CN112481358A

CN112481358A - 一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法及其应用

Info

Publication number: CN112481358A
Application number: CN202011250269.7A
Authority: CN
Inventors: 白净卫; 刘册; 杜娟娟
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2021-03-12

Abstract

本发明涉及一种快速、高灵敏度的巢式重组酶‑聚合酶扩增检测方法、以及相关核酸快速检测方法、巢式重组酶‑聚合酶扩增检测试剂盒。可快速且高灵敏度地对核酸进行检测，反应过程无需配制两个反应试剂，直接反应即可获得能够进行灵敏检测的反应产物，极大减化了核酸检测操作步骤，降低了操作复杂性，提高了灵敏度。

Description

一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法、以及相关核酸快速检测方法、巢式重组酶-聚合酶扩增检测试剂盒。

背景技术

重组酶-聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。最初由ASM scientific,Inc.于2003年申请专利(EP1499738B1)。此类扩增反应又被称为recombinase-aid amplification(RAA)，Multienzyme Isothermal Rapid Amplification(MIRA)和体温扩增技术(STAMP)。其基本原理都为重组酶与引物形成组合体(filament)，入侵到底物核酸template strand进行，对双链进行打开，结合到引物互补的部位；接着具有standed displacement能力DNA聚合酶作用下，在引物3‘端开始合成互补链。Displaced的单链由单链结合蛋白所结合，组装原双链的复合。以上扩增反应已经被商业化，用来检测目的片段和核酸，通常也配有标签probe来提高特异性。

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，其基本原理为：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物(filament)，入侵到底物核酸template stra^nd进行，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，在DNA聚合酶作用下，在引物3‘端开始合成互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被置换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。

RPA检测技术的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物并不能直接用于RPA检测，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。可见RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要大量的摸索和测试才能获得理想的引物和探针。

为了提高RPA对于核酸检测的灵敏度，还可以通过巢式反应的方式进行扩增，主要思路是设计两对引物，第二对引物完全以第一对引物的扩增产物为底物进行扩增，且两对引物没有或者只有少量的重叠。巢式反应的反应过程是先用第一对引物进行扩增(第一步RPA反应)，吸取少量(1/5～1/10)的反应产物加入到含有第二对引物的反应体系中进行扩增(第二步RPA反应)。最后通过试纸条或者荧光的方式进行检测。这一过程需要在第一步反应结束后进行稀释，稀释后产物加入第二步反应的试剂(包括酶、添加剂、引物等)才能进行第二步的反应，两步反应均需配制不同的试剂。

因此可以看出，巢式RPA反应可以大大提高RPA的检测灵敏度，但缺点也是明显的:

1.整个反应需要两管RPA试剂，使得反应试剂成本加倍。

2.巢式RPA需要分别配制两个反应，增加操作时间和难度，难以实现自动化。

3.巢式RPA中间需要吸取转移反应产物，增加了产物扩散污染的风险。

4.巢式RPA只是将少量的第一步产物加入到第二步反应之中，反应的灵敏度和稳定性都有待提高。

在实践中，待检测核酸来源复杂，数量巨大，经常面临急需拿到准确的检测结果的情形，如何获得更加明显的检测信号是急需解决的问题。针对上述检测缺陷以及临床检测困难，本发明提出一种新的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法(Simplified One-TubeNest-RPA，SOTN RPA)，所述方法虽然包括两步RPA(或RT-RPA)反应，但整个反应需要一管RPA试剂，本发明的发明人创造性的发现在第二步RPA反应时，直接在第一步反应的全部或部分产物中直接加入扩增的第二步反应的引物和探针继续扩增即可，中间无需吸取转移反应产物，也无需配制两个反应试剂，直接反应即可获得能够进行灵敏检测的反应产物。在各类场景的核酸检测中，使用这一技术能够实现快速高灵敏度的检测。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法、以及相关核酸快速检测方法、巢式重组酶-聚合酶扩增检测试剂组合或试剂盒。可快速且高灵敏度地对核酸进行检测，反应过程无需配制两个RPA反应试剂，直接反应即可获得能够进行灵敏检测的反应产物，极大减化了核酸检测操作步骤，降低了操作复杂性。

本发明的目的之一在于，提供一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法，所述方法包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，具体步骤为：1)配制反应体系使用第一对引物对进行第一步RPA或RT-RPA反应进行扩增；2)在步骤1)的全部或部分产物中直接加入第二对引物对和/或探针继续扩增反应获得反应产物。

第一步反应完成后，反应液可不经过纯化，直接作为第二步反应的核酸模板溶液进入第二步反应。

具体的，所述第二步RPA反应的第二引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应第一引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。

具体的，所述第一步RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。

具体的，所述第二步RPA是带有探针的RPA，且里面可添加可以识别/thf/或者/idSp/的核酸内切酶。

具体的，所述步骤2)可以与步骤1)在同一个容器中进行，也可以在不同容器中进行。

更进一步地，所述方法的所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为5-30min。优选的，所述第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应时间均不超过10分钟，更优地均不超过5分钟；两步RPA反应总时间均不超过15分钟，优选的，分别为10-15min。

更进一步地，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃或42℃。

优选的，步骤2)的第二步扩增反应中，探针被切割后的带有第一标记的产物与第二步中的带有第二标记的引物组成引物对，参与扩增并形成一端带有第一标记，一端带有第二标记的双链DNA，所述第一标记和第二标记分别选自FAM、FITC、BIOTIN、地高辛和TAMRA中的任意一种。

优选的，所述步骤1)使用第一步RPA或RT-RPA反应试剂进行，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂包括第一步RPA或RT-RPA反应的第一对引物对、缓冲液和/或RPA反应物。RPA反应物可以是商业化的任意的RPA反应所需的试剂或试剂盒等，也可自行实验室进行配制获得的RPA反应所需的试剂，其可以是液体，也可以是干粉。

优选的，所述步骤2)使用第二步RPA反应试剂进行，所述第二步RPA反应试剂包括所述第二对引物对和/或探针。

优选的，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂进一步包括选自醋酸镁、DEPC水和/或裂解液。裂解液可以是商业化的任意的裂解液试剂或试剂盒等，也可自行实验室进行配制获得的裂解液。

优选的，所述第二步RPA反应试剂只包括第二步RPA反应的引物对和探针。

本发明的目的还在于，提供一种核酸快速检测方法，其包括如下步骤：

(1)获得待检测核酸；部分样品可进行稀释，也可不进行稀释直接扩增。

(2)使用前述任意的巢式重组酶-聚合酶扩增方法扩增步骤(1)的核酸，反应获得反应产物；

(3)将反应产物稀释后插入胶体金试纸条进行胶体金显色。

具体的，所述步骤(3)的胶体金显色具体为：取第二步RPA反应产物加入到DEPC水中混合均匀进行稀释，吸取稀释产物置于胶体金点样孔中显色拍照。

所述方法还包括荧光探针检测步骤。

优选的，步骤(2)的第二步扩增反应中，探针被切割后的带有FAM(或FITC)的产物与第二步中的带有biotin的引物组成引物对，参与扩增并形成一端带有FAM(或FITC)，一端带有biotin的双链DNA，此时在胶体金层析中通过夹心法被显色。此时胶体层析试纸可设置为：胶体金表面为链霉亲和素(或者FAM/FITC抗体)，第一条线T线为FAM/FITC抗体(或者链霉亲和素)，第二条线C线为链霉亲和素抗体(或者anti-IgG抗体)。

本发明的目的还在于，提供一种试剂盒，其包含前述任意所述方法的引物对、探针、试剂、试纸条和/或其组合。

本发明的目的还在于，提供一种用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一步RPA或RT-RPA反应试剂和第二步RPA反应试剂，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂包括第一步RPA或RT-RPA反应的引物对、缓冲液和RPA反应物，第二步RPA反应试剂包括第二步RPA反应的引物对和/或探针。

具体的，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂进一步包括选自醋酸镁、DEPC水和/或裂解液。

具体的，所述第二步RPA反应试剂只包括第二步RPA反应的引物对和/或探针。

具体的，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂和第二步RPA反应试剂独立包装。

具体的，所述检测试剂盒还包括显色试纸条，所述显色试纸条是胶体金试纸条。

更进一步地，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂反应完毕获得第一步产物后，在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步RPA反应试剂。

更进一步地，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂还包括第一反应容器，所述第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应均在第一反应容器中进行。

另外还可以是，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂还包括第一反应容器，所述第二步RPA反应试剂还包括第二反应容器，所述第一步RPA或RT-RPA反应在第一反应容器进行，在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步RPA反应试剂的过程在第二反应容器中进行。

另一方面，本发明还涉及前述任选的扩增或检测方法中涉及的引物对、探针和/或序列组合在制备检测试剂盒中的用途。

本发明有益效果：

1、本发明涉及的快速、高灵敏度的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法，整个反应需要一管RPA试剂，中间无需吸取转移反应产物，也无需配制两个RPA反应试剂，直接反应即可获得能够进行灵敏检测的反应产物，极大减化了核酸检测操作步骤，降低污染风险以及操作复杂性，可快速且高灵敏度地对核酸进行检测，操作简单易行，成本低廉，适合用于临床快速检测。

2、本发明的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法，能够降低RPA反应过程中引物浓度消耗，保证反应体系中的有效引物浓度水平，避免反应停滞。

3、本发明的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法检测灵敏度可达到2copies-5copies/50ul。且检测方法具有普适性，可适用于各种核酸样本的检测。

4、对于痕量的核酸检测，无法通过一步RPA来得到足够的扩增倍数，从而获得明显的信号，本发明的巢式重组酶-聚合酶扩增检测方法，提高扩增倍数，提供有效的检验极低浓度的核酸信号，对于检测痕量核酸样品具有较高的灵敏度，在荧光信号放大方面具有更明显的技术优势，且通过胶体金试纸读取的方式进行结果读取，无需其他仪器。

5、常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。本发明RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在接近常温的恒温条件下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增的速度。此外，由于不需要复杂的温控设备，本发明的RPA技术可以真正实现便携式的快速核酸检测。

附图说明

图1为本发明快速、高灵敏度的重组酶-聚合酶扩增方法示例性流程图。

图2为RPA反应过程中有效引物浓度的变化实验结果。

图3为A:RPA反应过程中ATP浓度变化标准曲线；B:RPA反应过程中ATP浓度变化实验结果。

图4为RPA反应中途添加第二对primer对扩增效率的影响实验结果。

图5为本发明的SOTN RPA检测法对于新冠病毒三种基因的单独检测灵敏度实验结果。

图6为本发明的SOTN RPA检测法对于双基因(E基因，ORF1ab基因)的检测灵敏度实验结果。

图7为本发明的SOTN RPA检测法对于ZS-Green假病毒的检测灵敏度实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1研究RPA反应过程中有效引物浓度的变化

1.试剂仪器准备

SARS-Cov2病毒RNA样品购自国家标准物质(标准物质编号：GBW(E)091099。

RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

Basic RT kit

2X RNA loading dye购自thermo fisher公司，货号为R0641

SYBR gold染料购自thermo fisher公司，货号为S11494

多功能荧光成像仪，型号：Typhoon FLA9500

2.实验步骤

1)将新冠病毒RNA按照E基因浓度，稀释至500copies/ul。

2)将新冠病毒E基因引物用DEPC水稀释至10Um。引物序列如下：

E-Primer F：TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID NO:3)

E-Primer R：TAMRA-AGAATTCAGATTTTTAACACGAGAGTAAACGT(SEQ IDNO:4)

3)RPA反应体系配置

注：根据实验分组不同，RNA加入的体积不同(设置为x)，DEPC水加RNA的总体积是14.1ul。

上述成分配置好后，直接加入到RPA反应干粉中形成RPA反应体系。

4)分别在反应体系中加入1ul(500copies RNA)和0ul RNA模板，设置PCR仪器温度为42℃，分别在0min，10min，20min，30min取出5ul样品，放入液氮中速冻保存。

5)待所有样品收集完毕后，加入5ul 2x RNA loading dye，95℃加热10min。取2ul上样12％denatured page胶。

6)设设置电压160V，运行40min。

7)跑胶结束后使用SYBR gold染料进行染色10min。

8)使用台风多功能激光成像仪(型号：FLA9500)进行成像拍照。

3.实验结论

1)在RPA反应的前10min，引物大量消耗。

2)RPA反应过程中实验组(500copies RNA)和对照组(0copy RNA)都有大量非特异产产物生成(NS products)

3)实验组(500copies)在10～20min时产物(products)浓度达到峰值。

4)引物消耗可能是RPA反应后期产物浓度到达平台期的主要原因。

5)实验结果图见图2。

实施例2研究RPA反应过程中ATP浓度变化

1.试剂仪器准备

RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

Basic RT kit

增强型ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，货号：S0027

多功能酶标仪，型号：TECAN spark

2.实验步骤:

1)将新冠病毒RNA按照E基因浓度，稀释至500copies/ul。

2)将新冠病毒E基因引物用DEPC水稀释至10uM。

引物序列如下：

E-Primer F：

TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID NO:3)

E-Primer:

TAMRA-AGAATTCAGATTTTTAACACGAGAGTAAACGT(SEQ ID NO:4)

3)RPA反应体系配置

4)在反应进行的0min，2min，5min，10min，20min，30min分别取1ul样品溶解1ml裂解液(碧云天，S0027-4)中，冰上保存。每个时间点做三个实验重复。

5)ATP含量测定(参考碧云天S0027产品说明书)

a)标准曲线测定的准备

将ATP标准溶液(S0027-3)用裂解液稀释成0.01，0.03，0.1，1，3，10uM浓度梯度。

b)ATP检测工作液配置

取600ul ATP检测试剂(S0027-1)加入到2400ul ATP检测试剂稀释液(S0027-2)中，吹打混匀，冰上保存。

c)ATP浓度测定

d)吸取100ul ATP检测工作液加入到96孔板中，室温放置3min。取10ul待测样品和标准曲线样品加入到工作液中，吹打混匀，静置1min。

e)使用多功能酶标仪测定化学发光值。

3.实验结论

1)实验结果见图3

2)30min的RPA反应过程中ATP浓度下降约30％

3)30min后ATP浓度逐渐趋于平稳，说明ATP浓度下降并非RPA反应变慢的主要原因。

实施例3研究RPA反应中途添加两对primer对扩增效率的影响

1.试剂仪器准备

SARS-Cov2病毒RNA样品购自国家标准物质(标准物质编号：GBW(E)091099。RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

Basic RT kit胶体金试纸条购自北京库尔科技有限公司

2.实验步骤

1)将新冠病毒RNA按照E基因浓度，稀释至10copies/ul。

2)将新冠病毒E基因引物用DEPC水稀释至10uM。引物序列如下：

E-Primer F：ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID NO:1)

E-primer R：AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID NO:2)

E-2^ndprimer F：TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID NO:3)

E-2^ndprimer R：AGAATTCAGATTTTTAACACGAGAGTAAACGT(SEQ ID NO:4)

E-probe：

5’FAM-TTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT[thf]GTGTGCGTACTGCTG-C

3spacer(SEQ ID NO:5)。

3)RPA反应体系配置

4)在RPA反应体系中分别加入2ul(10copies/ul)和0ul RNA模板，震荡混匀。设置PCR仪温度为42℃，加热10min。

5)反应结束后，在反应体系中加入E-2^nd primer F，E-2^nd primer R，和E-probe体积分别为2ul，2ul，0.6ul，震荡混匀。42℃加热10min。

6)反应结束后，从反应体系中取出20ul反应产物，加入180ul水中，混匀。插入胶体金试纸条，2min后读取结果。

3.实验结论

1)实验结果见图4。

2)通过中途添加第二对引物，可以检测到20copies病毒RNA。

3)引物的消耗是RPA反应后续变慢的主要原因之一。

实施例4本发明的SOTN RPA检测法检测SARS-CoV2核酸灵敏度

1.试剂仪器准备

RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

nfo kit

胶体金试纸条购自北京库尔科技有限公司

2.实验步骤

1)将新冠病毒RNA分别按照E基因，N基因，ORT1ab基因浓度，稀释至10copies/ul。

2)将新冠病毒E基因引物，N基因引物，ORF1ab基因引物用DEPC水稀释至10uM。

引物序列如下：

E-Primer F：ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID NO:1)

E-primer R：AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID NO:2)

E-2^ndprimer F：TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID NO:3)

E-2^ndprimer R：Biotin-AGAATTCAGATTTTTAACACGAGAGTAAACGT(SEQ ID NO:4)

E-probe：FAM-TTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT[thf]GTGTGCGTACTGCTG-C3spacer(SEQ ID NO:5)

N-primer F：TTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAG(SEQ ID NO:6)

N-primer R：CTTAGAAGCCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTG(SEQ ID NO:7)

N-2^ndprimer F：AAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGG(SEQ ID NO:8)

N-2^ndprimer R：ACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTTTA(SEQ ID NO:9)

N-probe：FAM-AACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGG[thf]GGTGATGCTGCTCTTGC-C3spacer(SEQ ID NO:10)

ORF1ab-primer F：TGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCT(SEQ IDNO:11)

ORF1ab-primer R：TCTTCATGTTGGTAGTTAGAGAAAGTGTGTCT(SEQ IDNO:12)

ORF1ab-2^ndprimer F：TCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACG(SEQ IDNO:13)

ORF1ab-2^ndprimer R：5’TAMRA-CTTGGAAGCGACAACAATTAGTTTTTAGGA(SEQ ID NO:14)

ORF1ab-probe

5’FAM-AGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACT/idSp/GTACTGATGTCGTAT-C3Spacer(SEQ ID NO:15)

3)配置RPA反应体系

4)实验分组

5)设置PCR仪温度为42℃，反应10min。

6)反应结束后，加入各自基因的2^nd primer F：2ul，2^nd primer R：2ul，probe：0.6ul。震荡混匀，42℃反应10min。

7)反应结束后，取20ul反应产物加入180ul水中，震荡混匀，插入试纸条。2min后读取结果。

3.实验结论

1)实验结果见图5；

2)本发明的SOTN RPA检测法对于新冠病毒三种基因的单独检测灵敏度都达到了2copies/50ul。

实施例5本发明的SOTN RPA检测法对于双基因检测灵敏度实验

1.试剂仪器准备

RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

nfo kit

胶体金试纸条购自北京库尔科技有限公司

2.实验步骤

1)将新冠病毒RNA分别按照E基因浓度，稀释至10copies/ul。

2)将新冠病毒E基因引物，ORF1ab基因引物用DEPC水稀释至10uM。引物序列如下：

E-Primer F：ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGG(SEQ ID NO:1)

E-primer R：AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAA(SEQ ID NO:2)

E-2^ndprimer F：TTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGC(SEQ ID NO:3)

E-2^ndprimer R：Biotin-AGAATTCAGATTTTTAACACGAGAGTAAACGT(SEQ ID NO:4)

ORF1ab-primer F：TGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCT(SEQ ID NO:11)

ORF1ab-primer R：TCTTCATGTTGGTAGTTAGAGAAAGTGTGTCT(SEQ ID NO:12)

ORF1ab-2ndprimer F：TCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACG(SEQ IDNO:13)

ORF1ab-2ndprimer R：5’TAMRA-CTTGGAAGCGACAACAATTAGTTTTTAGGA(SEQID NO:14)

ORF1ab-probe：5’FAM-AGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACT/idSp/GTACTGATGTCGTAT-3’Spacer(SEQ ID NO:15)

3)RPA反应体系配制

4)在RPA反应体系中分别加入10copies，5copies，2copies，0copy RNA模板，震荡混匀，42℃反应10min。随后添加1ul E-2^nd primer F，1ul E-2^nd primer R，0.6ulE-Probe，1ul ORF1ab-2^nd primer F,1ul ORF1ab-2^nd primer F，0.6ul ORF1ab-probe。震荡混匀，42℃反应10min。

5)反应结束后，分别吸取20ul产物，加入到180ul水中，混合均匀。插入胶体金试纸条2min后读取结果。

3.实验结论

1)实验结果见图6。

2)本发明的SOTN RPA检测法对于双基因(E基因，ORF1ab基因)的检测灵敏度达到2copies/50ul。

实施例6本发明的SOTN RPA检测法检测ZS-green核酸灵敏度

1.试剂仪器准备

ZS-green假病毒样品购自复百澳(苏州)生物科技有限公司。

RPA反应试剂盒购自英国TwistDX公司，产品型号为Twist

nfo kit

胶体金试纸条购自北京库尔科技有限公司

Triton X-100购自sigma公司,产品货号为：T9284-100ML

NP-40购自sigma公司，产品货号为：NP40S-500ML

2.实验步骤

1)将ZS-Green假病毒提取核酸后，qPCR定量，稀释至10copies/ul

2)ZS-Green基因引物稀释至10uM。引物序列如下：

ZS-Primer F：GGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCT(SEQ ID NO:16)

ZS-primer R：CCCAGTTGTCGGTCATCTTCTTCATCAC(SEQ ID NO:17)

ZS-2^nd primer F：TACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGA(SEQ ID NO:18)

ZS-2^nd primer R：Biotin-GTCGGCGGGGAAGTTCACGCCGTAGAAC(SEQ IDNO:19)

ZS-probe：FAM-CGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTG/idSp/GCGTGGAGGAGAACT-C3spacer(SEQ ID NO:20)

1)RPA反应体系配制

先将Rehydration buffer，primer，水震荡混匀。加入假病毒，震荡混匀，立即加入到RPA反应干粉中。

2)设置PCR仪温度为42℃，孵育10min。

3)反应结束后，加入2ulZS-2^ndprimer F，2ul ZS-2^ndprimer R,0.6ul ZS-Probe，震荡混匀，42℃孵育10min。

4)反应结束后，取20ul反应产物加入到180ul水中，稀释混匀。插入胶体金试纸条，2min后读取显色结果。

1.实验结论

1)实验结果见图7。

2)本发明的SOTN RPA检测法对于ZS-Green RNA的检测灵敏度达到5copies/50ul。

上述结果显示，通过测量RPA反应过程中引物浓度，以及ATP含量的动态变化，验证了引物消耗是单步RPA反应持续扩增时间较短的原因；研究RPA反应中途添加第二对primer对扩增效率的影响进一步明确了RPA反应中有效引物浓度的消耗是造成反应停滞的原因。

使用本发明的SOTN RPA检测法检测新冠核酸、新冠假病毒、Zs-green假病毒，检测灵敏度可达到2copies-5copies/50ul。检测出新冠核酸样本的三个基因位点(ORF1ab，N基因，E基因)检测灵敏度达到2copies/reaction。同时SOTN RPA还可以灵敏的检测出来源于珊瑚虫的ZS-Green基因(假病毒包被)，检测灵敏度达到5copies/reaction，证明了这种方法的普适性。因此，本发明的检测方法对于检测痕量核酸样品具有较高的灵敏度，在荧光信号放大方面具有更明显的技术优势。

本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法及其应用

<130> 1

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtactcat tcgtttcgga agagacagg 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaccagaag atcaggaact ctagaagaa 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctttttct tgctttcgtg gtattcttgc 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaattcaga tttttaacac gagagtaaac gt 32

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacactagc catccttact gcgcttcgat gtgtgcgtac tgctg 45

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcctcatca cgtagtcgca acagttcaag 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttagaagcc tcagcagcag atttcttagt g 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagaaattca actccaggca gcagtagggg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagtttggc cttgttgttg ttggccttta 30

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg ggtgatgctg ctcttgc 47

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtagttgtg atcaactccg cgaacccatg ct 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcttcatgtt ggtagttaga gaaagtgtgt ct 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagtcagct gatgcacaat cgtttttaaa cg 32

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttggaagcg acaacaatta gtttttagga 30

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcccgtctt acaccgtgcg gcacaggcac tgtactgatg tcgtat 46

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggacatcgtc gactacttca agaactcct 29

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccagttgtc ggtcatcttc ttcatcac 28

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tacacctggg accgctcctt cctgttcga 29

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcggcgggg aagttcacgc cgtagaac 28

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgtgtgcatc tgcaacgccg acatcaccgt ggcgtggagg agaact 46

Claims

1.一种巢式重组酶-聚合酶扩增方法，其特征在于，所述方法包括第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应，具体步骤为：1)配制反应体系使用第一对引物对进行第一步RPA或RT-RPA反应进行扩增；2)在步骤1)的全部或部分产物中直接加入第二对引物对和/或探针继续扩增反应获得反应产物。

2.根据权利要求1的扩增方法，其特征在于，所述第二步RPA反应的第二引物对位于所述第一步RPA或RT-RPA反应第一引物对扩增获得的模板内，且与第一步RPA反应第一引物对不重叠或小于10bp的重叠。

3.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应分别可用于DNA或RNA的扩增。

4.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第二步RPA是带有探针的RPA，且里面可添加可以识别/thf/或者/idSp/的核酸内切酶。

5.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述步骤2)可以与步骤1)在同一个容器中进行，也可以在不同容器中进行。

6.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述方法的所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应时间分别为5-30min；优选的，分别为10-15min。

7.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应或第二步RPA反应的反应温度为35℃到45℃，优选的是37℃-42℃，更优选的是37℃或42℃。

8.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，步骤2)的第二步扩增反应中，探针被切割后的带有第一标记的产物与第二步中的带有第二标记的引物组成引物对，参与扩增并形成一端带有第一标记，一端带有第二标记的双链DNA，所述第一标记和第二标记分别选自FAM、FITC、BIOTIN、地高辛和TAMRA中的任意一种。

9.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述步骤1)使用第一步RPA或RT-RPA反应试剂进行，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂包括第一步RPA或RT-RPA反应的第一对引物对、缓冲液和/或RPA反应物。

10.根据权利要求1或2的扩增方法，其特征在于，所述步骤2)使用第二步RPA反应试剂进行，所述第二步RPA反应试剂包括所述第二对引物对和/或探针。

11.根据权利要求9或10的扩增方法，其特征在于，所述第二步RPA反应试剂只包括第二步RPA反应的引物对和/或探针。

12.一种核酸快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)获得待检测核酸；

(2)使用权利要求1-11任意一项所述的巢式重组酶-聚合酶扩增方法扩增步骤(1)的核酸，获得反应产物；

(3)将反应产物稀释后插入胶体金试纸条进行胶体金显色。

13.根据权利要求12的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的胶体金显色具体为：取第二步RPA反应产物加入到DEPC水中混合均匀进行稀释，吸取稀释产物置于胶体金点样孔中显色拍照。

14.根据权利要求12或13的检测方法，其特征在于，所述方法还包括荧光探针检测步骤。

15.根据权利要求12或13的检测方法，其特征在于，所述胶体金显色为夹心法。

16.根据权利要求15的检测方法，其特征在于，所述胶体层析试纸设置为：胶体金表面为链霉亲和素或FAM(或者FITC)抗体或TAMRA抗体或地高辛抗体。

17.根据权利要求15或16的检测方法，其特征在于，第一条T线为FAM(或者FITC)抗体或TAMRA抗体或地高辛抗体或链霉亲和素；T线与胶体金表面修饰的与小分子结合的大分子分别对应探针与下游引物上修饰的小分子标记物，第二条C线为抗IgG的抗体或者链霉亲和素抗体。

18.一种试剂盒，其特征在于，其包含用于权利要求1-11或权利要求12-17任意一项所述方法的引物对、探针、试剂、试纸条和/或其组合。

19.一种用于巢式重组酶-聚合酶扩增方法的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括第一步RPA或RT-RPA反应试剂和第二步RPA反应试剂，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂包括第一步RPA或RT-RPA反应的引物对、缓冲液和RPA反应物，第二步RPA反应试剂包括第二步RPA反应的引物对和/或探针。

20.根据权利要求19的检测试剂盒，其特征在于，所述第二步RPA反应试剂只包括第二步RPA反应的引物对和/或探针。

21.根据权利要求19或20的检测试剂盒，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂和第二步RPA反应试剂独立包装。

22.根据权利要求19或20的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括显色试纸条。

23.根据权利要求22的检测试剂盒，其特征在于，所述显色试纸条是胶体金试纸条。

24.根据权利要求19或20的检测试剂盒，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂反应完毕获得第一步产物后，在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步RPA反应试剂。

25.根据权利要求19或20的检测试剂盒，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂还包括第一反应容器，所述第一步RPA或RT-RPA反应和第二步RPA反应均在第一反应容器中进行。

26.根据权利要求19或20的检测试剂盒，其特征在于，所述第一步RPA或RT-RPA反应试剂还包括第一反应容器，所述第二步RPA反应试剂还包括第二反应容器，所述第一步RPA或RT-RPA反应在第一反应容器进行，在全部或部分所述第一步产物中直接加入第二步RPA反应试剂的过程在第二反应容器中进行。