JP2023530205A - チフス菌の検査キット、その製造方法及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
crRNAは、チフス菌flag遺伝子の検査セグメントに対する特異的crRNAであり、
LbCas12a-RRタンパク質の発現配列は、Cas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、532位及び595位のアミノ酸をそれぞれG532R及びK595Rに変異させた配列である。
crRNAを含む増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌flag遺伝子に対して、LbCas12a-RR識別配列TTTN又は/及びTCTNを含む標的配列を検索し、crRNAを設計して調製するcrRNA調製ステップと、
Cas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、532位及び595位のアミノ酸に対してそれぞれG532R及びK595Rに変異させて、LbCas12a-RRタンパク質の発現配列を得てから、pET28a発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりLbCas12a-RRタンパク質を得るLbCas12a-RRタンパク質調製ステップと、を含む。
前記チフス菌の核酸検出は、
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術系に添加することにより、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をcrRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含む検出系に添加して反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して結果を得る検出ステップと、を含む。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats、CRISPRs)は、細菌の適応免疫系であり、Casタンパク質は、RNA誘導型ヌクレアーゼにより外来核酸を標的分解する。CRISPR-Cas12aは、Cas酵素の第2のファミリーに属し、RNAを誘導して二本鎖DNAが単一のRuvC触媒ドメインを分解するように指導するものである。Cas12酵素は、チミン(Thymine、T)ヌクレオチドに富むプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を識別し、それら自体のガイドCRISPR RNA(crRNA)の成熟を触媒し、相補的にペアリングされた二本鎖DNA(dsDNA)を特異的に識別して切断する。CRISPR/Cas12タンパク質は、配列特異的な様式で標的二本鎖DNAを識別して切断する場合、強大な非特異的一本鎖DNA(ssDNA)トランス切断活性を誘導することができ、ssDNAに結合された蛍光レポーターは、切断時に蛍光シグナルを生成する。本発明のキットは、Cas12の上記特性に基づいて、臨床検体中のチフス菌核酸を迅速で正確に検出することができる。
1、本発明の検査キットは、感度が高く、特異性が強く、迅速に可視化され、チフス菌核酸の迅速な検出に用いることができる。
2、本発明の検査キットのcrRNAは、LbCas12a-RRに基づいて特定のPAM配列特徴を識別し、flag遺伝子標的配列に設計された特異的crRNAは、効率的な特異性を有する。
3、本発明の検査キットのLbCas12a-RRタンパク質の発現配列は、最適化及び変異により、TTTN以外のTCTN標的配列を識別することができる。
4、本発明の検査キットの用途は、蛍光灯の下で目視で直接検出することができ、便利で迅速な結果の判読を実現することができ、検出が正確で、迅速で、簡便であり、一次実験及び臨床現場でチフス菌の迅速な検出及び同定診断を容易にする。
5、本発明の検査キットの使用方式は、特異性が高く、消費時間が短く、スループットが高く、大型実験装置に依存しない。
増幅プライマーは、flag-RPA-F2及びflag-RPA-R1を含み、flag-RPA-F2の配列をSEQ ID NO.1に示し、flag-RPA-R1の配列をSEQ ID NO.2に示し、
crRNAは、チフス菌flag遺伝子の検査セグメントに対する特異的crRNAであり、crRNAは、flag-crRNA1及びflag-crRNA3(等しい割合で混合)を含み、flag-crRNA1の配列をSEQ ID NO.3に示し、flag-crRNA3の配列をSEQ ID NO.4に示し、
LbCas12a-RRタンパク質の発現配列は、Cas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い(従来のソフトウェアで最適化を行う)、532位及び595位のアミノ酸をそれぞれG532R及びK595Rに変異させた配列であり、
一本鎖DNA報告システムは、一本鎖DNA FQ reporterを含み、一本鎖DNA FQ reporterは、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)及び蛍光クエンチャー(BHQ1)で標識された一本鎖DNAであり、標識生成物は、/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ 1/であり、ssDNA FQ reporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/と命名される。
crRNAを含む、長さが30~37bpである増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌flag遺伝子(配列SEQ ID NO.5)に対して、LbCas12a-RR識別配列(PAM)TTTN及びTCTNを含む標的配列を検索し、長さが23bpであるcrRNAを設計して調製するcrRNA調製ステップと、
Cas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、532位及び595位のアミノ酸に対してそれぞれG532R及びK595Rに変異させて、SEQ ID NO.6に示すようなLbCas12a-RRタンパク質の発現配列を得て、改変されたLbCas12a-RRタンパク質の識別領域が広くなり、TTTNとTCTNの両方を識別することができ、次にpET28a発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりLbCas12a-RRタンパク質を得るLbCas12a-RRタンパク質調製ステップと、を含む。
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術(RPA)系に添加することにより、温度が37℃で、時間が30minである増幅条件で、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をCRISPR/Cas12a検出系(CRISPR/Cas12a検出系がcrRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含む)に添加し、温度が37℃の条件で25min反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して、結果を得る検出ステップと、を含み、検出ステップにおける蛍光検出法として、マイクロプレートリーダーを用いて検出反応における蛍光値を測定し、検出の励起光を485~520nmに設定し、又は、検出産物を波長485nmの光源下に置いて直接観察する。
実施例1
チフス菌のflag遺伝子断片は、NCBI CMCC50071菌株配列に基づいて増幅プライマーが設計され、南京ジェンスクリプト社により合成され、flag-PCR-F及びflag-PCR-Rと命名され、対応する配列がそれぞれSEQ ID NO.7及びSEQ ID NO.8である。
実施例2
LbCas12a-RRに基づいて特定のPAM TTTN及びTCTNの標的配列を識別し、flag遺伝子標的配列に20本の特異的crRNAを設計し、配列は、表1に示されている。
実施例3
実施例4
チフス菌のflag遺伝子断片に対応するDNA核酸サンプルに基づいて、検出される断片の分子量を計算し、10倍の勾配希釈を行い、μL当たり1*e6、1*e5、1*e4、1*e3、1*e2、1*e1及び1*e0コピー数(copy/μL)のDNA試験サンプルを得た。
検出ステップ:5μLの増幅産物を表6に示すCRISPR/Cas12a検出系に添加し、温度が37℃の条件で25min反応させて、検出産物を得た。
実施例5
実施例6
まず、臨床的に単離して保存されたチフス菌株に蘇生増幅を行い、細菌ゲノムDNA抽出キット(TIANGEN)で細菌ゲノムDNAを抽出した。1μLの臨床株のゲノムDNAに実施例4のような増幅ステップ及び検出ステップを行って、検出産物を得た。
Claims (10)
- 増幅プライマー、crRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含み、
前記crRNAがチフス菌flag遺伝子の検査セグメントに対する特異的crRNAであり、
前記LbCas12a-RRタンパク質の発現配列がCas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、532位及び595位のアミノ酸をそれぞれG532R及びK595Rに変異させた配列である、チフス菌の検査キット。 - 前記増幅プライマーがflag-RPA-F2及びflag-RPA-R1を含み、flag-RPA-F2の配列をSEQ ID NO.1に示し、flag-RPA-R1の配列をSEQ ID NO.2に示す、請求項1に記載のチフス菌の検査キット。
- 前記crRNAがflag-crRNA1及びflag-crRNA3を含み、前記flag-crRNA1の配列をSEQ ID NO.3に示し、前記flag-crRNA3の配列をSEQ ID NO.4に示す、請求項1に記載のチフス菌の検査キット。
- 前記一本鎖DNA報告システムが一本鎖DNA FQ reporterを含み、前記一本鎖DNA FQ reporterが6-カルボキシフルオレセイン及び蛍光クエンチャーで標識された一本鎖DNAであり、標識生成物が/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ 1/である、請求項1に記載のチフス菌の検査キット。
- 前記検査キットが増幅プライマー、crRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含み、
crRNAを含む増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌flag遺伝子に対して、LbCas12a-RR識別配列TTTN又は/及びTCTNを含む標的配列を検索し、crRNAを設計して調製するcrRNA調製ステップと、
Cas12タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、532位及び595位のアミノ酸に対してそれぞれG532R及びK595Rに変異させて、LbCas12a-RRタンパク質の発現配列を得てから、pET28a発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりLbCas12a-RRタンパク質を得るLbCas12a-RRタンパク質調製ステップと、を含む、チフス菌の検査キットの製造方法。 - 前記増幅プライマーの長さが30-37bpである、請求項5に記載のチフス菌の検査キットの製造方法。
- crRNA調製ステップにおいて、crRNAの長さが23bpである、請求項5に記載のチフス菌の検査キットの製造方法。
- チフス菌の検査キットをチフス菌の核酸検出に使用し、前記検査キットが増幅プライマー、crRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含み、
前記チフス菌の核酸検出が、
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術系に添加することにより、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をcrRNA、LbCas12a-RRタンパク質、及び一本鎖DNA報告システムを含む検出系に添加して反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して結果を得る検出ステップと、を含む、チフス菌の検査キットの用途。 - 増幅ステップにおいて、温度が37℃の条件で30min増幅して、増幅産物を得て、検出ステップにおいて、温度が37℃の条件で25min反応して、検出産物を得る、請求項8に記載のチフス菌の検査キットの用途。
- 検出ステップにおける蛍光検出法として、マイクロプレートリーダーを用いて検出反応における蛍光値を測定し、検出の励起光を485~520nmに設定し、又は、検出産物を波長485nmの光源下に置いて直接観察する、請求項8に記載のチフス菌の検査キットの用途。
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