处理液1μl，进行RT-PCR。RT反应的引物使用具有与HCV RNA互补的碱基序列的寡核苷酸，在接着进行的PCR中，补加具有与用RT反应合成的cDNA互补的碱基序列的寡核苷酸，进行。本实验的RT-PCR中的RNA来源的产物为244bp。使用的引物序列如下所述。

(5’引物)5’-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3’(序列编号：1)

(3’引物)5’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(序列编号：2)

RT反应液使用的是在10mM Tris-HCl、35mM KCl、1.5mM MgCl₂、各200μM的dATP、dCTP、dGTP以及dTTP、2mM DTT、0.4μM的3’引物、50单位(units)/50μl的RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)(Takara Bio，Shiga，Japan)以及50单位/50μl的AMV XL逆转录酶(TakaraBio，Shiga，Japan)中添加1mM的三亚乙基四胺和0.5μg/ml的肝素钠的反应液。

RT反应在55℃下进行30分钟。反应后，在95℃下处理5分钟，使逆转录酶失活。

RT反应后，在所述RT反应液中分别添加20pmol的5’引物以及1.25units的Taq DNA聚合酶(PlatinumTaq：Invitrogen，CA，USA)，进行PCR。

PCR在94℃2分钟后、94℃30秒、60℃30秒、72℃60秒的条件下进行40个循环，最后在72℃下进行7分钟的聚合。

PCR结束之后，使用反应液5μl，在含有2.5％琼脂糖的添加0.5μg/ml溴乙锭(Ethidium bromide)的TAE(40mM Tris-acetate，1mM EDTA)液体中进行电泳，进行检测。扩增产物的电泳图如图1所示。图1中，M为分子量标准(size marker)(用HincII切断的250ng的ΦX174-RFDNA)，1、2、3及4分别是使用蒸馏水(比较用)、10mM NaOH水溶液(比较用)、10mM DTT水溶液(比较用)以及10mM NaOH-10mM DTT水溶液(本发明的处理试剂)的结果。

如图1所示，在标本中添加本发明的处理试剂的情况下，(第4道)可以得到HCV RNA的特异的244bp的扩增产物(图中箭头)。

<实施例2>

在本实施例中，将在实施例1中得到的4种样本处理液冷藏保存1天之后，与实施例1同样地进行RT-PCR，观察提取后的RNA的贮存稳定性。RT反应、PCR反应以及电泳条件与实施例1相同。扩增产物的电泳图如图2所示。图2中，M为分子量标准(用HincII切断的250ng的ΦX174-RF DNA)，1、2、3及4分别是使用蒸馏水(比较用)、10mM NaOH水溶液(比较用)、10mM DTT水溶液(比较用)以及10mM NaOH-10mMDTT水溶液(本发明的处理试剂)的结果。

如图2所示，即使提取处理后经过1天，使用本发明的处理试剂的情况下，(第4道)可以得到HCV RNA的特异的244bp的扩增产物(图中箭头)。这表明利用本发明的处理试剂提取后的RNA稳定地存在。

以上的实施例1及2的结果表明，利用本发明的处理试剂，可以分析血清中病毒的RNA。因而，确认了通过使用本发明的处理试剂，用简便的操作从生物样本等中含有的RNA包含体中提取RNA成为可能。

<实施例3：加热处理的温度及时间的影响(1)>

在1.5mL的萨尔施泰特(SARSTEDT)管中分注HCV阳性(约100IU/ml)的血浆标本100μL，进而加入50μL的PEG水溶液(与Roche·Diagnostics K.K.株式会社“Amplicor^(R)HBV monitor用，标本处理用试剂”一起包装的HBV SOLA。以下，在实施例4、5、6、7中相同)，搅拌。利用台式(benchtop)微量离心机，对其进行15000rpm、5分钟离心分离，除去上清。在剩下的沉淀中添加含有12mM NaOH、10mM DTT以及6μg/ml肝素钠的水溶液100μL作为处理试剂，利用涡流(vortex)充分地搅拌，利用下表所示的条件进行保温(incubate)。加温后立即将管内的样本处理液50μL与在其他管中准备的Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒(kit)的Master Mix50μL混合，利用GeneAmp9600(Applied Biosystems)，按照Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒的说明书所示的定性法的顺序测定HCV信号(OD)。结果如数据(data)1及图3所示。数据1标明作为HCV信号的消光度。此外，在数据1中，为了进行再次证实，显示了共2次的测定结果。图3是将消光度作为纵轴、将加热时间作为横轴表示数据1在各温度下的平均值的曲线图。

[表1]

数据1

如所述数据1所示，可知热处理在利用本法的HCV检测中是有效的。结果显示，利用本发明的方法，RNase失活而且从HCV病毒内部取出HCVRNA，成为RT-PCR的模型。

如图3所示，表明用15秒左右的加热检测RNA成为可能，对于加热时间，可以对应加热温度适当选择。

<实施例4：加热处理的温度为85℃时的加热时间的影响>

在1.5mL的萨尔施泰特管中分注HCV阳性(约1,000IU/ml)的血浆标本100μL，进而加入50μL的PEG水溶液，搅拌。利用台式微量离心机，对其进行15000rpm、5分钟离心分离，除去上清。在剩下的沉淀中添加含有12mM NaOH、12mM DTT以及6μg/mL肝素钠的水溶液100μL作为处理试剂，利用涡流充分地搅拌，利用下表所示的时间在85℃下加温。加温后立即将管内的样本处理液50μL与在其他管中准备的Amplicor^(R)HCVv2.0试剂盒的Master Mix50μL混合，利用GeneAmp9600(AppliedBiosystems)，按照Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒的说明书所示的定量法的顺序测定HCV信号(总(total)OD)。结果如数据(data)2及图4所示。

[表2]

数据1

时间(秒)	60	80	100	120	140	160	180	200	220	240	260	280
													TOD	3.73	9.79	9.66	9.78	8.98	9.08	4.81	6.44	4.49	4.21	3.12	4.40

如所述数据2所示，利用80秒～160秒的处理时间可以得到最高水平的检测灵敏度。

<比较例1>

为了验证本发明的检测方法的有效性，从与所述实施例4相同的标本，按照Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒的说明书所示的定量法的顺序测定总OD。在比较例1中，通过进一步证实5次该操作，进行共6次的测定。各测定结果如果用作为HCV的信号的总OD(消光度)表示，为0.75、0.76、1.14、0.77、1.30以及1.06。这6次测定值的平均为0.96。

在比较例1中进行的Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒说明书的方法从血浆100μL得到100μLRNA提取液(即，在实施例4中得到的RNA提取液的10倍浓)。因而，由于比较例1中的总OD为0.96，所以实施例4中的总OD假如为9.6，则可以说得到了与以往法同等的灵敏度。

实际上，在实施例4中，利用80～160秒的热处理时间，可以得到9～10范围的总OD。所以，实施例4为代表的本发明的方法可以得到不比比较例1所例示的以往法差的灵敏度。

<实施例5：加热处理的温度及时间的影响(2)>

在1.5mL的萨尔施泰特管中分注HCV阳性(约1,000IU/ml)的血浆标本100μL，进而加入50μL的PEG水溶液，搅拌。利用台式微量离心机，对其进行15000rpm、5分钟离心分离，除去上清。在剩下的沉淀中添加含有12mM NaOH、12mM DTT以及6μg/mL肝素钠的水溶液100μL作为处理试剂，利用涡流充分地搅拌，利用下表所示的条件进行保温。加温后立即将管内的样本处理液50μL与在其他管中准备的Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒(kit)的Master Mix50μL混合，利用GeneAmp9600(AppliedBiosystems)，按照Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒的说明书所示的定量法的顺序测定HCV信号(总OD)。总OD值(消光度的积分值)相对HCV的浓度(IU/ml)如以下的数据3及图5所示。图5是将加热时间作为横轴、将总OD作为纵轴表示数据3的曲线图。其中，近似线以实施例4的结果(图4)为基础记载。

[表3]

数据3

	1分钟	3分钟	5分钟
				60℃	0.16	0.74	1.37
70℃	0.52	3.36	2.73
				80℃	1.51	3.82	3.42
85℃	2.90	4.55	2.66

从数据3可知，即使利用60℃的加热温度，也可以得到信号，检测HCV的RNA是可能的。

从图5可以容易地想到，即使为60℃以下的温度，通过进行长时间例如5分钟以上的加热，HCV的RNA的检测是可能的。另外，还可以容易地想到，即使为高于85℃的加热温度，通过进行短时间例如30秒～3分钟的加热，HCV的RNA的检测是可能的。

在实施例3～5中，加热温度为80℃～85℃时，可以得到加热时间的依赖性低的稳定的信号，此外，而且为高灵敏度。所以，可以说，在实施例3～5所示的条件的基础上，80℃～85℃为特别优选的温度条件。温度条件为80℃～85℃的情况下，加热时间可以为30秒～10分钟，进而优选为30秒～5分钟，更优选为80秒～160秒。

<实施例6>

在实施例6中，在已知HCV阳性的3种血浆标本(约100、500、5000IU/ml)及已知HCV阴性的血浆标本共4种血浆标本中，添加PEG水溶液，进行离心操作，然后将得到的沉淀物用作样本。在来自血浆的PEG水溶液沉淀物中，不仅病毒而且很多血浆成分也沉淀，其中，还存在RNase。对各样本，按照本发明的方法，进行RNase的失活以及从RNA包含体内部的RNA提取，使用HCV RNA特异的引物，进行RT-PCR。

具体而言，在1.5mL的萨尔施泰特管中分注血浆标本100μL，进而加入50μL的PEG水溶液，搅拌。利用台式微量离心机，对其进行15000rpm、5分钟离心分离，除去上清。在剩下的沉淀中添加含有12mM NaOH、12mMDTT以及6μg/mL肝素钠的水溶液100μL作为处理试剂，利用涡流充分地搅拌，在85℃下保温2分钟。加温后立即将管内的样本处理液50μL与在其他管中准备的Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒(Roche·Diagnostics K.K.)的Master Mix50μL混合，利用GeneAmp9600(Applied Biosystems)，按照Amplicor^(R)HCV v2.0试剂盒的说明书进行RT-PCR。在RT-PCR之后，也按照试剂盒的说明书，以规定的顺序定量HCV信号。TOD值(消光度的积分值)相对HCV的浓度(IU/ml)如以下的数据4所示。

[表4]

数据4

HCV浓度(IU/ml)	0	100	500	5000
					HCV TOD值	0.06	0.58	4.01	51.63

如所示数据4所示，在阳性标本中，可以得到信号，检测HCV的RNA是可能的。结果显示，利用本发明的方法，RNase失活，而且可以从HCV病毒内部取出HCV RNA，成为RT-PCR的模板。

另外，可以得到依赖于HCV浓度的HCV TOD值，由此表明定量地检测了HCV RNA。

<实施例7>

在本实施例中，使用已知HIV阳性的血浆标本(约700拷贝(copy)/ml)以及已知HIV阴性的血浆标本2种标本。对各标本进行利用PEG水溶液的离心操作，将得到的沉淀物作为样本使用。对各样本，按照本发明的方法，进行RNase的失活以及从RNAA包含体内部的RNA提取，使用HIV RNA特异的引物，进行RT-PCR。

在1.5mL的萨尔施泰特管中分注血浆50μL，进而加入25μL的PEG水溶液，搅拌。利用台式微量离心机，对其进行15000rpm、5分钟离心分离，除去上清。在剩下的沉淀中添加含有12mM NaOH、12mM DTT以及6μg/mL肝素钠的水溶液100μL作为处理试剂，利用涡流充分地搅拌，在85℃下保温2分钟。加温后立即将管内的样本处理液50μL与在其他管中准备的Amplicor^(R)HIV monitor v1.5试剂盒(Roche·Diagnostics K.K.)的Master Mix50μL混合，利用GeneAmp9600(Applied Biosystems)，按照Amplicor^(R)HIV v1.5试剂盒的说明书进行RT-PCR。在RT-PCR之后，也按照试剂盒的说明书，以规定的顺序定量HIV-1信号。TOD值相对HIV的拷贝/ml如以下的数据5所示。

[表5]

数据5

HIV拷贝/ml	0	700
			HIV TOD值	0.05	1.10

如所示数据5所示，在阳性标本中，可以得到信号，检测HIV的RNA是可能的。

在下述实施例8及9中，将在人血清中添加RNA包含体而成的产物作为模型标本(在血清中含有RNase)。在此，RNA包含体使用AmbionDiagnostics公司制Armored RNA Hepatitis C Virus(丙型肝炎病毒)(基因类型2b)in TSM III Buffer Amplicor HCV monitor Qualified PositiveConntrol(Cat#42011)。在本实施例中的模型标本是以1∶1的体积比混合所述RNA包含体-TSM III缓冲液与人血清来配制的。所述RNA包含体-TSM III缓冲液的浓度被规定为“在血浆中添加5(v/v)时，为73,000IU/ml”，如果与血清1∶1(体积比)混合，则为730IU/μL。

另外，对RNA的检测，首先使用Amplicor^(R)HCV v2.0扩增试剂盒(set)(Roche·Diagnostics K.K.公司制)，进行。RT-PCR的温度程序按照厂家(maker)的推荐法进行，将PCR反应的循环数设为38。

基因扩增后，使用琼脂糖电泳进行检测。电泳照片中的“M”表示DNA分子量标准。在此使用的DNA分子量标准为ΦX174 HincII digest。

<实施例8>

本实施例是表明能够用含有碱性物质和还原剂的处理试剂提取标本中的RNA的例子。

在200μL容量的塑料管中混合2μL模型标本、8μL表6所示的各处理试剂(15种)，85℃下热处理3分钟。向其中添加90μLTE Buffer(pH8.0)其中的5μL与5μLAmpliMIX(以7∶1的比率混合Roche ·Diagnostics K.K.公司AmplicorHCV v2.0扩增试剂盒中含有的HCV Master Mix v2.0与HCV锰试液而成的产物)混合，进行RT-CPT。此外，各处理试剂(模型标本添加之前)的pH及模型标本-处理试剂混合物(模型标本添加之后)的pH(均在25℃下测定)也如表6所示。

[表6]

另外，琼脂糖电泳照片如图6所示。进而，图17表示各条件下的热处理后的样子的照片。在图17中，上段为使用DTT 0mM的处理试剂的结果，从左开始是使用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]的处理试剂的结果。下段为使用DTT 20mM处理试剂的结果，从左开始是使用[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]的处理试剂的结果。

如图6所示，处理试剂只在含有还原剂和碱双方的情况下，可以检测RNA。

在[15]中没有检测到可能是因为RNA被加水分解。发生RNA加水分解可能是因为提取的RNA被暴露于加热温度(85℃)和pH(10.1)双方的高条件下。为了成为有效地提取RNA此外而且不加水分解露出的RNA的条件，只要调节成以下条件即可。即，通过调节NaOH浓度或Buffer剂的种类或浓度，进行降低pH(优选所述的[10]～[14]的条件)；降低温度(例如通过不进行加热而使检测RNA成为可能，此点已被本发明人等确认)；或者不改变温度及NaOH浓度而进一步添加螯合EGTA等2价离子的螯合剂(下述实施例9)即可。

在加入DTT的情况下，处理试剂的pH降低，这是因为，在碱性区域，DTT发挥酸的作用。

在图17中，在[8]、[9]的中性区域的条件的情况下，可见变性蛋白质的白色沉淀显著可见，但随着使用的处理试剂的pH变高，透明度增加。这样，作为在中性区域不能检测出RNA的原因，可能是因为变性蛋白质等夹杂成分吸附于并包埋RNA。另一方面，作为在[15]的条件下不能检测出RNA的原因，如上所述，不是变性蛋白质的影响，而是RNA的加水分解引起的。

<实施例9>

本实施例是表明EGTA减低RNA在热碱条件下的加水分解的例子。已知2价金属离子促进RNA的加水分解。根据成为本发明的对象的标本不同，由于含有2价金属离子而向处理试剂中添加螯合其的螯合剂(EGTA等)是有效的。

作为处理试剂，准备表6所示的处理试剂[12]和向其中加入EGTA5mM的处理试剂两种。在200μL容量塑料管中取模型标本2μL，向其中添加8μL的各处理试剂，混合。此时，作为处理温度，探讨了25℃(比较用)、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃以及100℃，作为处理时间，探讨了1分钟、3分钟、10分钟、30分钟以及60分钟的条件。处理后，向其中添加TE Buffer(pH8.0)90μL，混合其中的5μL和AmpliMIX5μL，进行RT-PCR。

得到的电泳照片如图7(处理试剂中的EGTA浓度为0mM)以及图8(处理试剂中的EGTA浓度为5mM)所示。

如图7及8所示，在处理试剂不含有EGTA的情况下，在30分钟以上的热处理下几乎没有发现信号。但是，在向处理试剂中添加EGTA的情况下，即使经过1小时的热处理，也可以检测出信号。通过添加EGTA，RNA的加水分解的速度显著地变小。

利用本实施例可知，在向处理试剂中添加螯合2价的金属离子的螯合剂的情况下，加热处理中的温度可以设定为65℃～100℃，进而优选为70℃～100℃，更优选为70℃～95℃。

<实施例10>

以20％(w/v)浓度在生理盐水中悬浮诺罗病毒阴性的健康人的粪便，使用微量离心机，离心分离5分钟悬浮液，得到上清。在得到的上清198μL中，添加疑似诺罗病毒RNA包含体(Armored RNA^(R)NorwalkVirus(GenogroupII)in TSMIII Buffer：Ambion Diagnostics)2μL，配制疑似诺罗病毒阳性的粪便样本液。在管内混合该样本液10μL和处理试剂10μL，使最终液量成为20μL，然后在85℃下加热处理5分钟。这样地进行，得到样本处理液。

在RT-PCR的RT反应中，混合25μL Ampdirect^(R)Plus(P/N：241-08800-98：岛津制作所)、0.4μM疑似诺罗病毒RNA用反向引物(reverseprimer)(5’-ACTGACAATTTCATCATCACC-3’：序列编号3)以及3.75U AMV逆转录酶，得到RT-PCR反应液，混合其中的25μL和所述样本处理液20μL，在42℃、1小时的条件下反应。在95℃、2分钟的条件下进行酶失活处理，然后向RT反应后的管中混合0.2μM疑似诺罗病毒RNA用正向引物(forward primer)(5’-TGGAATTCCATCGCCCACTGG-3’：序列编号4)以及1.25U Nova Taq(TM)Hot Start DNA Polymerase(EMD Biosciences)，最终液量成为50μL。PCR在95℃、5分钟的预热(preheating)之后进行40个循环的92℃30秒、58℃30秒以及72℃1分钟的循环，然后，以进行72℃7分钟的聚合的温度程序进行。

此外，在本实施例10中，作为处理试剂，配制具有下述表7中记载的组成的8种处理试剂A-1～A-8，对8种分别进行所述操作。在这些处理试剂中，A-2～A-8是本发明中的处理试剂，A-1是用于比较而配制的处理试剂。

[表7]

处理试剂	处理试剂的NaOH浓度	处理试剂的DTT浓度	处理试剂单独的pH	处理试剂+粪便(混合比1∶1)的pH
					A-1(比较用)	0mM	20mM	7.5	6.5
A-2	10mM	20mM	9.1	8.4
					A-3	20mM	20mM	9.8	9.4
A-4	30mM	20mM	10.2	9.9
					A-5	40mM	20mM	11.4	10.5
A-6	50mM	20mM	12.0	11.1
					A-7	60mM	20mM	12.3	11.6
A-8	70mM	20mM	12.5	11.8

PCR产物的检测使用反应结束后的反应液5μL，利用在含有2.5％琼脂糖凝胶的添加0.5μg/mL溴乙锭的TAE(40mM Tris-acetate，1mMEDTA)液体中的电泳进行。

利用实施例10得到的电泳图如图9所示。图中，M道为分子量标准(Φ×174RF DNA的Hinc III消化物)，第1道为使用处理试剂A-1的结果，第2道为使用处理试剂A-2的结果，第3道为使用处理试剂A-3的结果，第4道为使用处理试剂A-4的结果，第5道为使用处理试剂A-5的结果，第6道为使用处理试剂A-6的结果，第7道为使用处理试剂A-7的结果以及第8道为使用处理试剂A-8的结果。

<实施例11>

作为处理试剂，配制具有以下组成的7种处理试剂B-1～B-7，除了分别使用这些处理试剂以外，进行与实施例10相同的操作。在这些处理试剂中，B-2～B-7为本发明中的处理试剂，B-1为用于比较而配制的处理试剂。

B-1.30mM NaOH，0mM DTT(比较用)

B-2.30mM NaOH，5mM DTT

B-3.30mM NaOH，10mM DTT

B-4.30mM NaOH，20mM DTT

B-5.30mM NaOH，30mM DTT

B-6.30mM NaOH，40mM DTT

B-3.30mM NaOH，50mM DTT

利用实施例11得到的电泳图如图10所示。图中，M道为分子量标准(Φ×174RF DNA的Hinc III消化物)，第1道为使用处理试剂B-1的结果，第2道为使用处理试剂B-2的结果，第3道为使用处理试剂B-3的结果，第4道为使用处理试剂B-4的结果，第5道为使用处理试剂B-5的结果，第6道为使用处理试剂B-6的结果，第7道为使用处理试剂B-7的结果。

在所述实施例10以及11中可知，在处理试剂中，优选含有20mM～60mM NaOH，5mM～50mM DTT。

<实施例12>

<1>使用没有纯化RNA的粪便样本的RNA检测

以20％(w/v)浓度，用生理盐水悬浮诺罗病毒感染者的粪便，利用微量离心机，离心分离5分钟，得到上清。

另一方面，以20％(w/v)浓度，用生理盐水悬浮诺罗病毒阴性的健康人的粪便，利用微量离心机，离心分离悬浮液5分钟，得到上清。

相对感染者粪便来源的上清，使用健康人粪便来源的上清，进行10倍阶梯稀释，配制6种粪便样本液D-1～D-6。具体而言，D-1的稀释比例为1倍，D-2的稀释比例为10倍，D-3的稀释比例为10²倍，D-4的稀释比例为10³倍，D-5的稀释比例为10⁴倍，D-6的稀释比例为10⁵倍。

作为处理试剂，使用具有30mM NaOH、20mM DTT、10mM EGTA的组成的处理试剂。

加入进行阶梯稀释的所述粪便样本液10μL和所述处理试剂10μL，搅拌，然后在85℃下加热5分钟。

在RT-PCR的RT反应中，Ampdirect^(R)Plus(P/N：241-08800-98：岛津制作所)、0.4μM诺罗病毒RNA用反向引物(5’-TGTCACGATCTCATCATCACC-3’：序列编号5)以及3.75U AMV逆转录酶，得到RT-PCR反应液，混合其中的25μL和所述样本处理液20μL，在42℃、1小时的条件下反应。在95℃、2分钟的条件下进行酶失活处理，然后向RT反应后的管中混合0.2μM诺罗病毒RNA用正向引物(5’-TGGAATTCCATCGCCCACTGG-3’：序列编号4)以及1.25U Nova Taq(TM)Hot Start DNA Polymerase(EMD Biosciences)，最终液量成为50μL。PCR在95℃、5分钟的预热之后进行40个循环的92℃30秒、58℃30秒以及72℃1分钟的循环，然后，以进行72℃7分钟的聚合的温度程序进行。

PCR产物的检测使用反应结束后的反应液5μL，利用在含有2.5％琼脂糖凝胶的添加0.5μg/mL溴乙锭的TAE(40mM Tris-acetate，1mMEDTA)液体中的电泳进行。

利用<1>得到的电泳图如图11所示。图中，第1道为使用粪便样本液D-1的结果，第2道为使用粪便样本液D-2的结果，第3道为使用粪便样本液D-3的结果，第4道为使用粪便样本液D-4的结果，第5道为使用粪便样本液D-5的结果，第6道为使用粪便样本液D-6的结果。第7道为阴性对照(Negative Control)，即代替诺罗病毒感染者粪便而使用诺罗病毒非感染的健康人粪便，除此以外，进行相同的操作的结果。M道为分子量标准(Φ×174 RF DNA的Hinc III消化物)。

<2>使用从粪便样本纯化的RNA的RNA检测

相对在所述<1>中得到的各稀释感染者粪便来源的上清，通过适用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)进行RNA纯化，将其作为相对所述<1>的粪便样本液D-1～D-6的对照，作为6种纯化RNA液E-1～E-6。具体而言，E-1为对应D-1的纯化RNA液(1倍)，E-2为对应D-2的纯化RNA液(10倍)，E-3为对应D-3的纯化RNA液(10²倍)，E-4为对应D-4的纯化RNA液(10³倍)，E-5为对应D-5的纯化RNA液(10⁴倍)，E-6为对应D-6的纯化RNA液(10⁵倍)。

代替粪便样本液D-1～D-6，分别使用纯化RNA液E-1～E-6，除此以外，进行与所述<1>相同的操作。

利用<2>得到的电泳图如图12所示。图中，第1道为使用纯化RNAE-1的结果，第2道为使用纯化RNA液E-2的结果，第3道为使用纯化RNA液E-3的结果，第4道为使用纯化RNA液E-4的结果，第5道为使用纯化RNA液E-5的结果，第6道为使用纯化RNA液E-6的结果。第7道为阴性对照(Negative Control)，即代替诺罗病毒感染者粪便而使用诺罗病毒非感染的健康人粪便，除此以外，进行相同的操作的结果。M道为分子量标准(Φ×174RF DNA的Hinc III消化物)。

基于图11及图12，对使用不纯化RNA的粪便样本的情况和使用从粪便样本纯化的RNA的情况，比较RNA检测的灵敏度·特异性，两个样本的检测极限均为稀释比例10⁴倍。

在粪便上清中，不仅病毒，而且还漂浮很多细菌或生物来源物质，其中，还存在大量RNA分解酶。所述实施例所示的结果可以通过如下所述来解释，即：利用本发明的实施，在粪便中大量存在的RNA分解酶的失活和从RNA病毒的RNA提取、进而RT-PCR妨碍物质的控制有效地发挥了作用。

<实施例13>

对分别来源于感染了诺罗病毒的18种不同标本(标本编号1～18)的18种诺罗病毒阳性粪便，进行与实施例12的<1>相同的操作。得到的电泳图如图13所示。图13中，道的数字分别相当于标本编号。M道为分子量标准(Φ×174 RF DNA的Hinc III消化物)。

另一方面，对分别来源于没有感染诺罗病毒的10种不同标本(标本编号19～28)的10种诺罗病毒阴性粪便，进行与实施例12的<1>相同的操作。得到的电泳图如图14所示。图14中，道的数字分别相当于标本编号。M道为分子量标准(Φ×174 RF DNA的Hinc III消化物)。

如图13及图14所示，从诺罗病毒阳性粪便样本全部检测出(18个标本中的18个标本)特异产物。另一方面，从诺罗病毒阴性粪便样本全部(10个标本中的10个标本)没有检测出疑似产物。

<实施例14>

作为处理试剂，使用具有30mM NaOH、20mM DTT、10mM EGTA的组成的处理试剂，在20℃～100℃的各种温度以及1分钟～60分钟的各种时间的条件下，进行加热处理，除此以外，进行与实施例10相同的操作。

利用实施例14得到的电泳图如图15所示。在图15中，5个道对应加热处理时间为1min(分钟)、5min、15min、30min以及60min的情况，在各道中，表示加热处理温度为25℃(比较用)、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃以及100℃的情况的结果。

利用实时定量PCR，对扩增的RNA进行定量。具体而言，在得到的RT-PCR反应液中添加10×SYBR(TM)Green(分子探针(MolecularProbes))，作为温度程序，在95℃5分钟的预热之后，进行30个循环92℃30秒、58℃30秒以及72℃1分钟的循环，然后，实行72℃7分钟的聚合。第30个循环的荧光强度如图16所示。在图16中，横轴表示热处理温度(℃)，纵轴表示荧光强度(相对荧光强度：RFU)。

在本实施例中，通过添加EGTA，RNA的加水分解的速度也显著地变小，在宽范围的加热条件下稳定的RNA的检测成为可能。

在所述实施例中，对本发明的范围中的具体方式进行了描述，但本发明不限定于这些，可以以其他各种方式实施。所以，所述实施例从任何方面出发均为简单的例示，不是限定解释。进而，属于要求(claim)的均等范围的变更全部在本发明的范围内。

此外，在序列表文本(free text)(人工序列的记载(Description ofArtificial Sequence))中，序列编号1～5为合成引物。

(产业上的可利用性)

利用本发明，可以提供一种使普遍存在于生物样本、环境样本等样本或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本等样本中的RNase失活的方法。

利用本发明，还可以提供一种有效地从存在于生物样本、环境样本等样本中或从其中进行RNA包含体的分离等得到的生物来源样本等样本中的RNA包含体中提取RNA的方法。

利用本发明，还可以提供一种通过在一个工序中进行该样本中的RNase的失活和从RNA包含体内部的RNA提取，使简便·稳定地·有效地而且迅速地扩增存在于样本中的RNA成为可能。接着，通过抑制对核酸合成有妨碍的物质的作用，使简便·稳定地·有效地而且迅速地扩增存在于样本中的RNA成为可能。这样，可以提供一种简便·稳定地·有效地而且迅速地检测样本中的RNA的方法。

利用本发明，还可以提供一种可以在这些方法中使用的处理试剂。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>SHIMADZU CORPORATION

<120>Method for Extracting RNA and Detecting RNA

<130>G106209 WO

<150>JP 2005-319332

<151>2005-11-02

<150>JP 2005-319333

<151>2005-11-02

<150>JP 2005-319334

<151>2005-11-02

<150>JP 2006-116310

<151>2006-04-20

<160>5

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic primer

<400>1

cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt                                    30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic primer

<400>2

ctcgcaagca ccctatcagg cagtaccaca                                        30

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic primer

<400>3

actgacaatt tcatcatcac c                                                 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic primer

<400>4

tggaattcca tcgcccactg g                                                 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>synthetic primer

<400>5

tgtcacgatc tcatcatcac c                                                 21

Claims (22)

1.一种RNA的提取方法，其中，

包括：

在加热条件下得到含有RNA包含体及RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂的pH为8.1以上的混合物的工序；

通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活和从RNA包含体提取RNA的工序。

2.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述处理试剂含有从Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液构成的组中选择的碱性缓冲液。

3.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述处理试剂含有从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择的碱性物质。

4.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述还原剂为硫醇型还原剂。

5.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述样本从生物样本、生物来源样本、环境样本以及环境来源样本构成的组中选择。

6.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述样本从排泄物样本及排泄物来源样本构成的组中选择。

7.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述RNA包含体从细胞、真菌、细菌以及RNA病毒构成的组中选择。

8.根据权利要求7所述的RNA提取方法，其中，

所述RNA病毒从逆转录酶病毒(retrovirus)、诺罗病毒(norovirus)、轮状病毒(rotavirus)以及丙型肝炎病毒构成的组中选择。

9.根据权利要求8所述的RNA提取方法，其中，

在所述RNA病毒为逆转录酶病毒的情况下，所述逆转录酶病毒为艾滋病毒。

10.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其中，

所述RNA为mRNA。

11.一种RNA提取方法，其中，

包括：

在至少含有还原剂的溶液中混杂含有RNA包含体及RNA分解酶的样本的工序；

将所述样本与所述还原剂的混合液调节至25℃下pH为8.1以上的工序；

通过将已调节pH的所述混合液提供到加热条件下，来进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体提取RNA的工序。

12.一种RNA检测方法，其中，

包括：

在加热条件下得到含有RNA包含体及RNA分解酶的样本与至少含有还原剂的碱性处理试剂的pH为8.1以上的混合物的工序；

通过在所述加热条件下维持所述混合物来进行所述RNA分解酶的失活和从RNA包含体提取RNA，从而获得含有提取的RNA的样本处理液的工序；

混合所述样本处理液和扩增用反应液来进行RNA扩增反应。

13.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述处理试剂含有从Tris缓冲液、Good缓冲液、硼酸盐缓冲液以及碳酸盐缓冲液构成的组中选择的碱性缓冲液。

14.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述处理试剂含有从氢氧化物、氨以及胺构成的组中选择的碱性物质。

15.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述还原剂为硫醇型还原剂。

16.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述样本从生物样本、生物来源样本、环境样本以及环境来源样本构成的组中选择。

17.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述样本从排泄物样本及排泄物来源样本构成的组中选择。

18.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述RNA包含体从细胞、真菌、细菌以及RNA病毒构成的组中选择。

19.根据权利要求18所述的RNA检测方法，其中，

所述RNA病毒从逆转录酶病毒、诺罗病毒、轮状病毒以及丙型肝炎病毒构成的组中选择。

20.根据权利要求19所述的RNA检测方法，其中，

在所述RNA病毒为逆转录酶病毒的情况下，所述逆转录酶病毒为艾滋病毒。

21.根据权利要求12所述的RNA检测方法，其中，

所述RNA为mRNA。

22.一种RNA检测方法，其中，

包括：

在至少含有还原剂的溶液中混杂含有RNA包含体及RNA分解酶的样本的工序；

将所述样本与所述还原剂的混合液调节至25℃下pH为8.1以上的工序；

通过将已调节pH的所述混合液提供到加热条件下，来进行所述RNA分解酶的失活和从所述RNA包含体提取RNA，从而获得含有提取的RNA的样本处理液的工序；

混合所述样本处理液和扩增用反应液来进行RNA扩增反应的工序。

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