CN115725801A - 一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，公开了一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒。本发明中用于检测新冠病毒变异株的引物对的序列如SEQ ID NO:1‑22所示；用于检测新冠病毒变异株的探针的序列如SEQ ID NO:23‑33所示。采用上述引物对和探针，可一次性实现对Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、Omicron BA.2.12.1、Omicron BA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5在内的多种新冠病毒变异株的分型，且检测特异性和检测灵敏度良好。

Description

一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒由最先的原始病毒至今已发展产生多种变异毒株，其中以Delta变异株和Omicron变异株最为典型，而Omicron变异株的种类更是已发展至包含BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5在内的众多类型。在现今，不仅仅要求对样品中是否包含新冠病毒进行检测，还需要对新冠病毒进行分型和鉴定。然而，采用全基因组测序的方法进行新冠病毒分型存在着成本较高，较为繁琐的不足，而现有核酸检测试剂盒又很难一次性区分和鉴定多种新冠病毒变异株。基于此，本发明希望针对Delta变异株和Omicron变异株上的多个检测基因和位于S基因上的突变位点进行引物和探针的设计，并将其进行组合使用，从而构建得到一种可用于检测多种新冠病毒变异株且检测效果良好的核酸检测试剂盒产品。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测新冠病毒变异株的引物对、探针及试剂盒。采用上述引物对和探针，可一次性实现对Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、Omicron BA.2.12.1、OmicronBA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5在内的多种新冠病毒变异株的分型，且检测特异性和检测灵敏度良好。
本发明提供了一种用于检测新冠病毒变异株的引物对，包括：
分别检测ORF1ab基因、N基因、P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-22所示。
本发明还提供了一种用于检测新冠病毒变异株的探针，包括：
分别检测ORF1ab基因、N基因、P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:23-33所示。
优选地，所述检测ORF1ab基因、N基因的探针为DDQ探针，所述检测P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的探针为DQ探针。
DQ探针用于检测单碱基突变，能够提高探针的TM值；而DDQ是一种双淬灭探针，可以降低探针的背景。采用上述探针能够改善常规taqman探针特异性不足的问题，从而有效提高检测的准确性。
本发明还提供了一种用于检测新冠病毒变异株的试剂盒，包括：预混试剂、上述引物对和上述探针；所述预混试剂包括dNTP、Taq酶、MMLV反转录酶、冻干保护剂、RT-PCR缓冲液和水。
优选地，所述冻干保护剂包含甘氨酸和海藻糖。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因RNP的引物对和探针；所述检测内参基因RNP的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:34-35所示，所述检测内参基因RNP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。
本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将检测ORF1ab基因、N基因和内参基因RNP的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分1；
将检测P681R位点、L452R、T842I位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分2；
将检测P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分3；
将检测6970del位点、T547K位点、R346K位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分4；制得所述试剂盒。
为了确保检测的准确性，在同一冻干组分中，各探针所用的荧光基团均不相同。相比于常规的核酸检测试剂，本发明将引物、探针和预混试剂组合后制成冻干组分，有效提高了试剂的稳定性和可靠性，而且还有效降低了运输成本。本发明所采用的各检测引物和探针互相不会发生交叉反应，也不会形成二级结构，保证了检测效率和检测结果的准确性。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测新冠病毒变异株的方法，包括以下步骤：
(1)对待测样品进行核酸提取，得到核酸提取液；
(2)以所述核酸提取液为模板，采用上述引物对和上述探针进行扩增和检测。
优选地，所述扩增的条件为：
50℃15min，1个循环；
95℃5min，1个循环；
95℃10s、60℃30s，40个循环。
可采用全自动荧光PCR仪进行相应检测，全自动荧光PCR仪的类型包括但不限于ABI
Figure SMS_1
7500、ABI Q系列、BIO-RAD CFX系列、宏石SLAN系列。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
采用本发明所提出的引物和探针进行样品的检测，可一次性区分多种新型冠状病毒变异株(Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、Omicron BA.2.12.1、Omicron BA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5)。前期研究表明，常规PCR引物及探针难以满足多重PCR的要求，本发明通过对引物对及探针的巧妙设计最终得到特定的引物对及探针，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰，在实现多种新型冠状病毒变异株的鉴定效果的同时，还保持了良好的检测特异性和灵敏度。此外，本发明将引物、探针和预混试剂组合后制成冻干组分，有效提高了试剂的稳定性和可靠性，而且还有效降低了运输成本。
附图说明
图1为Omicron BA.1样品的检测结果；
图2为Omicron BA.1.1样品的检测结果；
图3为Omicron BA.2样品的检测结果；
图4为Omicron BA.2.12.1样品的检测结果；
图5为Omicron BA.3样品的检测结果；
图6为Omicron BA.4样品的检测结果；
图7为Omicron BA.5样品的检测结果；
图8为Delta样品的检测结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种用于检测新冠病毒变异株的试剂盒，该试剂盒的制备方法为：
根据表1中的组成将预混试剂、引物和探针分装至4个8联管中，再放入冻干机中冻干，得到冻干组分1-4。
其中，2×冻干保护剂：10％甘氨酸，10％海藻糖、其余为水；各引物对和探针的核苷酸序列信息见表2所示。
表1
Figure SMS_2
Figure SMS_3
表2
Figure SMS_4
Figure SMS_5
其中，各探针中的DQ、DDQ均可从珠海辉睿生物科技有限公司购买得到。
实施例2
本实施例提供一种非诊断目的的检测新冠病毒变异株的方法，包括以下步骤：
(1)对待测样品进行核酸提取，得到核酸提取液；
(2)分别往冻干组分1-4中加入20μL核酸提取液，根据表3中的扩增条件进行扩增，采用全自动荧光PCR仪进行检测。
表3
Figure SMS_6
Figure SMS_7
若待测样品含有以下Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、OmicronBA.2.12.1、Omicron BA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5等种类的新冠病毒变异株时，各基因或位点的检测结果应与表4中阴性(-)和阳性(+)结果对应。
表4
Figure SMS_8
实施例3
本发明将实施例1中试剂盒提供给广州市第八人民医院，珠海市疾病预防控制中心，三亚市疾病预防控制中心，并根据实施例2中的检测方法进行检测特异性和灵敏性的验证。
1.特异性检测
各分别选取10-20株甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒、冠状病毒(HKU1、OC43、NL63、229E)、Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、Omicron BA.2.12.1、Omicron BA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5作为待测样品。
检测结果为：甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒、冠状病毒(HKU1、OC43、NL63、229E)等呼吸道病毒除内参基因RNP的检测结果为阳性外，其余基因或位点均未得到扩增和检测。
Omicron BA.1样品的检测结果如图1和表5所示；Omicron BA.1.1样品的检测结果如图2和表6所示；Omicron BA.2样品的检测结果如图3和表7所示；Omicron BA.2.12.1样品的检测结果如图4和表8所示；Omicron BA.3样品的检测结果如图5和表9所示；OmicronBA.4样品的检测结果如图6和表10所示；Omicron BA.5样品的检测结果如图7和表11所示；Delta样品的检测结果如图8和表12所示。
表5
Figure SMS_9
表6
Figure SMS_10
表7
Figure SMS_11
表8
Figure SMS_12
表9
Figure SMS_13
Figure SMS_14
表10
Figure SMS_15
表11
Figure SMS_16
表12
Figure SMS_17
以上结果显示，采用本发明的引物和探针进行检测，不会出现假阳性和假阴性的情况，且能实现对Delta、Omicron BA.1、Omicron BA.1.1、Omicron BA.2、OmicronBA.2.12.1、OmicronBA.3、Omicron BA.4、Omicron BA.5等多种新冠病毒变异株的分型，体现出良好的检测特异性。
2.灵敏性检测
制备分别含有P681R、L452R、T842I、P681H、L452Q、KSF141-143、6970del、T547K和R346K突变位点的重组质粒，并将其浓度设置为1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL等3个浓度梯度，进行灵敏度检测。检测结果为：各突变位点的检测下限均为500copies/mL，体现出较好的检测灵敏性。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.一种用于检测新冠病毒变异株的引物对，其特征在于，包括：
分别检测ORF1ab基因、N基因、P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-22所示。
2.一种用于检测新冠病毒变异株的探针，其特征在于，包括：
分别检测ORF1ab基因、N基因、P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:23-33所示。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述检测ORF1ab基因、N基因的探针为DDQ探针，所述检测P681R位点、L452R位点、T842I位点、P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点、6970del位点、T547K位点和R346K位点的探针为DQ探针。
4.一种用于检测新冠病毒变异株的试剂盒，其特征在于，包括：预混试剂、权利要求1所述的引物对和权利要求2-3中任一项所述的探针；所述预混试剂包括dNTP、Taq酶、MMLV反转录酶、冻干保护剂、RT-PCR缓冲液和水。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包含甘氨酸和海藻糖。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因RNP的引物对和探针；所述检测内参基因RNP的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:34-35所示，所述检测内参基因RNP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。
7.权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将检测ORF1ab基因、N基因和内参基因RNP的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分1；
将检测P681R位点、L452R、T842I位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分2；
将检测P681H位点、L452Q位点、KSF141-143位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分3；
将检测6970del位点、T547K位点、R346K位点的引物对、探针与预混试剂混合，经冻干，得到冻干组分4；制得所述试剂盒。
8.一种非诊断目的的检测新冠病毒变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对待测样品进行核酸提取，得到核酸提取液；
(2)以所述核酸提取液为模板，采用权利要求1所述的引物对和权利要求2-3中任一项所述的探针进行扩增和检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的条件为：
50℃15min，1个循环；
95℃5min，1个循环；
95℃10s、60℃30s，40个循环。
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