CN113215327A

CN113215327A - 一种检测gⅱ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113215327A
Application number: CN202110710205.9A
Authority: CN
Inventors: 周树青; 李君文; 杨栋; 谌志强; 金敏; 尹静; 陈郑珊; 师丹阳; 李海北; 杨忠委; 陈天姣; 王华然
Original assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Current assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法，属于诺如病毒检测技术领域，所述引物探针组，包括上游引物NVF6、下游引物NVR6和荧光探针NVP9；所述上游引物NVF6的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物NVR6的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述荧光探针NVP9的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本发明提供的引物探针组，能够特异性检测包括GⅡ.4、GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.17在内的GⅡ型诺如病毒，与星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒无交叉反应。本发明提供的检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组灵敏度高，最低检测限为1.22copies/μL。

Description

一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于诺如病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

诺如病毒是导致非细菌性肠胃炎进而引发大规模疫情的主要因素。诺如病毒是一种单股正链RNA病毒，直径约为27nm，成二十面体对称。诺如病毒基因组全长约7.6kb，编码3个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。开放阅读框1(ORF1)编码非结构蛋白，其翻译后被切割为6种蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)。开放阅读框2(ORF2)和开放阅读框3(ORF3)分别编码主要衣壳蛋白(Viral protein 1,VP1)和次要衣壳蛋白(Viral protein 2,VP2)。诺如病毒具有遗传和抗原多样性。根据VP1氨基酸序列，诺如病毒可被分为至少6个基因组(从GI 到GVI)和40个基因型。可感染人的诺如病毒按感染力由大到小依次为GⅡ、 GⅠ和GⅣ型。流行病学研究显示，诺如病毒变异速度快，每隔2～3年可出现新的变异株，在全世界范围广泛流行。目前，GⅡ.4型诺如病毒是全世界流行的优势病毒株。自2014年以来，GⅡ.17病毒株导致的疫情也大幅增加。因此，亟需建立针对GⅡ.4和GⅡ.17等基因型诺如病毒的快速检测方法。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)，是由Piepenburg等人在2006年建立的一种新型核酸等温扩增技术，在 22～45℃的恒温条件下，于20分钟内即可完成扩增反应，被称为是可以代替 PCR的核酸扩增技术。RPA高度灵敏、特异、快速，对设备无特殊要求，在恒温条件下就能启动扩增反应，在现场检测领域具有非常大的应用前景。因此，利用RPA技术建立GⅡ型诺如病毒的快速检测方法，对诺如病毒相关疾病的预防和控制具有重要作用。

但是目前现有技术中的方法检测的诺如病毒基因型单一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够同时检测GⅡ.4、GⅡ.3、GⅡ.6和GⅡ.17在内的GⅡ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组，包括上游引物 NVF6、下游引物NVR6和荧光探针NVP9；所述上游引物NVF6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物NVR6的核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示，所述荧光探针NVP9的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

优选的，所述荧光探针NVP9自5'端起第29位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基标记dSpacer，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1，3'末端标记 C3 Spacer。

本发明提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的试剂盒，包括所述的引物探针组。

优选的，所述试剂盒还包括诺如病毒质粒标准品和检测试剂。

优选的，所述诺如病毒质粒标准品包括初始质粒和诺如病毒特异性序列，所述诺如病毒特异性序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述初始质粒为pUC57质粒。

优选的，所述检测试剂包括恒温扩增反应缓冲液、重组酶、单链DNA 结合蛋白、链置换DNA聚合酶和醋酸镁。

本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测GⅡ型诺如病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样本的总RNA，将所述总RNA反转录获得cDNA；

2)将步骤1)获得的cDNA、所述的引物探针组中的上游引物NVF6、下游引物NVR6、荧光探针NVP9和检测试剂混合获得恒温扩增体系，然后进行恒温扩增检测扩增过程的荧光强度；

3)如果扩增过程中产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中含有GⅡ型诺如病毒；如果扩增过程中没有产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中没有GⅡ型诺如病毒，或者待检测样品中GⅡ型诺如病毒的数量没有达到检测限。

优选的，所述恒温扩增反应温度为39±0.1℃，所述恒温扩增反应的时间为20±5min。

优选的，所述恒温扩增体系，以50μL计，包括以下组分：

重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶冻干粉单管；

280mmol/L醋酸镁溶液 2.5μL。

本发明的有益效果：本发明提供的检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组，能够特异性检测包括GⅡ.4、GⅡ.3、GⅡ.6、GⅡ.17在内的GⅡ型诺如病毒，与星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒无交叉反应。本发明提供的检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组灵敏度高，最低检测限为1.22 copies/μL；本发明所述的检测方法相较于实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)等核酸检测技术，耗时更短，操作简便，可应用于现场检测。

附图说明

图1为荧光RPA引物筛选实验结果；

图2为荧光RPA探针筛选实验结果；

图3为荧光RPA特异性实验结果；

图4为荧光RPA灵敏性实验结果；

图5为实施例1中1～10例疑似诺如病毒阳性粪便样品检测结果；

图6为实施例1中11～20例疑似诺如病毒阳性粪便样品检测结果；

图7为实施例1中21～30例疑似诺如病毒阳性粪便样品检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组，包括上游引物 NVF6、下游引物NVR6和荧光探针NVP9；所述上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述荧光探针NVP9的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；具体如下：

上游引物NVF6：

5'-YAGCAAAATYAGYAAGYTRGTCATTGCAGARY-3'(SEQ ID No.1)

下游引物NVR6：

5'-GTCAYTCGACGCCATCTTCATTCACAAARC-3'(SEQ ID No.2)

探针NVP9：

5'-CGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAG AT-3'(SEQ ID No.3)；

其中R代表A或G，Y代表C或T。

在本发明中，所述荧光探针NVP9自5'端起第29位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基标记dSpacer(THF残基)，

exo试剂盒中的 Exonuclease III酶可以在双链中识别THF残基，并在THF位置切割探针，从而分离荧光团和猝灭剂产生荧光信号。第33位碱基标记淬灭基团BHQ1， 3'末端标记C3 Spacer；所述3'末端标记C3 Spacer的作用在于阻止探针延伸。

在本发明中，所述试剂盒还包括诺如病毒质粒标准品和检测试剂；所述诺如病毒质粒标准品优选的包括初始质粒和诺如病毒特异性序列，所述诺如病毒特异性序列优选的如SEQ ID No.4所示，具体如下：

5'-GCTGGGCGAGGCTGCACTCCACGGCCCGGCATTCTATAGCAAAA TTAGCAAATTAGTCATTGCAGAGTTGAAGGAAGGTGGCATGGATTTTTA CGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCT GAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGA AGATGGCGTCGAGTGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACC TCGTCCCAGAGGTCAACAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCCA-3'。

本发明所述的诺如病毒特异性序列来自GⅡ.4型诺如病毒，本发明对所述序列的制备方法没有特殊限定，采用常规的扩增方法或人工合成方法均可。在本发明具体实施过程中，委托生物技术公司进行所述诺如病毒特异性序列的全序列人工合成。在本发明中，所述初始质粒优选为pUC57质粒。本发明对所述诺如病毒质粒标准品的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可，在本发明具体实施过程中，委托生物技术公司进行所述诺如病毒质粒标准品的制备。

在本发明中，所述检测试剂优选的包括恒温扩增反应缓冲液、重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和醋酸镁。在本发明中，所述恒温扩增反应缓冲液、重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和醋酸镁优选的来自TwistAmp^TMexo Kit试剂盒。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的的检测GⅡ型诺如病毒的方法，包括以下步骤：1)提取待检测样本的总RNA，将所述总RNA反转录获得 cDNA；2)将步骤1)获得的cDNA、所述的引物探针组中的上游引物NVF6、下游引物NVR6、荧光探针NVP9和检测试剂混合获得恒温扩增体系，然后进行恒温扩增检测扩增过程的荧光强度；3)如果扩增过程中产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中含有GⅡ型诺如病毒；如果扩增过程中没有产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中没有GⅡ型诺如病毒，或者待检测样品中GⅡ型诺如病毒的数量没有达到检测限。

在本发明中，提取待检测样本的总RNA，将所述总RNA反转录获得 cDNA。在本发明中，所述待检测样本优选为粪便样品。本发明对所述待检测样本的总RNA提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的RNA提取方法即可，在本发明具体实施过程中，利用德国QIAGEN公司的

Viral RNA Mini Kit(型号为52904)提取样品中的病毒RNA。本发明中，病毒 RNA的逆转录反应(RT)以提取的病毒RNA为模板，利用TaKaRa公司的 PrimeScript^TM1stStrand cDNA Synthesis Kit进行病毒RNA的逆转录反应。具体操作如下：

(1)配置反应混合液1：向0.2mLPCR管(DNase/RNase-free)中分别加入1ng～5μg模板RNA、1μL Random 6mers(50μmol/L)和1μL dNTP Mixture(10mmol/L each)，用RNasefree dH₂O补至10μL，并混匀。

(2)将上述混合液于65℃孵育5min后，迅速置于冰上冷却。

(3)配置反应混合液2：4μL 5×PrimeScript II Buffer、0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)、1μL PrimeScript II RTase(200U/μL)和4.5μL RNase free dH₂O。

(4)将反应混合液1和反应混合液2混匀后，按照下列条件进行逆转录反应：30℃10min；42℃60min；95℃5min；4℃保持。

(5)所得20μL cDNA产物可以作为PCR反应的模板立即使用，或置于-20℃冰箱内保存备用。

在本发明中，将获得的cDNA、所述的引物探针组中的上游引物NVF6、下游引物NVR6、荧光探针NVP9和检测试剂混合获得恒温扩增体系。在本发明中，所述所述恒温扩增体系，以50μL计，优选的包括以下组分：

冻干酶粉(包括重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶)

280mmol/L醋酸镁溶液 2.5μL。

在本发明中，所述Rehydration Buffer、冻干酶粉和醋酸镁溶液优选的来自TwistAmp^TMexo Kit试剂盒。在本发明具体实施过程中，优选的根据 TwistAmp^TMexo Kit试剂盒实验手册记载，首先配制47.5μL的反应液，包括RehydrationBuffer、上游引物NVF6、下游引物NVR6、荧光探针NVP9、去离子水和cDNA混合获得反应液；然后，将上述反应液与冻干酶粉混匀；最后加入醋酸镁溶液获得恒温扩增体系。在本发明中，所述恒温扩增反应的温度优选为39℃，所述恒温扩增反应的时间优选为20min。

本发明在所述恒温扩增反应过程中检测荧光强度；所述荧光强度优选的通过便携式荧光检测仪检测。如果扩增过程中产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中含有GⅡ型诺如病毒；如果扩增过程中没有产生指数式扩增曲线则判断待检测样品中没有GⅡ型诺如病毒，或者待检测样品中GⅡ型诺如病毒的数量没有达到检测限。根据扩增起始时间判断样品相对含量，扩增起始时间越短表明样品中GⅡ型诺如病毒含量越高，扩增起始时间越长表明样品中GⅡ型诺如病毒含量越低。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

荧光RPA检测靶标的选择

本发明选取GⅡ.4型诺如病毒的294bp保守特异性序列(SEQ ID No.4)，具体如下：

以该保守特异性序列作为检测靶标，由上海生工生物工程股份有限公司进行全基因合成，将目的片段连接至长度为2710bp的pUC57质粒上，构建诺如病毒质粒标准品。

引物设计与筛选

RPA引物长度建议在30～36bp之间，GC含量在20～70％之间，引物的溶解温度在50～100℃之间，最大重复序列长度为5bp，扩增片段长度建议在 100～200bp之间。RPA反应的exo探针长度要求在46～52bp之间。根据以上设计原则，共设计7对引物组。引物序列信息如表1所示。

表1 荧光RPA引物列表

本实验以1.22×10⁴copies/μL质粒标准品为模板，利用TwistAmp^TMBasic Kit试剂盒筛选引物。根据试剂盒实验手册要求，首先配制42.7μL的反应液，包括29.5μLRehydration Buffer、去离子水11.2μL和2μL模板DNA。然后向混合液中加入上下游引物各2.4μL(10μmol/L)。随后，将上述反应液与冻干酶粉混匀。最后，加入2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)，反应总体系 50μL。反应体系置于39℃金属浴中，孵育20min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察结果。根据是否有扩增产物和是否有引物二聚体判断引物的扩增性能。

引物筛选实验结果如图1所示。其中1、3、5、7、9、11和13分别为引物组NVF1/NVR1、NVF2/NVR2、NVF3/NVR3、NVF4/NVR4、NVF5/ NVR5、NVF6/NVR6和NVF7/NVR7的阳性反应孔，2、4、6、8、10、12 和14分别为引物组NVF1/NVR1、NVF2/NVR2、NVF3/NVR3、NVF4/ NVR4、NVF5/NVR5、NVF6/NVR6和NVF7/NVR7的阴性反应孔。结果表明，7对引物组均可有效扩增诺如病毒保守特异性片段，其中引物组NVF6/ NVR6扩增片段长度为170bp，阴性反应无引物二聚体。因此，在引物组 NVF6/NVR6扩增的目的片段中间适合设计探针。

探针的设计与筛选

根据引物组NVF6/NVR6设计探针，结果如表2所示。

表2 荧光RPA探针列表

探针筛选实验结果如图2所示，其中N1为探针NVP7的阴性对照，N2 为NVP9的阴性对照，N3为NVP11的阴性对照。结果表明，荧光RPA反应体系中探针为NVP9时，其反应起始时间早于探针NVP7和NVP11，总荧光强度高于探针NVP7和NVP11，并且阴性对照无扩增反应。因此，探针NVP7 性能较好，更适合用于检测诺如病毒基因组。

荧光RPA反应特异性

为了确定荧光RPA反应的特异性，本实验以GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17 型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒的DNA或cDNA为模板，在温度为39℃时进行扩增反应，结果如图3所示。其中GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、 GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒来源于实验室收集的粪便样品，经定量PCR验证。MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒购于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

结果显示，GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒和GⅡ.3型诺如病毒有明显扩增曲线，而星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒的荧光信号随随时间无明显变化。可见本发明提供的引物探针组及方法能够特异性扩增GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒和GⅡ.3型诺如病毒，而不会扩增星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒。

荧光RPA反应灵敏性

为了检验荧光RPA反应的灵敏性，选取浓度为1.22×10⁵、1.22×10⁴、 1.22×10³、1.22×10²、1.22×10¹、1.22×10¹和1.22copies/μL的诺如病毒质粒标准品作为模板进行实时RPA扩增反应，结果如图4所示。结果表明，荧光RPA方法的最低检测限为1.22copies/μL，达到最大荧光值的时间为17 min。

荧光RPA检测体系临床样品检测

利用荧光RPA反应对实验室保存的来源于天津市儿童医院的30例疑似诺如病毒阳性粪便样品进行检测，结果如表3所示。荧光RPA反应可检出 27例。与PCR方法相比，荧光RPA反应同样未检出样品2、9和27，而均可检出其他粪便样品。

表3 荧光RPA临床样品检测结果

由上述实施例可知，本发明提供的引物探针组，与现有技术相比，具有更低的检测限，反应时间更短，并且可同时扩增GⅡ.4、GⅡ.3、GⅡ.6和 GⅡ.17型诺如病毒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组、试剂盒及方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

yagcaaaaty agyaagytrg tcattgcaga ry 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtcaytcgac gccatcttca ttcacaaarc 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgtgcccaga caagagccaa tgttcagatg gatgagattc tcagat 46

<210> 4

<211> 294

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gctgggcgag gctgcactcc acggcccggc attctatagc aaaattagca aattagtcat 60

tgcagagttg aaggaaggtg gcatggattt ttacgtgccc agacaagagc caatgttcag 120

atggatgaga ttctcagatc tgagcacgtg ggagggcgat cgcaatctgg ctcccagttt 180

tgtgaatgaa gatggcgtcg agtgacgcca acccatctga tgggtccgca gccaacctcg 240

tcccagaggt caacaatgag gttatggctc tggagcccgt tgttggtgcc gcca 294

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

crgcattcta yagcaaaaty agyaagytrg tca 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gaatctcatc catctgaaca ttggytcttg tct 33

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cattctayag caaaatyagy aagytrgtca 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gagaatctca tccatctgaa cattggytct t 31

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agcattctay agcaaaatya gyaagytrgt ca 32

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agaatctcat ccatctgaac attggytctt gtc 33

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gcattctaya gcaaaatyag yaagytrgtc a 31

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gagaatctca tccatctgaa cattggytct tgt 33

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ccrgcattct ayagcaaaat yagyaagytr gtca 34

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

aatctcatcc atctgaacat tggytcttgt ctk 33

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ggyccrgcat tctayagcaa aatyagyaag 30

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gaatctcatc catctgaaca ttggytcttg tc 32

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ggatttttac gtgcccagac aagagccaat ttcagatgga tgaga 45

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gacaagagcc aatgttcaga tggatgagat ctcagatctg agcac 45

Claims

1.一种检测GⅡ型诺如病毒的引物探针组，其特征在于，包括上游引物NVF6、下游引物NVR6和荧光探针NVP9；所述上游引物NVF6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物NVR6的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述荧光探针NVP9的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光探针NVP9自5'端起第29位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基标记dSpacer，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1，3'末端标记C3 Spacer。

3.一种检测GⅡ型诺如病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括诺如病毒质粒标准品和检测试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述诺如病毒质粒标准品包括初始质粒和诺如病毒特异性序列，所述诺如病毒特异性序列如SEQ ID No.4所示。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述初始质粒为pUC57质粒。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括恒温扩增反应缓冲液、重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和醋酸镁。

8.一种非疾病诊断目的的检测GⅡ型诺如病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检测样本的总RNA，将所述总RNA反转录获得cDNA；

2)将步骤1)获得的cDNA、权利要求1所述的引物探针组中的上游引物NVF6、下游引物NVR6、荧光探针NVP9和检测试剂混合获得恒温扩增体系，然后进行恒温扩增检测扩增过程的荧光强度；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的温度为39±0.1℃，所述恒温扩增反应的时间为20±5min。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增体系，以50μL计，包括以下组分：