CN111254224A

CN111254224A - 一种定量检测人类嗜t淋巴细胞病毒前病毒的方法

Info

Publication number: CN111254224A
Application number: CN202010205314.0A
Authority: CN
Inventors: 王露楠; 姬慧敏; 常乐; 闫颖; 姜心怡; 孙慧珍; 郭飞
Original assignee: Beijing Hospital
Current assignee: Beijing Hospital
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-06-09

Abstract

本发明公开了一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，属于医学检验技术领域。一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的质粒，所述质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株的保藏编号为CGMCC No.19437。本发明的优点如下：本发明建立了一种可靠的HTLV‑1荧光定量qPCR方法，该方法操作简单，成本较低，特异性好，重复性高，精密度、正确度和线性范围均可满足临床检测需求，灵敏度高，对HTLV‑1的最低检出线为3copies/μL，可相对定量HTLV‑1感染者的前病毒载量，为感染者的预后提供可靠实验数据。

Description

一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，具体涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR技术检测HTLV-1前病毒的质粒和检测方法，属于医学检验技术领域。

背景技术

HTLV的检测可分为筛查试验和确认试验两大类。酶联免疫吸附试验(ELISA)和明胶颗粒凝集试验(PA)是目前应用最为广泛的两项筛查方法。PA通常以培养的人T细胞系中的病毒裂解物作为抗原，而ELISA以重组或合成的多肽作为抗原，对血清中的抗体进行检测。这两种方法的灵敏度高、费检测成本低，适合大规模的献血者筛查。但由于特异度不足，因此，对于初筛反应阳性的样本，均需要用确认试验进行确证。

确认试验主要包括蛋白印迹试验(WB)、间接免疫荧光试验(IFA)、放射免疫沉淀试验(RIPA)和PCR法等，尤以WB最为常用。但该方法存在操作复杂、检测耗时长、灵敏度不高等缺点，在实际中很难大规模应用，而且检测存在大量不确定结果，很难判断献血者的真实感染状态，在实际中很难大规模应用；而常规PCR技术只能终点定量，无法对病原菌初始浓度进行准确定量。因此，为了更早期、直接地检测HTLV病毒感染，保证血液安全，迫切需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的检测HTLV的实时荧光定量 PCR方法。

人类嗜T淋巴细胞病毒(human T-cell lymphotropic virus，HTLV)是首个被发现与癌症相关的RNA逆转录病毒。到目前为止，共分离出四种HTLV亚型：HTLV-1-4。全世界大约有500-1000万人感染HTLV-1。感染HTLV-1的人群可发展成为成年人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)、相关性脊髓病和/或热带痉挛性瘫痪 (HTLV-1associated myelopathy/tropical spastic paraparesis，HAM/TSP)等相关疾病。中国属于HTLV低流行区，但在中国福建、广东等沿海地区发现有局部集中的 HTLV-1小流行。蛋白免疫印迹是目前应用最为广泛的一种确认方法，但往往出现大量不确定和不能分型的结果，该方法更不能对检测样本进行定量。而HTLV-1前病毒载量(PVL) 已被证实是相关疾病发生或进展的重要风险因子，因此急需建立一种可以定量检测 HTLV-1前病毒载量的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了解决现有检测HTLV-1方法中不能准确定量病毒拷贝数，且费时、费力的问题，本方案提供了一种可定量检测整合入人类基因组中的HTLV-1前病毒DNA的实时荧光定量PCR方法，以及该方法使用到的质粒标准品和试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明针对内参基因RPPH1和目的基因HTLV Pol这两个区域设计特定的引物和探针，并将将这两个基因片段构建于同一质粒，制作质粒标准品。以梯度稀释的质粒标准品为模板，进行实时荧光定量qPCR构建标准曲线，同时提取待检血样本中的基因组DNA，并以之为模板进行qPCR，通过标准曲线从而对样本中的病毒拷贝数进行相对定量。

本发明的第一方面，提供一种检测HTLV-1的质粒标准品。

一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的质粒，所述质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏名称为大肠埃希氏菌Escherichia coli；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2020年2月26日；保藏编号为CGMCC No.19437。

该质粒的构建方法如下：分别应用HTLV Pol上下游引物(5’cagtagactagtccaaaccctgcccctccta和5’tggcgagaaacttacccatggtgttggtg)和内参基因RPPH1上下游引物(5’tatgcacaattatgtaatccccaaa和5’ aatgggcggaggagagtagtct)，通过PCR方法克隆Hut102细胞基因组中的HTLV Pol基因和RPPH1基因序列，酶切后连接到载体pcDNA3.1(-)上，得到pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1 质粒。

该质粒用于制作标准曲线。

本发明的第二方面，提供一组检测HTLV-1的核酸序列。

一组检测HTLV-1的核酸序列，具有序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，如表1所示。

表1 HTLV-1和RPPH1的探针和引物序列

HTLV Pol基因在HTLV病毒株序列中高度保守，因此本发明选择该基因进行检测。内参基因RPPH1在正常细胞中的拷贝数为2copies/cell，因此，本发明以该基因的拷贝数为对照，检测待测基因相对于内参基因的拷贝数，从而对病毒的拷贝数进行相对定量。

本发明的第三方面，提供一种检测HTLV-1的试剂。

一种检测HTLV-1的检测试剂，包含上述质粒标准品(pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1质粒)和检测HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列。

所述检测HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列为实时荧光定量qPCR体系所用探针和引物，具有序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，如表1所示。

引物和探针序列发送至通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，合成量：20D/每份。

所述检测试剂还含有样本DNA提取试剂，这部分为现有技术，既可以采用商业化的DNA提取试剂，也可以自制DNA提取试剂。

本发明所述的检测试剂为荧光定量qPCR检测试剂，采用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术具有很高的灵敏度和特异性，可实现目标核酸的定性和定量检测。本发明针对病毒不同基因区域设计不同的引物和探针，检测整合入人类基因组中的HTLV前病毒DNA，可更早期、直接地检测HTLV病毒感染。

本发明的第四方面，提供一种检测HTLV-1的方法。

一种检测HTLV-1的方法，使用质粒标准品(pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1质粒)和检测HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列，实时荧光定量qPCR检测HTLV-1拷贝数。

所述HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列为实时荧光定量qPCR体系所用探针和引物，序列见表1所示。

所述的方法包括以下步骤：

S1，提取待测样本的基因组DNA；

采用北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(试剂盒型号：DP341)提取，按照说明书提取待检样本中的基因组DNA。

S2，实时荧光定量qPCR反应；

采用珠海宝瑞生物生产的TaqMan基因表达预混液(Hyperstart Pre-mix)，包含有除了引物、Taqman探针、模板和水以外的所有反应所需的成分。将预混液、HTLV-1和内参RPPH1的引物和探针按照下表浓度放在同一qPCR管体系中，对5×10⁸～1copies/μL 的质粒标准品以及待检样本的进行扩增(每个稀释度3个重复)。

表2实时荧光定量qPCR反应体系

在ABI7500实时定量荧光PCR仪(美国Applied Biosystems公司)进行检测，反应条件见表3

表3实时荧光定量qPCR扩增条件

S3，以(5×10⁸～1copies/μL)浓度的质粒标准品制作标准曲线(5×10⁸～1copies/μL)

以质粒标准品拷贝数的log10为横坐标，Ct值为纵坐标，构建标准曲线方程，得出HTLV-1基因和RPPH1内参基因qPCR的标准曲线分别为Y1＝-a1X1+b1；Y2＝-a2X2+b2；

S4，测定待测样品中HTLV-1的含量

将待检测样本的gDNA的HTLV-1基因和RPPH1内参基因扩增后得出的平均Ct 值带入标准曲线，得到X1和X2，计算待检样本的HTLV-1拷贝数N(copies/100cell) ＝2×10^(X1 ^-X2)×100，即每100个细胞中HTLV-1的前病毒拷贝数。

为验证本方法的检测性能，本研究经过了一系列的方法学评价，其结果如下：

1)本方法确定的HTLV-1的最低检出线为3copies/μL，内参基因RPPH1的最低检出线为2.5copies/μL；

2)本方法对HTLV-1最低检出Hut102细胞浓度为0.0218％，ddPCR绝对定量每个Hut102细胞1.146个拷贝，那么当10⁴个细胞中有2.5copies的时，该方法即可检出；

3)本方法对质粒HTLV-1的定量下限为3copies/μL。

4)本方法对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV) 和梅毒阳性的样本以及健康人血样本所提取的gDNA均无非特异性扩增，特异性良好。

5)本方法对3个已精确定量的细胞样本(0.00026copies/cell、0.00302copies/cell、1.146 copies/cell)的检测Bias值均小于25％，正确度良好。

6)本方法检测高中低浓度的HTLV-1的批内变异系数范围是0.36％～2.81％，批间变异系数范围是0.64％～3.19％；检测RPPH1的批内变异系数范围是0.36％～2.81％，批间变异系数范围是0.64％～3.19％，精密度良好。

7)该方法检测HTLV-1和的RPPH1线性范围分别为5×10⁸copies/μL～0.2copies/μL和

5×10⁸copies/μL～0.5copies/μL

本发明的优点是：特异性好，重复性高，精密度、正确度和线性范围均可满足临床检测需求，灵敏度高，对HTLV-1的最低检出线为3copies/μL，可相对定量HTLV-1感染者的前病毒载量，为感染者的预后提供可靠实验数据。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施例2质粒标准品HTLV-1的扩增曲线图

图2示出实施例2质粒标准品HTLV-1的线性图

图3示出实施例2质粒标准品RPPH1的扩增曲线图

图4示出实施例2质粒标准品RPPH1的线性图

图5A和图5B示出实施例3的3例临床样本的扩增曲线图，图5A为临床样本HTLV- 1扩增曲线图；图5B为临床样本RPPH1扩增曲线图

具体实施方式

实施例1：建立质粒标准品

一、材料

1.限制性内切酶及buffer：美国NEB公司

2.Hut102细胞：北京协和医学院购买

3.NanoDrop 2000微量紫外分光光度计：美国Thermo公司

4.质粒提取试剂盒：美国Axygen公司

5.T4连接酶及buffer：美国NEB公司

6.普通DNA凝胶回收试剂盒：天根生化(北京)科技有限公司

7.pcDNA3.1(-)质粒：Invitrogen公司购买

8.大肠杆菌DH5α感受态细胞：北京擎科生物科技有限公司

9.PCR扩增buffer(金牌mix)：北京擎科生物科技有限公司

二、方法

1.扩增HTLV Pol基因序列

分别应用HTLV Pol上下游引物(5’cagtagactagtccaaaccctgcccctccta(SEQ IDNO.7)和5’tggcgagaaacttacccatggtgttggtg(SEQ ID NO.8))

扩增体系如下表4

表4 PCR扩增Pol片段反应体系

扩增体系如下表5

表5 PCR扩增Pol片段反应条件

PCR反应结束后，使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析和鉴定。并采用天根生化(北京)科技有限公司生产的普通DNA凝胶回收试剂盒进行DNA的回收。

2.扩增内参基因RPPH1基因序列

RPPH1基因上下游引物(5’tatgcacaattatgtaatccccaaa(SEQ ID NO.9)和5’aatgggcggaggagagtagtct(SEQ ID NO.10))，通过PCR方法克隆Hut102细胞基因组中的RPPH1基因序列。

扩增体系如下表6

表6 PCR扩增RPPH1片段反应体系

扩增体系如下表7

表7 PCR扩增RPPH1片段反应条件

3.酶切载体pcDNA3.1(-)

(1)将pcDNA3.1(-)质粒和回收的RPPH1片段同时用BamHI进行酶切，酶切体系如下表8：

表8 BamHI酶切RPPH1片段和pcDNA3.1(-)质粒反应体系

(2)将配好的酶切溶液放置于PCR仪上，37℃酶切4h。

(3)琼脂糖凝胶电泳：酶切反应结束后，使用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分析和鉴定。

(4)电泳完毕后，在紫外灯下用小刀将酶切完全的pcDNA3.1(-)质粒载体以及单一的RPPH1片段从凝胶中切下(尽量切除多余部分)，并放入标记好的1.5mL离心管中，称重。

(5)用天根回收试剂盒回收酶切好的载体以及片段。

4.RPPH1片段与载体pcDNA3.1(-)连接

(1)将RPPH1片段与载体pcDNA3.1(-)连接，按照下表9配好连接反应体系，22℃连接1h。

表9 RPPH1片段和pcDNA3.1(-)载体连接反应体系

(2)连接产物转化感受态细胞DH5α感受态细胞。

(3)挑取单克隆菌落：挑取平板中的白色单菌落，接种到5mL含氨苄抗性的LB 液体培养基中，37℃ 220rpm剧烈振摇，培养过夜。

(4)菌种保存：取50微升新鲜菌液加入1.5毫升离心管中，然后加入50微升30％甘油，混匀，标记后置于-80℃冰箱中长期保存。

(5)质粒提取：采用Axygen公司生产的质粒小提中量试剂盒进行质粒的提取。

(6)测序鉴定：重组质粒的菌液送北京擎科生物科技有限公司测序验证插入序列的正确性。

5.酶切pcDNA3.1(-)-RPPH1质粒

(1)将测序正确的pcDNA3.1(-)-RPPH1质粒用NheI和SpeI进行酶切，同时，回收的Pol片段用SpeI进行酶切，酶切体系如下：

表10 Pol片段以及pcDNA3.1(-)-RPPH1载体酶切反应体系

(2)将配好的酶切溶液放置于PCR仪上，37℃酶切4h。

(3)由于SpeI和NheI酶切位点在载体上几乎相连，因此，为减少回收损失，pcDNA3.1(-)-RPPHI，Pol的酶切产物未经电泳直接用回收试剂盒进行回收。

6.Pol片段与载体pcDNA3.1(-)-RPPH1连接

(1)将pol片段与载体pcDNA3.1(-)-RPPH1连接按照下表11配好连接反应体系

表11 Pol片段与pcDNA3.1(-)-RPPH1载体连接反应体系

(2)连接产物转化感受态细胞DH5α感受态细胞。

7.定量

将质粒pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1经过NanoDrop 2000微量紫外分光光度计准确定量，按照下列公式换算为copies/μL：

DNA质粒浓度(copies/μL)＝(6.02×10⁽²³⁾)x(ng/μL×10^(-9))/(DNA碱基数x 660)

8.稀释

将构建好的pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1质粒倍比稀释为5×10⁸-1copies/μL，作为质粒定量标准品。

三、结果

针对内参基因RPPH1和目的基因HTLV Pol这两个区域设计特定的引物和探针，并将将这两个基因片段构建于同一质粒，制作质粒标准品。

本发明中，以梯度稀释的该质粒标准品为模板，进行实时荧光定量qPCR构建标准曲线，同时提取待检血样本中的基因组DNA，并以之为模板进行qPCR，通过标准曲线从而对样本中的病毒拷贝数进行相对定量。

将本发明得到的质粒(pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1)以大肠杆菌(DH5α感受态细胞)为载体，转化了该质粒(pcDNA3.1(-)-pol-RPPH1)的克隆菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏名称为大肠埃希氏菌Escherichia coli；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2020年2月26日；保藏编号为CGMCCNo.19437。

实施例2：定量检测HTLV-1阳性细胞Hut102细胞拷贝数

一、材料

1.磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(型号：DP341)：天根生化科技(北京)有限公司

2.Hut102细胞：北京协和医学院购买

3.ABI7500实时定量荧光PCR仪：美国Applied Biosystems公司

4.qPCR 5×Hyperstart Pre-mix：珠海宝瑞生物公司

二、方法

1.提取基因组DNA

采用北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(型号：DP341)提取，按照说明书提Hut102细胞(北京协和医学院购买)的gDNA。

2.建立标准曲线

选用5×10⁸copies/μL～5×10¹copies/μL梯度的质粒标准品建立标准曲线：每个浓度的质粒标准品均设置3个平行反应，

3.样本检测

对已经ddPCR精确定量Hut102细胞样本(1.146copies/cell)进行检测(6个重复)。引物和探针浓度等同表2，反应条件同表3。

三、结果

1.HTLV-1和RPPH1的扩增曲线及标准曲线如图1至图4所示。

2.得到HTLV-1的标准曲线的回归方程为：y＝-3.241x+37.096，R2＝0.999，序列扩增效率为103.483％，RPPH1的标准曲线的回归方程为：y＝-3.294x+37.432，R2＝0.999，序列扩增效率为101.157％，均在正常范围内。

3.测得Hut102细胞样本平均定量值为1.225copies/cell(表12)，偏倚值为6.59％，小于10％，在可接受范围之内。说明本方法可准确定量前病毒拷贝数。

表12荧光定量PCR检测绝对定量样品中HTLV-1拷贝数

注：偏倚＝(平均值-实际定量值)/实际定量值×100％。

实施例3：定量检测3例经INNO-LIA和WB确证为HTLV-1阳性的前病毒载量

一、材料

1.磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(型号：DP341)：天根生化科技(北京)有

限公司

2.Hut102细胞：北京协和医学院购买

3.ABI7500实时定量荧光PCR仪：美国Applied Biosystems公司

4.qPCR 5×Hyperstart Pre-mix：珠海宝瑞生物公司

二、方法

1.提取样本基因组DNA

采用北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒提取，按照说明书提取待检样本中的gDNA。

2.制作标准曲线

选用5×10⁶copies/μL～5×10²copies/μL梯度的质粒标准品建立标准曲线：每个浓度的质粒标准品均设置3个平行反应。

3.样本测定

对3例经INNO-LIA和WB确证为HTLV-1同时进行检测(每个样本3个重复)。引物和探针浓度等同表2，反应条件同表3。

三、结果

1.得到HTLV-1的标准曲线的回归方程为：y＝-3.321x+37.28，R2＝0.996，序列扩增效率为100.026％，RPPH1的标准曲线的回归方程为：y＝-3.374x+38.058，R2＝0.997，序列扩增效率为97.88％，均在正常范围内。

2.测得三个样本的平均前病毒拷贝数(PVL)分别为0.34，1.34，3.00copies/100cell (图5A和图5B，表13)。说明本方法可对INNO-LIA和WB确证为HTLV-1阳性的样本定量前病毒拷贝数。

表13荧光定量PCR检测阳性样本中HTLV-1拷贝数

实施例4：方法学验证实验

一、材料

2.Hut102细胞：北京协和医学院购买

3.Jurkat细胞：北京协和医学院购买

4.ABI7500实时定量荧光PCR仪：美国Applied Biosystems公司

5.qPCR 5×Hyperstart Pre-mix：珠海宝瑞生物公司

6.数字PCR仪：美国BIO-RAD，型号：T100

二、方法

1.检测下限(LoD)的建立

(1)细胞标准品LoD确定具体步骤如下：

1)采用血细胞计数法分别计数培养的Jurkat细胞和Hut102细胞，将Hut102细胞稀释到Jurkat细胞中，两种细胞按照最终理论稀释比例为：20％，4％， 0.8％，0.16％，0.032％，0.016％，0.0064％，0.0032％进行稀释。

2)将稀释好的细胞以每管100μL分装至PCR管中，终浓度为10⁶cells/100μL。 -80℃冻存。

3)将不同比例的细胞用数字PCR法进行绝对定量，计算出每种比例细胞的实际比例。

4)将每个稀释度的细胞进行连续进行5天检测，每天重复检测4次。共计20 次双重qPCR的检测，将检测结果用SPSS软件进行Probit概率分析，确定 LoD。

(2)质粒标准品LoD确定具体步骤如下：将50copies/μL，25copies/μL，5copies/μL， 2.5copies/μL，1copies/μL，0.5copies/μL，0.2copies/μL的质粒，每个浓度每天重复检测4次，共检测5天。共计20次双重qPCR的检测，将检测结果用SPSS软件进行Probit概率分析，确定LoD。

2.定量线(LoQ)的确定

根据质粒的LoD，本实验准备5个不同浓度的质粒标准品：50copies/μL，25copies/μL，5copies/μL，3copies/μL，2.5copies/μL，每个浓度测3次，连续测3天，计算每个浓度重复样本的平均值和标准差，根据变异系数(Coefficient of Variation， CV)＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％计算出每个浓度样本的CV，CV＜5％时的最低样本浓度作为本方法的的LoQ。

3.特异性

(1)其他病毒阳性样本的干扰

干扰样本包括3例乙型肝炎病毒阳性样本，3例丙型肝炎病毒阳性样本，3例人类免疫缺陷病毒阳性样本，3例梅毒阳性样本。分别取上述血浆样本100μL，加入 100μL健康人外周血样本中混匀，按照北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA 提取试剂盒提取，按照说明书提取待检样本中的gDNA。

(2)人类基因组DNA的干扰

选择10例健康人基因组样本。按照北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA 提取试剂盒提取，按照说明书提取待检样本中的gDNA。

(3)以上述样本提取的gDNA为模板，Hut102 gDNA为阳性对照，按照S2和S3方法步骤进行HTLV-1定量检测。

4.正确度

利用本发明建立的检测方法，建立标准曲线，对3个以经ddPCR精确定量的细胞样本(0.00026copies/cell、0.00302copies/cell、1.146copies/cell)进行检测，每个浓度检测6次，计算每个浓度样本检测结果的平均值，并根据参考值(X)计算每个浓度样本的偏倚：Bais＝(平均值-X)/X×100％，验证该检测方法的正确度。Bais＜25％则在可接受范围之内，表明正确度良好。

5.精密度(批间，批内)

(1)选取高中低三个浓度的质粒标准品样本：5×10⁷copies/μL，5×10³copies/μL，靠近决定点(LOQ)copies/μL水平，用本方法进行精密度检测。

(2)批内精密度：在一次实验中对高中低三个浓度的质粒标准品样本进行6次重复检测，计算每个浓度样本的批内标准差，并计算CV。

(3)批间精密度：对高中低三个浓度的质粒标准品样本每天进行6次重复检测，检测3天，计算每个浓度样本的批间标准差，并计算CV。

6.线性范围

使用稀释好的5×10⁹copies/μL，5×10⁸copies/μL，5×10⁷copies/μL，5×10⁶copies/μL， 5×10⁵copies/μL，5×10⁴copies/μL，5×10³copies/μL，5×10²copies/μL，5×10¹copies/μL，5copies/μL，3copies/μL，0.5copies/μL，0.2copies/μL，0.04copies/μL质粒标准品进行验证，每个浓度重复测三次。将Ct值做回归线性分析，R2＞0.98，扩增效率介于95％～ 105％之间的标准品浓度范围为合适的线性范围。

三、结果

1.本方法确定的HTLV-1的最低检出线为3copies/μL，内参基因RPPH1的最低检出线为2.5copies/μL；

2.本方法对HTLV-1最低检出Hut102细胞浓度为0.0218％，ddPCR绝对定量每Hut102细胞1.146个拷贝，那么当10⁴个细胞中有2.5copies的时，该方法即可检出；

3.本方法对质粒HTLV-1的定量下限为3copies/μL。

4.本方法对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV) 和梅毒阳性的样本以及健康人血样本所提取的gDNA均无非特异性扩增，特异性良好。

5.本方法对3个已精确定量的细胞样本(0.00026copies/cell、0.00302copies/cell、 1.146copies/cell)的检测Bias值均小于25％，正确度良好。

6.本方法检测高中低浓度的HTLV-1的批内变异系数范围是0.36％～2.81％，批间变异系数范围是0.64％～3.19％；检测RPPH1的批内变异系数范围是0.36％～2.81％，批间变异系数范围是0.64％～3.19％，精密度良好。

7.该方法检测HTLV-1和的RPPH1线性范围分别为5×10⁸copies/μL～0.2copies/μL 和5×10⁸copies/μL～0.5copies/μL，说明线性范围广，可满足临床检测需求。

实施例5：一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的试剂

一、试剂组成

1.质粒模板：5×10⁸～1copies/μL浓度的质粒标准品各1mL。各标准品浓度分别是：5×10⁸～1copies/μL，5×10⁷～1copies/μL，5×10⁶copies/μL，5×10⁵copies/μL， 5×10⁴copies/μL，5×10³copies/μL，5×10²copies/μL，5×10¹copies/μL，5copies/μL，1copies/μL。

2.HTLV-1基因正向引物，规格为1mL，浓度为8μM。

3.HTLV-1基因反向引物，规格为1mL，浓度为8μM。

4.HTLV-1探针，规格为1mL.浓度为1μM。

5.RPPH1基因正向引物，规格为1mL，浓度为8μM。

6.RPPH1基因反向引物，规格为1mL，浓度为8μM。

7.RPPH1基因探针，规格为1mL，浓度为3μM。

8.5×Hyperstart Pre-mix UNG(珠海宝锐生物有限公司)，规格为1mL，内含新型热启动酶Hyperstart Taq，UNG酶，PCR buffer，Mg²⁺，dNTP，稳定剂等组分。

引物和探针序列同表1所示，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成。-20℃保存。

本试剂的各种成分分别独立分装、包装，各种试剂整体组合形成一个检测试剂盒。

二、使用方法

同实施例2。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

序列表

<110> 北京医院

<120> 一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法

<130> XDRC19I020

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagcccact tgcaaactat agacct 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtagttaca ctgctgtggg acag 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agacgccttt ttccaaatcc ccttacc 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgccgtcc cgcgatattg a 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttgatgacg tcagcgttcg aattc 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctccgaacct ctcgccctgc c 21

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtagacta gtccaaaccc tgcccctcct a 31

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggcgagaaa cttacccatg gtgttggtg 29

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tatgcacaat tatgtaatcc ccaaa 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatgggcgga ggagagtagt ct 22

Claims

1.一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的质粒，其特征在于：所述质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株的保藏编号为CGMCC No.19437。

2.定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的一组核苷酸序列，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

3.一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的试剂，其特征在于：含有质粒标准品、检测HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列；其中质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株的保藏编号为CGMCC No.19437。

4.根据权利要求3所述的一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的试剂，其特征在于：所述检测HTLV-1和RPPH1的探针序列及引物序列为实时荧光定量qPCR体系所用探针和引物。

5.根据权利要求3或4所述的一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的试剂，其特征在于：检测HTLV-1和RPPH1的引物序列及探针序列具有序列表SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。

6.一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，其特征在于：使用质粒模板、引物和探针序列，进行实时荧光定量qPCR反应，得到样本中的人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的含量。

7.根据权利要求6所述的一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，其特征在于：所述质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株的保藏编号为CGMCC NO.19437。

8.根据权利要求6所述的一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，其特征在于：所述引物和探针具有序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求6至8中任何一项所述的一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取待测样本的基因组DNA；

S2，实时荧光定量qPCR反应：将预混液、HTLV-1和内参RPPH1的引物和探针按照下表浓度放在同一qPCR管体系中，对5×10⁸～1copies/μL的质粒标准品以及待检样本的进行扩增；

S3，制作标准曲线(以5×10⁸～1copies/μL的质粒标准品制作标准曲线)：以质粒标准品拷贝数的log10为横坐标，Ct值为纵坐标，构建标准曲线方程，得出HTLV-1基因和RPPH1内参基因qPCR的标准曲线；

S4，测定待测样品中HTLV-1的含量：将待检测样本的gDNA的HTLV-1基因和RPPH1内参基因扩增后得出的平均Ct值带入标准曲线，得到X1和X2，计算待检样本的HTLV-1拷贝数N(copies/100cell)＝2×10^(X1-X2)×100。