CN115948614B - 一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于病原核酸检测技术领域，具体公开了一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法，该试剂盒包括crDNA扩增引物对、Cas12a蛋白、用于变温扩增的DNA聚合酶、RNA聚合酶和单链DNA报告分子；所述crDNA扩增引物对包含启动子序列，用于扩增能够体外转录产生crRNA的转录模板，所述crRNA包括用于与所述Cas12a蛋白结合的锚定序列和用于靶向靶标序列的向导序列，所述向导序列的长度为43bp～75bp。本发明试剂盒无需额外提供RNA，有利于试剂盒的保存与运输，可用于POCT检测，适用于对各种病毒的现场快速高灵敏筛查，可最大程度遏止病毒的传播，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于病原核酸检测技术领域，更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法。
背景技术
目前各种病原体的检测主要依靠PCR技术及其他以PCR为基础的技术，PCR相关检测技术因其快速准确、灵敏度高等优点，目前被公认为病毒检测的“金标准”。但是，目前主流的PCR检测平台，都需要专业的仪器设备和相关技术人员，限制了其大规模推广应用，特别是在边远落后地区的应用。
家用抗原检测因其操作简便快捷、可居家、可携带等优点，被大众所熟知。家用抗原检测一般采用胶体金免疫层析的原理制备，其原理限制了它的灵敏度和特异性。它没有核酸法的极高倍数的扩增环节，其特异性主要是靠抗原抗体特异性结合的免疫反应决定的，所以基于免疫层析原理的抗原检测，不论是灵敏度还是特异性，与核酸方法都有很大的差距。
目前有出现如重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物恒温扩增(CPA)等多种恒温扩增技术，可在单一温度下进行现场检测，大大降低了对仪器的要求，但是其检测灵敏度不高，特异性较差，不适用于载量较低的病毒检测。
基于CRISPR/CAS12A的检测方法通过扩增子被向导RNA(guide RNA，gRNA，也为single guide RNA，sgRNA)识别激活Cas12a酶，利用Cas12a酶的反式切割活性切割探针实现对检测信号放大。DETECTR检测平台是将上述等温扩增技术与CRISPR/CAS技术结合的核酸检测方法。但一方面等温扩增的试剂组分较多，成分较为复杂，检测反应体系容易产生错误信号，导致较高的背景信号干扰，不适用于较低拷贝的病原微生物检测；另一方面等温扩增极易对环境造成气溶胶污染，极易造成假阳性结果。而且DETECTR检测技术中含有向导RNA，我们都知道RNA极易降解，它的保存和运输要求较高，若RNA降解会极大的影响检测结果。
因此，病原微生物检测领域迫切需要开发一种灵敏度高、特异性强、便携式且适用于现场快速检测靶标核酸的方法。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法，旨在解决现有基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方法特异性差、crRNA不易保存和运输的问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒，其包括crDNA扩增引物对、Cas12a蛋白、用于变温扩增的DNA聚合酶、RNA聚合酶和单链DNA报告分子；
所述crDNA扩增引物对包含启动子序列，用于扩增能够体外转录产生crRNA的转录模板，所述crRNA包括用于与所述Cas12a蛋白结合的锚定序列和用于靶向靶标序列的向导序列，所述向导序列的长度为43bp～75bp。
优选地，所述启动子为T7启动子、T3启动子或SP6启动子。
优选地，所述crDNA扩增引物对包括用于扩增crRNA对应的DNA片段的第二引物对和用于扩增所述转录模板的第三引物对，所述第三引物对中的一条引物的5’端含有所述启动子序列，且所述第三引物对与所述第二引物对共用一条引物序列。
进一步优选地，所述第二引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，部分所述向导序列的长度为15bp～23bp。
进一步优选地，所述第二引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列、PAM序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，所述PAM序列为5’-TTTN-3’，部分所述向导序列的长度为15bp～23bp。
进一步优选地，所述第三引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述启动子序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成。
进一步优选地，所述crDNA扩增引物对还包括第四引物对，所述第四引物对与所述第三引物对共用一条引物序列，所述第四引物对中除与所述第三引物对共用序列的引物外的另一条引物为桥接引物，所述桥接引物的5’至3’序列依次由上游特定序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成，且所述第三引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述启动子序列和与所述上游特定序列匹配的DNA序列组成。
优选地，所述核酸检测试剂盒还包括用于特异性扩增所述靶标序列的第一引物对，所述crDNA扩增引物对对应的扩增片段位于所述第一引物对对应的扩增片段内部。
优选地，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。
优选地，所述单链DNA报告分子的序列为5’-TTTTTTTTATTT-3’。
进一步优选地，所述单链DNA报告分子的5’端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团，或者所述单链DNA报告分子的5’端标记荧光基团、3’端标记生物素。
优选地，所述核酸检测试剂盒还包括逆转录酶，用于将靶RNA逆转录成DNA。
优选地，所述核酸检测试剂盒还包括核酸释放剂，用于释放待检测样品中的核酸。
第二方面，本发明提供了本发明第一方面所述的核酸检测试剂盒在非诊断目的的检测或辅助检测病毒核酸中的应用。
优选地，所述病毒为痘病毒、杆状病毒、水疱疹性口炎病毒、猪腹泻病毒和新型冠状病毒中的一种或多种。
第三方面，本发明提供了一种非诊断目的的利用本发明第一方面所述的核酸检测试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，其包括如下步骤：
S1、以待检测核酸为模板，采用crDNA扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
S2、将所述PCR产物与Cas12a蛋白、RNA聚合酶和单链DNA报告分子混合，在同一体系中进行体外转录和Cas12a蛋白酶切反应；
S3、反应完成后，进行检测结果判读。
优选地，步骤S1中，先以所述待检测核酸为模板，采用第一引物对进行第一次PCR扩增；再以所述第一次PCR扩增得到的产物为模板，采用所述crDNA扩增引物对进行第二次变温PCR扩增，得到PCR产物。
优选地，步骤S1中，所述待检测核酸利用病毒核酸提取试剂对待检测样品抽提核酸得到，或者通过将待检测样品直接浸入核酸释放剂中得到。
优选地，步骤S2中，所述体外转录和Cas12a蛋白酶切反应的条件为37℃反应5min～40min。
优选地，步骤S3中，利用qPCR仪、蓝光或紫外光照或者胶体金免疫层析试纸进行检测结果判读。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒中，没有crRNA，而是通过在检测反应时自行体外转录合成相应的crRNA。目前基于CRISPR的检测试剂盒中通常含有crRNA，由于目前RNA保存方法主要是干粉保存和在RNA中加入RNA保护剂两种方式，但这两种保存方式均不适用于即时检验(point-of-care testing，POCT)，限制了CRISPR在快速便携式检测核酸中的应用。本发明试剂盒解决了RNA的运输与保存问题，也提高了检测的灵敏度和特异性。此外，本发明设计的crRNA相对靶标序列进行延伸，使得crRNA靶向性更强，进一步提高核酸检测的特异性。
(2)现阶段使用各种等温扩增的方法，尤其是lamp等温扩增极易造成非特异性扩增，导致检测产生假阳性结果，本发明基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测方法使用PCR变温扩增的方法，并使用巢式PCR这一高特异性扩增方法，减少了由扩增带来的非特异性产物，解决了假阳性问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中针对PEDV病毒设计的6种crRNA的切割活性检测结果图。
图2为本发明实施例2中基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测流程图。
图3为本发明实施例2中利用不同长度crRNA检测PEDV的qPCR仪荧光检测图。
图4为本发明实施例2中利用不同长度crRNA检测VSV-L的qPCR仪荧光检测图。
图5为本发明实施例3中方案一的检测流程图。
图6为本发明实施例3中方案二的检测流程图。
图7为本发明实施例3中方案三的检测流程图。
图8为本发明实施例3中采用不同方案检测PEDV的qPCR仪荧光检测图。
图9为本发明实施例3中采用不同方案检测VSV-L的qPCR仪荧光检测图。
图10为本发明实施例4中检测PEDV线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图11为本发明实施例4中检测释放剂PEDV释放核酸的qPCR仪荧光检测图。
图12为本发明对比例1中利用传统RAA&Cas12a两步法检测PEDV结果。
图13为本发明对比例2中利用RAA&T7&Cas12a两步法检测PEDV结果。
图14为本发明实施例5中检测VSV线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图15为本发明实施例5中检测VSV提取核酸的qPCR仪荧光检测图。
图16为本发明实施例5中检测释放剂释放VSV核酸的qPCR仪荧光检测图。
图17为本发明实施例5中检测释放剂释放VSV核酸的蓝光显色图。
图18为本发明实施例6中检测新冠E基因线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图19为本发明实施例6中检测释放剂释放新冠E基因核酸的qPCR仪荧光检测图。
图20为本发明实施例6中检测新冠N基因线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图21为本发明实施例6中检测释放剂释放新冠N基因核酸的qPCR仪荧光检测图。
图22为本发明实施例6中检测释放剂释放新冠N基因核酸的蓝光显色图。
图23为本发明实施例6中检测新冠Orf1ab基因线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图24为本发明实施例6中检测释放剂释放新冠Orf1ab基因核酸的qPCR仪荧光检测图。
图25为本发明实施例7中检测痘病毒A56R基因线性化质粒的qPCR仪荧光检测图。
图26为本发明实施例7中检测释放剂释放痘病毒A56R基因核酸的qPCR仪荧光检测图。
图27为本发明实施例7中检测释放剂释放痘病毒A56R基因核酸的蓝光显色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为提高基于CRISPR/Cas系统检测核酸的灵敏度、特异性和准确性，可适用于即时检验，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒，其包括crDNA扩增引物对、Cas12a蛋白、用于变温扩增的DNA聚合酶、RNA聚合酶和单链DNA报告分子；所述crDNA扩增引物对包含启动子序列，用于扩增能够体外转录产生crRNA的转录模板，所述crRNA包括用于与所述Cas12a蛋白结合的锚定序列和用于靶向靶标序列的向导序列，所述向导序列的长度为43bp～75bp。
本发明在靶基因保守区内部寻找PAM序列(5’-TTTN-3’)，并根据其近3’端区域设计crRNA，筛选出切割活性较好的作为检测用crRNA。为了提高Cas12a蛋白剪切的特异性，本发明在传统23bp向导序列的基础上，对其进行了延伸，发明人通过实验验证，延伸20bp～52bp的长度仍可以使crRNA具备很强的切割活性。此外，本发明提供的试剂盒中不含有crRNA，而是以靶标序列为模板扩增出带有启动子的crDNA后，在Cas12a蛋白酶切反应体系中同时进行体外转录得到crRNA，避免了RNA不利于运输和保存的问题。
不受理论的限制，本发明中采用的启动子可以是任意在体外被RNA聚合酶识别、结合并开始转录而产生RNA的启动子，由于启动子序列设计于扩增引物中，该启动子序列不宜过长，优选为T7启动子、T3启动子或SP6启动子。相对应的，本发明试剂盒提供的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。
一些实施例中，所述crDNA扩增引物对包括第二引物对和第三引物对，即通过至少两轮PCR扩增得到crRNA的体外转录模板：第二引物对用于扩增得到crRNA对应的DNA片段(即crDNA)，实施例中用crRNA-F和crRNA-R表示；第三引物对中的一条引物的5’端含有所述启动子序列，用于在扩增时将启动子添加至crDNA上游，为体外转录过程中的RNA聚合酶提供识别位点，第三引物对和第二引物对中均含有引物crRNA-R。本实施例之所以未将crRNA-F和启动子序列均设计到同一条引物中，即采用一对引物扩增得到转录模板，是因为实验发现Cas12a蛋白酶切反应中会切割该引物，从而使得检测结果假阳性概率高。
本发明对crRNA的5’端区域进行了不同设计，并实验验证得出均可以用于实施本发明方案，具体为：1)crRNA仅由锚定序列和延长的向导序列组成；2)crRNA由锚定序列、PAM序列和延长的向导序列组成；3)crRNA中锚定序列的上游多出一段序列。
相应的，针对不同的crRNA构造，具体操作中crDNA扩增引物对可设计为如下：1)参见图5，第二引物对中的一条引物crRNA-F的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，其中部分所述向导序列的长度为15bp～23bp，第三引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述启动子序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成。2)参见图6，第二引物对中的一条引物crRNA-F的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列、PAM序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，其中所述PAM序列为5’-TTTN-3’，部分所述向导序列的长度为15bp～23bp，第三引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述启动子序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成。3)参见图7，crDNA扩增引物对除了包括第二引物对和第三引物对外，还包括第四引物对，第四引物对包含引物crRNA-R和桥接引物crcpf-F，桥接引物crcpf-F的5’至3’序列依次由上游特定序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成，所述第三引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由T7启动子序列和与所述上游特定序列匹配的DNA序列组成，即所述上游特定序列将T7启动子和锚定序列隔断，使得转录得到的crRNA中锚定序列上游还有一段序列，其中，所述上游特定序列可以是一段长度为20bp且GC含量较高的序列。
进一步为了提高检测的特异性，一些实施例中还设计了第一引物对，第一引物对用于扩增靶基因保守区，crDNA扩增引物对对应的扩增片段位于该靶基因保守区内部，第一引物对特异性较高，实施例中用nested F和nested R表示。
不受理论的约束，本发明涉及的Cas12a蛋白可以是任意类型的Cas12a蛋白，例如但不限于LbaCas12a等。
一些实施例中，所述单链DNA报告分子的序列为5’-TTTTTTTTATTT-3’(SEQ IDNo.1)。根据检测方式不同，所述单链DNA报告分子可采用不同的修饰方式：当用于检测荧光值时，其修饰方式为5’端标记荧光基团和3’端标记荧光淬灭基团；当用于免疫层析试纸检测，其修饰方式为5’端标记荧光基团和3’端标记生物素(Biotin)。其中，荧光基团例如但不限于FAM等，荧光淬灭基团例如但不限于BHQ1等。在靶核酸、crRNA及Cas12a蛋白同时存在时，首先三者结合形成三元复合物，激活其顺式切割活性，当有Cas12a蛋白发生顺式切割，其反式切割活性被激活，切割单链DNA报告分子使探针的淬灭基团与荧光基团分离(或荧光基团与生物素分离)，使得Cas12a蛋白的切割作用被检测出来。
本发明试剂盒可用于检测DNA，也可以用于检测RNA，当用于检测RNA时，试剂盒中还包括逆转录酶，即需要先对待检测核酸进行反转录，再进行PCR扩增。
本发明待检测样品可以直接是核酸样品，也可以是病毒样品。若检测病毒样品，则可以采用病毒核酸提取试剂盒先抽提病毒样品中的核酸，或者用免提取方式先直接将病毒样品浸入核酸释放剂中，通常常温反应5min～10min即可释放出病毒核酸，然后再进行后续的扩增。
本发明还提供了本发明所述核酸检测试剂盒在非诊断目的的检测或辅助检测病毒核酸中的应用。该应用不限于检测DNA病毒还是RNA病毒，DNA病毒可以为痘病毒、杆状病毒等，RNA病毒可以为水疱疹性口炎病毒、猪腹泻病毒、新型冠状病毒等。
另外，本发明还提供一种非诊断目的的利用上述核酸检测试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，包括如下步骤：
S1、以待检测核酸为模板，采用crDNA扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
S2、将所述PCR产物与Cas12a蛋白、RNA聚合酶和单链DNA报告分子混合，在同一体系中进行体外转录和Cas12a蛋白酶切反应；
S3、反应完成后，进行检测结果判读。
一些实施例中，步骤S1进行两次扩增，先以所述待检测核酸为模板，采用第一引物对进行第一次PCR扩增；再以所述第一次PCR扩增得到的产物为模板，采用所述crDNA扩增引物对进行第二次变温PCR扩增，得到PCR产物。经多次实验验证，第一次PCR扩增既可以采用变温扩增，也可以采用等温扩增；而第二次PCR宜采用变温扩增，若第二次PCR采用等温扩增，则最终检测结果容易出现假阳性。
一些实施例的步骤S2中，所述体外转录和Cas12a蛋白酶切反应的条件为37℃反应5min～40min，对于低拷贝的核酸样品，采用本发明检测方法所需反应时间相对较短，30min～40min即可；而对于高拷贝的核酸样品，最快反应时间可以缩短至5min。
一些实施例的步骤S3中，利用qPCR仪、蓝光或紫外光照或者胶体金免疫层析试纸进行检测结果判读。具体地，结果判读为：①qPCR仪检测：若在30min内荧光增ΔRFU大于2000，则结果为阳性，即判断检测样品中含有靶核酸；若在30min内荧光增ΔRFU大于0且小于2000，则结果为阴性，即判断检测样品中不含靶核酸。②蓝光或紫外光照显色：若光照后反应管中为绿色，则结果为阳性；若光照后反应管中无色透明，则结果为阴性。③胶体金免疫层析试纸检测：若C线弱带(或无带)且T线有带，则结果为阳性；若C线有带且T线无带，则结果为阴性。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1靶标序列的切割活性筛选(实施例1至实施例3均对质粒进行检测)
1.设计crRNA序列：针对Porcine epidemic diarrhea virus strain NW8,complete genome病毒设计多组靶点特异性的crRNA，并构建质粒进行脱靶分析，筛选出6条特异性好、低脱靶的crRNA，如表1所示：
表1实施例1筛选出的6条向导序列和相应crRNA序列
同时设计PEDV-crRNA活性筛选时的PCR扩增引物，如表2所示。
表2实施例1中PCR扩增所采用的引物列表
2.目标基因片段扩增：配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(Dye Plus)25μL，PEDV-F和PEDV-R引物各0.4μM，靶标基因片段模板为1μL PEDV病毒基因组。PCR反应程序设置为：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸5min，并回收目标片段。
3.体外转录模板扩增：配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(Dye Plus)25μL，表2中PEDV-crRNA1-F(PEDV-crRNA2-F、PEDV-crRNA3-F、PEDV-crRNA4-F、PEDV-crRNA5-F或PEDV-crRNA6-F)与crRNA-R1分别组成引物对，各0.4μM，模板使用本实验室编号CC-244的质粒。PCR反应程序设置为：95℃2min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸5min，并回收目标片段。
4.crRNA体外转录：在以下体系中37℃反应4小时：Nuclease-free water加至20μL，dNTP各2μL，10×reaction buffer 2μL，模板DNA 500ng，T7 RNA Polymerase Mix 2μL。
5.crRNA纯化的方法(NEB RNA纯化试剂盒T2040)：20μL体外转录产物与30μLnuclease-free water加入100μL binding buffer至新的无酶1.5mL离心管混匀后，加入两倍体积(300μL)无水乙醇混合均匀，过离心柱，12000g离心1分钟收集RNA沉淀，弃去滤液，使用Wash Buffer过两次RNA纯化柱，后静置2min，加入适量的nuclease-free water离心获得RNA溶液。
6.crRNA顺式切割活性检测：2μL NEB buffer2.1，500ng crRNA，1.5μM LbaCas12a蛋白，400ng靶标DNA，Nuclease-free water加至20μL，酶切反应时间37℃60min，65℃10min。后电泳检测，根据电泳检测结果判定切割活性。
7.本实施例的结果如图1所示，RNA5、RNA5和RNA6都具备切割活性，后续以RNA6(即crRNA6)进行以下实验。
实施例2延长crRNA识别序列对cas12a蛋白切割活性的影响
1.为了提高检测的特异性，本实施例针对原始设计的PEDV-crRNA6中向导序列的3’端进行了延伸，验证其切割活性，检测流程见图2，图2中a方案采用原设计crRNA，b方案采用延长的crRNA，crRNA序列见表3。
此外，针对本公司实验室现有疱疹病毒(编号VSV28)的保守基因L基因设计多组靶点特异性的识别序列并进行脱靶分析，筛选出4条特异性好、低脱靶的靶标序列，并按实施例1的方案验证其切割活性，最终确定其靶标为VSV-L-crRNA，并对该序列3’端进行了延伸，验证其切割活性，crRNA序列见表3。
表3实施例2中针对两种不同病毒设计的crRNA序列
2.crRNA体外转录：在以下体系中37℃反应4小时：Nuclease-free water加至20μL，dNTP各2μL，10×reaction buffer 2μL，模板DNA 500ng，T7 RNA Polymerase Mix 2μL。
3.crRNA纯化的方法(NEB RNA纯化试剂盒T2040)：20μL体外转录产物与30μLnuclease-free water加入100μL binding buffer至新的无酶1.5mL离心管混匀后，加入两倍体积(300μL)无水乙醇混合均匀，过离心柱，12000g离心1分钟收集RNA沉淀，弃去滤液，使用Wash Buffer过两次RNA纯化柱，后静置2min，加入适量的nuclease-free water离心获得RNA溶液。
4.crRNA反式切割活性检测：2μL NEB buffer2.1，500nM crRNA，500nM ssDNAreporter，250nM Lba Cas12a蛋白，PEDV靶标DNA拷贝数2×109，10U RNase inhibitor，Nuclease-free water加至20μL，酶切反应时间37℃40min，每30s捕获一次荧光信号。
5.实验结果如图3和图4所示，通过对曲线的荧光强度与反应时间分析，无论针对PEDV病毒还是VSV病毒，在crRNA下游延伸一段序列，会降低crRNA的切割活性，但产生的非特异性荧光会降低，且延长的crRNA序列仍具备很强的切割活性，可以用于后续的检测。
实施例3改变crRNA序列的发夹结构对cas12a蛋白切割活性的影响
1.本实施例中，针对PEDV-crRNA6延长和VSV-L-crRNA延长中的锚定序列区域，设计三种不同扩增方案，如表4所示，对其灵敏度和特异性检测，检测流程依次参见图5至图7，包括如下步骤：
表4实施例3中三种方案各采用的引物列表
方案一设计原理：根据图2中b方案设计通过巢式PCR扩增从检测样品中获得体外转录模板，其中nested F和nested R为靶标DNA扩增引物，T7 Promoter-F引物为一个通用型引物，其序列由T7启动子序列和crRNA中与Cas12a蛋白结合的锚定序列组成，引物crRNA-F1(锚定序列与部分向导序列的DNA序列)与crRNA-R扩增产物为crDNA，T7Promoter-F、crRNA-F1分别与crRNA-R组成的两对引物扩增出体外转录的模板序列。
方案二设计原理：根据方案一设计通过巢式PCR扩增从检测样品中获得体外转录模板，其中nested F和nested R为靶标DNA扩增引物，T7 Promoter-F引物为一个通用型引物，其序列由T7启动子序列和crRNA中与Cas12a蛋白结合的锚定序列组成，引物crRNA-F2(相比于crRNA-F1，向导序列与锚定序列之间还带有Cas12a的PAM序列)与crRNA-R扩增产物为crRNA向导序列的DNA序列，T7 Promoter-F、crRNA-F2分别与crRNA-R组成的两对引物扩增出体外转录的模板序列，转录出的crRNA序列含有PAM。
方案三设计原理：根据方案一设计通过巢式PCR扩增从检测样品中获得体外转录模板，其中nested F和nested R为靶标DNA扩增引物，引物T7 Promoter-NF序列为T7启动子序列和crcpf-F上游的一段序列；crcpf-F为一条桥接引物，将T7启动子与锚定序列隔断，其前20bp为GC含量较高的一段序列，后一段序列为锚定序列的DNA序列组成，引物crRNA-F1与crRNA-R扩增产物为crDNA，T7 Promoter-NF、crcpf-F、crRNA-F1分别与crRNA-R组成的三对引物扩增出体外转录的模板序列，转录出的crRNA中锚定序列上游多出20nt的序列。
2.首轮PCR扩增：配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)25μL，表4中引物nested F、nested R各0.4μM，2μL模板(模板为1×106copy/μL线性化的PEDV标准质粒和ddH2O)，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行20个循环。
3.第二轮PCR扩增：本轮扩增分别以表4中方案一到方案三中的剩余几条引物为扩增引物，以首轮PCR扩增产物为模板；扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环。
4.体外转录&Cas蛋白酶切：反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μL T7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮PCR扩增产物，2μL NEB buffer2.1，500nMssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应30min。
5.根据探针修饰方式可使用不同的检测方式：①qPCR仪检测；②紫外光显色；③胶体金免疫层析。本实施例中使用qPCR仪检测，每30s检测一次荧光。
6.实验结果：如图8和图9所示，根据荧光检测结果分析，本实施例中对两种病毒基因检测的结果中方案一检测的灵敏度和特异性均优于其它两种方案，而方案二和方案三的反应速率比较接近，但方案二的特异性优于方案三，后续实施例使用方案一进行。
实施例4本发明检测方法的灵敏度与特异性测试
1.本实施例中，根据实施例3中方案一的设计方案对猪腹泻病毒样品进行特异性和灵敏度检测。
2.本实施例中两种检测样品：标准质粒和释放剂释放的病毒RNA。两种检测样品分别经过以下处理：①PEDV线性化的标准质粒并将其稀释至1x106、1x105、1x104、1x103、1x102、1x101、1x100copy/μL；②将PEDV病毒液稀释后与商用释放剂按1:2处理后的病毒RNA，病毒RNA浓度依次为1x106、1x105、1x104、1x103、1x102、1x101、1x100copy/μL。
3.首轮RT-PCR扩增：配置20μL PCR反应液，其中2×One Step Mix(Dye Plus)10μL，One Step Enzyme Mix 1μL，表4方案一中PEDV-nested F、PEDV-nested R各0.4μM，模板为步骤2中所述的所有样品及ddH2O，Nuclease-free water加至20μL，进行扩增。扩增程序：50℃30min；95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行20个循环。
4.第二轮PCR扩增：配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)25μL，表4方案一中引物T7 Promoter-F、PEDV-crRNA6-F1、PEDV-crRNA6-R各0.4μM，以首轮RT-PCR扩增中所有的产物为模板，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环。
5.体外转录&Cas蛋白酶切：反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μL T7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮PCR扩增产物，2μL NEB buffer2.1，500nMssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应30min。
6.利用qPCR仪检测：每30s检测一次荧光强度。
7.实验结果：本发明方法可直接用于RNA病毒检测，如图10所示，直接检测质粒其检测限可达1×100copy/μL；而如图11所示，使用核酸释放剂释放的核酸其检测灵敏度可达1×101copy/μL的病毒水平，NTC的荧光增量很小，特异性很好。
对比例1基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法的灵敏度与特异性测试
1.本对比例中，所使用的引物同实施例4。
2.本对比例中检测样品：PEDV线性化的标准质粒并将其稀释至2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copy/μL及H2O。
3.RAA等温扩增：RAA等温扩增采用杭州众测基础型RAA核酸扩增试剂盒。反应体系：Buffer A 25μL，Buffer B 2.5μL，表4方案一中PEDV-nested F、PEDV-nested R各0.4μM，步骤2中所述的检测样品，补RFH2O至50μL；37℃反应30min。
4.Cas12a蛋白酶检测：Cas12a酶切反应体系：在20μL反应体系中，加入RAA等温扩增产物3μL，500nM PEDV-crRNA6，500nM ssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，2μL NEBbuffer 2.1。37℃反应20min，qPCR仪检测，每30s检测一次荧光强度。
5.实验结果：如图12所示，使用传统的RAA&Cas12a酶切检测在20min内可检测的灵敏度低至2×101，但H2O的荧光强度比NTC的荧光强度高约两倍，产生比较强的非特异性荧光。该方法特异性差，在检测过程中极易产生假阳性。
对比例2基于CRISPR-Cas&T7体外转录的等温核酸检测方法的灵敏度与特异性测试
1.本对比例中，所使用的引物同实施例4。
2.本对比例中检测的样品：PEDV线性化的标准质粒并将其稀释至2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100copy/μL及H2O。
3.第一轮RAA等温扩增：反应体系：buffer A 25μL，Buffer B 2.5μL，表4方案一中PEDV-nested F、PEDV-nested R各0.4μM，步骤2中所述的检测样品，补RFH2O至50μL。反应程序如下：37℃，30min。RFH2O为阴性对照。
4.第二轮RAA等温扩增：反应体系：buffer A 25μL，Buffer B 2.5μL，表4方案一中的T7 Promoter-F、PEDV-crRNA6-F1、PEDV-crRNA6-R各0.4μM，第一轮RAA等温扩增的产物，补RFH2O至50μL。反应程序如下：37℃，30min。RFH2O为阴性对照。
5.体外转录&Cas蛋白酶切，反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μL T7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮RAA等温扩增的产物，2μL NEB buffer2.1，500nM ssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应30min。qPCR仪检测每30s检测一次荧光强度。
6.实验结果：如图13所示：在拷贝数低于2×106的情况下，30min以内检测结果呈线性增长，而NTC的荧光强度都很高，且同样呈线性化增长，说明该体系会影响探针的稳定。该方法特异性差，完全不适用于检测。
实施例5本发明方案用于检测VSV病毒的特异性和灵敏度测试
1.本实施例中，根据实施例3中方案一的设计方案对疱疹病毒样品进行特异性和灵敏度检测。
2.本实施例中三种检测样品：标准质粒、试剂盒提取的RNA、释放剂释放的病毒RNA。三种检测样品分别经过以下处理：①VSV28线性化的标准质粒并将其稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL；②使用takara公司的RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 9767)提取的VSV28病毒的RNA，经过qPCR定量后，分别稀释至1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL；③将VSV28病毒液稀释后与商用释放剂按1:2处理后的RNA样品，病毒RNA浓度依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL。
3.首轮RT-PCR扩增：配置20μL PCR反应液，其中2×One Step Mix(Dye Plus)10μL，One Step Enzyme Mix 1μL，表4方案一中引物VSV-L-nested F、VSV-L-nested R各0.4μM，模板为步骤2中所述的所有样品及ddH2O，Nuclease-free water加至20μL，进行扩增。扩增程序：50℃30min；95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行20个循环。
4.第二轮PCR扩增，配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)25μL，表4方案一中引物T7 Promoter-F、VSV-L-crRNA-F、VSV-L-crRNA-R各0.4μM，以首轮RT-PCR扩增中所有的产物为模板，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环。
5.体外转录&Cas蛋白酶切，反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μL T7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮PCR扩增产物，2μL NEB buffer2.1，500nMssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应30min。qPCR仪检测，每分钟检测一次荧光强度。
6.根据探针修饰方式不同使用不同的检测方式：①qPCR仪检测：利用qPCR仪每min检测一次荧光强度；②蓝光或紫外光显色：37℃反应30min后在凝胶成像仪中进行拍照。
7.实验结果：如图14至图17所示，本发明方法可直接用于RNA病毒检测，三种模板的检测限可达1copy/μL的病毒水平，NTC的荧光增量很小，特异性很好。
实施例6本发明方案用于新冠假病毒的检测
1.针对新冠病毒株Severe acute respiratory syndrome coronavirus2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome(NCBI参考序列：NC_045512.2)保守基因E基因、N基因和orf1ab(基因组坐标:13201-15600)三个基因分别设计了多组靶点特异性的识别序列并进行脱靶分析，各筛选出3条特异性好、低脱靶的靶标序列，并按实施例1的方案验证其切割活性，分别确定一个靶标序列，并根据实施例3的方案一设计其相应的检测引物，引物见表5。
表5实施例6中检测新冠假病毒所采用的序列列表
2.本实施例中两种检测样品：标准质粒和释放剂释放的病毒RNA。将保守基因E基因、N基因、orf1ab(基因组坐标:13201-15600)和内参基因分别构建到慢病毒包装载体上，内部编号依次为Lv1327、Lv1326、Cov31并进行病毒包装。两种检测样品分别经过以下处理：①线性化的Lv1327、Lv1326、Cov31标准质粒并将其稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL；②将Lv1327、Lv1326病毒液稀释后与商用释放剂按1:2处理后的病毒RNA，病毒RNA浓度依次为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL；将Cov31病毒液稀释至依次为1x104、1x103、1x102、1x101、1x100copy/μL
3.首轮RT-PCR扩增：配置20μL PCR反应液，其中2×One Step Mix(Dye Plus)10μL，One Step Enzyme Mix 1μL，表5中各基因的nested F、nested R各0.4μM，模板为步骤2中所述的所有样品及ddH2O，Nuclease-free water加至20μL，进行扩增。扩增程序：50℃30min；95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行20个循环。
4.第二轮PCR扩增，配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)25μL，表5中各基因的引物T7 Promoter-F、crRNA-F、crRNA-R各0.4μM，模板(以首轮RT-PCR扩增中所有的产物为模板)2μL，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环。
5.体外转录&Cas蛋白酶切，反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μL T7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮PCR扩增产物，2μL NEB buffer2.1，500nMssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应40min。
6.根据探针修饰方式不同使用不同的检测方式：①qPCR仪检测：利用qPCR仪每30s或1min检测一次荧光强度；②蓝光或紫外光显色：37℃反应30min后在凝胶成像仪中进行拍照。
7.实验结果：本发明方法可直接用于RNA病毒检测，如图18至图22所示，E、N基因病毒检测限可达1×100copy/μL的病毒水平，而如图23、图24所示，Orf1ab病毒检测限可达1×101copy/μL的病毒水平，且特异性很好。
实施例7本发明方案用于DNA病毒的检测
1.针对痘病毒Vaccinia virus WR strain WR-ATCC VR-2035genome assembly,complete genome_monopartite_GenBank_LT966077.1保守基因A56R基因设计了多组靶点特异性的识别序列并进行脱靶分析，筛选出3条特异性好、低脱靶的靶标序列，并按实施例1的方案验证其切割活性，确定一个靶标序列，并根据实施例3的方案一设计其相应的检测引物，引物见表6。
表6实施例7中检测痘病毒所采用的序列列表
2.本实施例中两种检测的样品：标准质粒和释放剂释放的A56R病毒。两种检测样品分别经过以下处理：①线性化的CC-241标准质粒并将其稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL；②将病毒液稀释后与商用释放剂按1:2处理后的病毒DNA，病毒DNA浓度依次为1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL。
3.首轮PCR扩增：配置20μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)10μL，表6中A56R-nested F、A56R-nested R各0.4μM，模板为步骤2中所述的所有样品及ddH2O，Nuclease-free water加至20μL，进行扩增。扩增程序：95℃3min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行20个循环。
4.第二轮PCR扩增：配置50μL PCR反应液，其中2×Max Master Mix(DyePlus)25μL，表6中引物T7 Promoter-F、A56R-crRNA-F、A56R-crRNA-R各0.4μM，首轮PCR扩增中所有的产物，补水至50μL进行扩增。扩增程序：95℃2min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行35个循环。
5.体外转录&Cas蛋白酶切：反应体系：0.5μL 10×reaction buffer，dNTP各0.5μL，0.5μLT7 RNA Polymerase Mix，10μL第二轮PCR扩增产物，2μL NEB buffer2.1，500nMssDNA reporter，250nM Lba Cas12a蛋白，Nuclease-free water加至20μL。37℃反应30min。
6.根据探针修饰方式不同使用不同的检测方式：①qPCR仪检测：利用qPCR仪每30s检测一次荧光强度；②蓝光或紫外光显色：37℃反应30min后在凝胶成像仪中进行拍照。
7.实验结果：如图25至图27所示，本发明方法可直接用于DNA病毒检测，其检测灵敏度可达1×101copy/μL的病毒水平，且阴性对照荧光增量较小，非特异性强。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括crDNA扩增引物对、Cas12a蛋白、用于变温扩增的DNA聚合酶、RNA聚合酶和单链DNA报告分子；
所述crDNA扩增引物对包含启动子序列，用于扩增能够体外转录产生crRNA的转录模板，所述crRNA包括用于与所述Cas12a蛋白结合的锚定序列和用于靶向靶标序列的向导序列，所述向导序列的长度为43bp～75bp；
所述crDNA扩增引物对包括第二引物对和第三引物对，所述第二引物对包括crRNA-F和crRNA-R，所述crRNA-F的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，部分所述向导序列的长度为15bp～23bp；所述第二引物对用于扩增得到crRNA对应的DNA片段，即crDNA；
所述第三引物对包括通用型引物和crRNA-R，所述通用型引物的5’至3’序列依次由所述启动子序列和所述锚定序列对应的DNA序列组成；所述第三引物对以所述第二引物对扩增得到的crDNA为模板，用于扩增得到包含所述启动子序列和所述crDNA的片段，即所述能够体外转录产生crRNA的转录模板。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述启动子为T7启动子、T3启动子或SP6启动子。
3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述第二引物对中的一条引物的5’至3’序列依次由所述锚定序列对应的DNA序列、PAM序列和部分所述向导序列对应的DNA序列组成，所述PAM序列为5’-TTTN-3’，部分所述向导序列的长度为15bp～23bp。
4.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括用于特异性扩增所述靶标序列的第一引物对，所述crDNA扩增引物对对应的扩增片段位于所述第一引物对对应的扩增片段内部。
5.根据权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告分子的序列为5’-TTTTTTTTATTT-3’。
7.根据权利要求6所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告分子的5’端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团，或者所述单链DNA报告分子的5’端标记荧光基团、3’端标记生物素。
8.根据权利要求1-7任一所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括逆转录酶，用于将靶RNA逆转录成DNA。
9.根据权利要求1-7任一所述的核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括核酸释放剂，用于释放待检测样品中的核酸。
10.权利要求1-9任一所述的核酸检测试剂盒在非诊断目的的检测或辅助检测病毒核酸中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述病毒为痘病毒、杆状病毒、水疱疹性口炎病毒、猪腹泻病毒和新型冠状病毒中的一种或多种。
12.一种非诊断目的的利用权利要求1-9任一所述的核酸检测试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以待检测核酸为模板，采用crDNA扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
S2、将所述PCR产物与Cas12a蛋白、RNA聚合酶和单链DNA报告分子混合，在同一体系中进行体外转录和Cas12a蛋白酶切反应；
S3、反应完成后，进行检测结果判读。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤S1中，先以所述待检测核酸为模板，采用第一引物对进行第一次PCR扩增；再以所述第一次PCR扩增得到的产物为模板，采用所述crDNA扩增引物对进行第二次变温PCR扩增，得到PCR产物。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤S1中，所述待检测核酸利用病毒核酸提取试剂对待检测样品抽提核酸得到，或者通过将待检测样品直接浸入核酸释放剂中得到。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤S2中，所述体外转录和Cas12a蛋白酶切反应的条件为37℃反应5min～40min。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤S3中，利用qPCR仪、蓝光或紫外光照或者胶体金免疫层析试纸进行检测结果判读。
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