CN106755574B - 一种高灵敏度的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种高灵敏度的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV‑1的试剂盒和方法。所述的试剂盒包括一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV‑1的引物组和荧光探针；所述的引物组由四条引物组成，用于巢氏扩增牡蛎疱疹病毒OsHV‑1的特定DNA片段。本发明提供的检测方法使得四条引物和一条荧光探针在一管中通过一步扩增即可完成巢氏扩增和实时荧光定量PCR，用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV‑1。本发明提供了一种兼具高灵敏度、特异性、准确性的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，能够实现对牡蛎及养殖牡蛎的水体进行快速检测，应用极为方便，基于上述优点，该试剂盒适合在水产养殖单位和水产养殖品监管部门等进行推广应用，具有广泛的应用前景。

Description

一种高灵敏度的OsHV-1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测，具体涉及一种OsHV-1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法。
背景技术
牡蛎是世界重要养殖贝类，在我国和世界上很多沿海地区广泛分布。牡蛎养殖产量居海产动物首位，具有很高的经济价值。但牡蛎经常爆发大规模死亡，严重制约着牡蛎养殖业的发展，造成严重经济损失。1972年在美洲牡蛎中首先发现了牡蛎疱疹病毒OsHV-1。目前OsHV-1已被证明与牡蛎的大规模死亡有关。
为了降低牡蛎疱疹病毒OsHV-1造成的经济损失，往往需要对养殖水体及牡蛎进行检测。目前为了获得相对较高的特异性，对牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测方法通常采用巢氏PCR的方式。
例如，中国专利申请201510623544公开了一种牡蛎疱疹病毒I型检测引物和方法，它包括外引物PFor1、PRev1和内引物PFor2、PRev2。该方法利用巢氏PCR技术，采用两对PCR引物，通过两轮PCR反应扩增，最后对扩增产物进行电泳，根据电泳扩增条带情况判断样本是否感染牡蛎疱疹病毒OsHV-1。
再例如，中国专利申请201610052695公开了一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法。该检测方法以牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因功能结构域核苷酸序列为模板，设计两对嵌套式引物，并以此为主题设计巢式PCR检测方法。同样，该方法也是通过两轮PCR反应扩增，最后对扩增产物进行电泳，根据电泳扩增条带情况判断样本是否感染牡蛎疱疹病毒。
利用巢氏PCR技术对牡蛎疱疹病毒OsHV-1进行检测，虽然具有相对较高的特异性，然而上述方法都具有一个严重的缺陷，即需要通过两轮PCR扩增，也就是需要开管取产物才能进行第二轮扩增，并且都需要进行配制琼脂糖凝胶电泳。正是由于巢氏PCR具有较高特异性，因此极易受到污染产生假阳性结果，开管进行两轮PCR反应、配制琼脂糖凝胶等步骤又大大增加了待检测样品收到污染的可能性。另外，上述方法需要使用到具有严重毒性的DNA燃料，并不利于环保。因此，尽管巢氏PCR技术具有较高的特异性，然而其极易受到污染并产生假阳性结果。
也有将环介导等温扩增技术用于牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测方法。例如中国专利申请201610231091公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物，并通过环介导等温扩增技术对OsHV-1进行检测。然而环介导等温扩增技术是链置换合成，扩增的靶序列长度相对较短，通常在260bp左右，当序列长度大于400bp则较难扩增，因此其使用的范围相对较窄；更重要的是，由于环介导等温扩增的灵敏度相对较高，也因此极易受到污染而产生的假阳性结果；另外，其在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。环介导等温技术由于其适用范围窄，极易受污染出现假阳性，即准确性和可重复性较差，后续操作不便等诸多缺陷，因此在实际使用中并不适用于OsHV-1的检测工作。
除了上述两种方法，还有使用实时荧光定量PCR技术对牡蛎疱疹病毒OsHV-1进行检测。例如中国专利申请201610236196公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的试剂盒及其专用引物，其利用TaqMan实现对OsHV-1进行检测。该方法虽然具有相对较高的灵敏度，然而其特异性确远不如巢氏PCR技术。
综上所述，开发出一种灵敏度、准确性、特异性、可重复性均相对更高，且操作便捷的OsHV-1检测方法、试剂、或试剂盒是牡蛎养殖业中亟待解决的技术问题。
发明内容
如无特殊说明，本发明中的：
术语“RNase free H2O”指不含RNA酶以及任何DNA的纯水或超纯水。
本发明要解决的技术问题是提供一种用于牡蛎疱疹病毒OsHV-1检测的试剂盒及方法，使其灵敏度、准确性、特异性、可重复性均相对更高，且操作便捷。
一个方面，本发明提供了一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组。
本发明所述的一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组由引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2组成；
本发明所述的引物OsHV-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-TGGTGGCGTTCCACAACTTGGCA-3’：
本发明所述的引物OsHV-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
5’-GAGAGCAGACCAAATGCATCGCCA-3’：
本发明所述的引物OsHV-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：
5’-TGTGATGTAGACAAGGCATATAAATTGA-3’：
本发明所述的引物OsHV-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：
5’-AATGCATCGCCATTGAAAATTA-3’：
另一个方面，本发明提供了一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的荧光探针OsHV-P，所述的荧光探针OsHV-P为TaqMan探针，所述的荧光探针OsHV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：
5’-ATGTGCATCCCTGCCGTAGCTCTC-3’：
所述的荧光探针OsHV-P的核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1。
另一个方面，本发明提供了一种用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的试剂盒，所述的试剂盒包括本发明所述的引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2。
所述的试剂盒还包括本发明所述的一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的荧光探针OsHV-P。
所述的试剂盒还可以包括病毒DNA提取试剂、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。
所述的阳性质控品为：以牡蛎疱疹病毒OsHV-1的基因组DNA为PCR模板，以本发明所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1为PCR引物扩增得到的DNA片段，或含有该DNA片段的核酸片段或质粒。
所述的阴性质控品为RNase free H2O。
本发明所述的一种用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的试剂盒中的引物组包含四条引物，用于对OsHV-1中特定区域的扩增，四条引物同时扩增使得扩增反应特异性大大提高；本发明采用实时荧光定量PCR技术使得OsHV-1的检测的灵敏度也相对更高。
再一个方面，本发明提供了一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的方法，所述的方法指利用本发明所述的检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组和荧光探针，使用实时荧光定量PCR技术检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1；
所述的检测方法包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取病毒DNA；
(2)制备阳性质控品：以牡蛎疱疹病毒OsHV-1的基因组DNA为PCR模板，以本发明所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1为PCR引物，PCR扩增得到的DNA片段，或含有该DNA片段的核酸片段或质粒为阳性质控品；
(3)实时荧光定量PCR：
以步骤(1)提取的病毒DNA为模板，利用本发明所述的一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组和荧光探针OsHV-P，通过以下PCR扩增程序进行实时荧光定量PCR：
PCR扩增程序：94～96℃预变性2分钟；94～95℃变性15～30秒、65～69℃退火30～75秒、68～72℃延伸30～40秒，6～9个循环；93～95℃变性15～20秒、60℃退火30秒、68～72℃延伸30秒，8个循环；93～95℃变性15秒、52～55℃退火延伸30～60秒，40个循环；55℃时收集荧光；
(4)结果判定。
在一些实施方案中，所述的结果判定的方法具体为：
1)阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期，即可判定样本中含有牡蛎疱疹病毒OsHV-1；
2)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40，即可判定样本中不含有牡蛎疱疹病毒OsHV-1；
3)可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性。
实时荧光定量PCR是在PCR扩增中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定性定量分析。实时荧光定量PCR相较于普通PCR具有更高的灵敏度，然而其特异性确相对一般。
而本发明提供的检测方法不同于常规的实时荧光定量PCR技术，首创性地在PCR扩增时使用4条引物，即2对PCR引物，借助4条引物和一条荧光探针同时完成巢氏扩增和实时荧光定量PCR。然而常规的PCR程序并不能实现巢氏扩增和实时荧光定PCR的在一管中同时进行。本发明首创性地发现采用上述三种相继进行的不同热循环方式构成整个扩增的热循环反应，能够很好地实现巢氏扩增和实时荧光定PCR的在一管中同时进行，同时克服了OsHV-1检测中常规实时荧光定量PCR方法检测特异性不足和常规巢氏PCR方法检测灵敏度不足的缺陷，同时具有高灵敏性和高特异性的特征。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、本发明提供的牡蛎疱疹病毒OsHV-1的方法和试剂盒不同于常规检测方法，既不是常规的巢氏PCR技术，也不是常规的实时荧光定量PCR技术，本发明采用了四条PCR引物和一条荧光探针，在一管体系中同时扩增，使其检测的灵敏度、准确性、特异性、可重复性均获得提高，且操作便捷。
(2)、本发明提供的OsHV-1的检测方法和试剂盒选择的目标扩增区域不同于现有技术，经验证对该区域进行扩增非特异性扩增的概率更低，能够获得相对更高检测准确性。
(3)、本发明提供的OsHV-1的检测方法和试剂盒将四条PCR引物和一条荧光探针，在一管体系中同时进行扩增反应，引物序列和探针序列的设计使之更加稳定平衡，各个引物之间和以及探针和引物之间的交叉杂交干扰相对最低，使得检测的准确性更高。
(4)、本发明提供的OsHV-1的检测方法和试剂盒，首创性地将巢氏PCR技术和实时荧光定量PCR技术相结合并用于OsHV-1的检测，开发出一种新型OsHV-1检测方式，兼具高灵敏性和高特异性。
(5)、本发明提供的OsHV-1检测方法和试剂盒采取的PCR扩增程序完全不同于普通PCR扩增反应，采用了三种相继进行的不同热循环方式构成整个扩增的热循环反应，实现了在一管反应中直接一步反应即可完成巢氏扩增以及荧光定量PCR反应，大大提高了检测效率；同时，由于在一管中即可完成整个检测反应，不需要普通巢氏PCR的开管和电泳步骤，因此极大地降低了反应体系受污染的概率，继而极大地降低了假阳性结果的概率，大大提高了检测的准确性。因此比常规的OsHV-1检测方法更加适用于实际大规模检测需求。
(6)、本发明提供的OsHV-1检测方法采用了三种相继进行的不同热循环方式构成整个扩增的热循环反应，相对于常规的实时荧光定量PCR检测方法，具有更高的循环数，继而具有更高的检测灵敏度。
综上所述，本发明提供了一种兼具高灵敏度、特异性、准确性的OsHV-1实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，能够实现对牡蛎及养殖牡蛎的水体进行快速检测，应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高、无法对低浓度的OsHV-1进行准确判断的缺点。另外由于对特异性扩增区的选择、引物和探针序列的设计、PCR扩增反应的创新设计等，使得本发明的提供的检测方法具有常规方法所不能比拟的高准确性。基于上述优点，该试剂盒适合在水产养殖单位和水产养殖品监管部门等进行推广应用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实验例1中的灵敏度检测结果。其中从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/mL的阳性质控品的扩增结果。
图2为实验例2中的检测结果图。其中曲线1为含有OsHV-1的水体样本的扩增结果。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1一种用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的试剂盒
该试剂盒包括：
(1)引物OsHV-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(2)引物OsHV-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)引物OsHV-F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(4)引物OsHV-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(5)荧光探针OsHV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1；
(6)阳性质控品：含有以牡蛎疱疹病毒OsHV-1的基因组DNA为PCR模板，以引物OsHV-F1和OsHV-R1为PCR引物扩增得到的DNA片段的质粒，质粒浓度为1.0×108拷贝/μL；
(7)阴性质控品：RNase free H2O。
实施例2一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的方法
使用的检测试剂盒为本发明实施1所述的试剂盒。
待测样本：30个不同来源的、已知是否感染OsHV-1的牡蛎组织及养殖牡蛎的水体，样本编号1-30，样本采集自宁波市渔业产品质量检验站。
检测方法：
(1)从待测样本中提取病毒DNA：使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号为DP315)从30个样本中提取病毒基因组DNA作为待测DNA，具体提取方法参见提取试剂盒说明书；
(2)制备阳性质控品：
1)以牡蛎疱疹病毒OsHV-1的基因组DNA为PCR模板，以引物OsHV-F1-1和OsHV-R1-1作为PCR引物进行PCR扩增：
PCR体系如下：
其中Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，货号为RR001Q；
PCR扩增程序如下：
94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸10分钟；
2)PCR反应结束后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)纯化PCR产物，具体纯化方法参见试剂盒说明书；
3)将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落培养后抽提质粒，并稀释成1.0×108拷贝/μL，即为阳性质控品；
其中大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司，货号为CB101，具体转化过程参见其说明书；抽提质粒采用质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司，货号为DP103，具体抽提方法参见其说明书；
(3)实时荧光定量PCR：
1)按下表配制PCR Mix：
2)配制实时荧光定量PCR反应体系：
配制反应体系：加入PCR Mix 20μL和1U/μl的Taq DNA聚合酶2μl，瞬时离心后，加入步骤(1)得到的待测DNA 4μl；阳性质控体系和阴性质控体系按照上述反应体系配制，将其中的待测DNA替换成阳性质控品或阴性质控品4μl；每个样品3个平行反应；
3)实时荧光定量PCR扩增：
将上述反应体系按如下PCR扩增程序进行实时荧光定量PCR扩增：
PCR扩增仪器：MX3000P实时荧光定量PCR仪，购自美国安捷伦；
参数设置：基团为FAM，淬灭基团选择None；
PCR扩增程序：94℃预变性2分钟；94℃变性15秒、65℃退火30秒、72℃延伸30秒，8个循环；94℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，8个循环；94℃变性15秒、53℃退火延伸50秒，40个循环；55℃时收集荧光；
(4)结果判定：
阳性质控品和阴性质控品的检测结果分别为阳性和阴性；
表中“-”表示检测不到Ct值；
检测结果显示，所有样品的结果判定均与真实情况一致，无假阳性或假阴性情况。
对比例1
中国专利申请201510623544公开的牡蛎疱疹病毒检测方法，具体为其实施例1公开的检测方法。
对比例2
中国专利申请201610052695公开的牡蛎疱疹病毒检测方法，具体为其实施例1公开的检测方法。
对比例3
中国专利申请201610231091公开的牡蛎疱疹病毒检测引物组，具体为其实施例3公开的检测方法。
对比例4
中国专利申请201610236196公开的鉴定牡蛎疱疹病毒的试剂盒，具体为其实施例7公开的检测方法。
对比例5一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的方法
与实施例2的检测方法基本一致，区别在于：将实施例2检测方法步骤(3)中的“实时荧光定量PCR扩增程序”替换为常规PCR程序，如：94℃预变性2分钟；94℃变性15秒、60℃退火30秒，53℃延伸30秒、共45个循环；55℃时收集荧光。
实验例1灵敏度实验
将本发明所述的阳性质控品，分别稀释为1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/mL，作为待检测样品，对实施例2的检测方法进行灵敏度实验，以最低检出浓度表征灵敏度。图1为灵敏度检测结果，根据图1可看出，质粒拷贝数在108～102拷贝/mL范围内均有曲线有明显的指数增长期，质粒拷贝数在102拷贝/mL时，经过扩增仍有荧光信号，因此本发明提供的方法的检测灵敏度为：1.0×102拷贝/mL。
灵敏度数据如下：
实施例2 1.0×102拷贝/mL
对比例2公开数据 1.0×102拷贝/μL
对比例3公开数据 1fg基因组DNA/25μL
对比例4公开数据 1.0×102拷贝/μL
根据NCBI上公布的信息，OsHV-1(NCBI编号AY50925)全基因组长度为207439bp，经换算其平均分子量为207439bp×660Da/bp＝136909.7KDa，根据公式“拷贝数＝6.02×1023×浓度÷平均分子量”计算对比例3公开的灵敏度为1.8×103拷贝/mL。
因此，本发明提供的检测方法的灵敏度分别是对比例2、3、4的1000倍、18倍、1000倍，由此可见，本发明提供的检测方法的灵敏度大大高于现有技术。
实验例2特异性实验
按照本发明实施例2的检测方法分别对含有OsHV-1、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、对虾黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、虾肝肠孢虫(EHP)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)或派琴虫(Perkinsus spp.)的水体样本进行检测。
检测结果如图2，只有含有OsHV-1的水体样本和阳性质控品为阳性结果，其余样本和阴性质控品均为阴性结果；无假阳性或假阴性扩增。
实验例3准确性实验
分别采用对比例1-5的检测方法对本发明实施例2中所述的30个不同来源的、已知是否感染OsHV-1的牡蛎组织及养殖牡蛎的水体进行检测，检测结果如下：
表中“-”表示检测不到Ct值
检测结果显示：对比例1的方法出现3个假阳性结果；对比例2的方法出现2个假阳性结果；对比例3的方法出现6个假阳性结果；对比例4的方法出现7个假阳性结果；对比例5的方法出现7个假阳性和5个假阴性结果。
由此可见，与现有技术相比本发明提供的检测方法准确性相对更高；并且常规的实时荧光定量PCR程序并不能达到本发明的技术效果，其检测结果非常不准确。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院北京基因组研究所
<120>一种高灵敏度的OsHV-1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法
<130> 20161215
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
tggtggcgtt ccacaacttg gca 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gagagcagac caaatgcatc gcca 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
tgtgatgtag acaaggcata taaattga 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
aatgcatcgc cattgaaaat ta 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
caacacgccc catgtctcag ctcc 24

Claims (3)

1.一种用于检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒包括引物组和荧光探针；所述的引物组由引物OsHV- F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2组成；
所述的引物OsHV-F1的序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述的引物OsHV-R1的序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
所述的引物OsHV-F2的序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
所述的引物OsHV-R2的序列为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
所述的荧光探针为荧光探针OsHV-P，荧光探针OsHV-P为TaqMan探针，所述的荧光探针OsHV-P序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；所述的荧光探针OsHV-P的核苷酸序列的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接猝灭基团BHQ1；
所述的试剂盒的使用方法为：从待测样品中提取病毒DNA为模板，利用引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2、引物 OsHV-R2和荧光探针OsHV-P，通过以下PCR扩增程序进行实时荧光定量PCR：
94～96℃预变性2分钟；94～95℃变性15～30秒、65～69℃退火30～75 秒、68～72℃延伸30～40秒，6～9个循环；93～95℃变性15～20秒、60℃退火30秒、68～72℃ 延伸30秒，8个循环；93～95℃变性15秒、52～55℃退火延伸30～60秒，40个循环；55℃时收 集荧光并判定结果。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括病毒DNA提取试剂、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性质控品为：
以牡蛎疱疹病毒OsHV-1的基因组DNA为PCR模板，以权利要求1所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1为PCR引物扩增得到的DNA片段，或含有该DNA片段的核酸片段或质粒；
所述的阴性质控品为RNase free H2O。
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CN108753997A (zh) * 2018-05-08 2018-11-06 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法
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CN101104867A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法
EP2366804A1 (en) * 2010-03-02 2011-09-21 Ifremer (Institut Francais De Recherche Pour L'exploitation De La Mer) Identification of the microVar strain of Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1)
CN105755175A (zh) * 2015-04-17 2016-07-13 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的试剂盒及其专用引物
CN105087831A (zh) * 2015-09-25 2015-11-25 山东农业大学 牡蛎疱疹病毒i型检测引物、方法与应用
CN105543415A (zh) * 2016-01-26 2016-05-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式pcr检测方法

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