CN109371169B - 一种用于辅助诊断早期hiv感染的试剂盒及其专用成套引物对 - Google Patents

一种用于辅助诊断早期hiv感染的试剂盒及其专用成套引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断早期HIV感染的试剂盒及其专用成套引物对。本发明基于已成熟的分子生物学检测手段PCR技术，利用筛选所获得的303条序列的保守区域，获得可覆盖多种亚型毒株的HIV核酸检测成套引物对。并通过利用我国主要HIV流行毒株的血浆标本及其他病毒(HBV、HCV)的标本，对成套引物对进行了特异性鉴定，证明本发明的成套引物对能有效检出我国主要的HIV‑1流行毒株，适用于多种亚型毒株核酸检测，且与HBV、HCV无交叉反应，可用于HIV‑1核酸诊断试剂的设计和开发。本发明对于HIV‑1的检测鉴定以及HIV感染者的辅助诊断具有潜在的应用前景，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。

Description

一种用于辅助诊断早期HIV感染的试剂盒及其专用成套引 物对
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于辅助诊断早期HIV感染的试剂盒及其专用成套引物对，特别涉及用于辅助诊断早期HIV感染的HIV核酸检测成套引物对及检测反应体系。
背景技术
自从1981年发现艾滋病以来，引发该疾病的元凶HIV(Human immunodeficiencyvirus，HIV)已在全球迅速蔓延，已导致3,700万人感染，引发了严重的公共卫生问题。中国目前报告存活的HIV/AIDS将近76万人，全人群感染率为0.055％，在当前严峻的形势下如何有效减缓艾滋病的快速蔓延是一件紧迫的事。早期HIV感染(Early HIV Infection，EHI)指HIV感染到病毒载量“定点”建立前的时期，大量研究证实，这个时期血液和精液中病毒的浓度高，作为传染源的传播效率最高，56-92％的HIV新发感染是由急性期的感染者传播的。急性期的抗病毒治疗对于延缓病程进展，改善预后也具有重要的作用。因此，HIV感染的早期诊断具有重要的临床和流行病学意义，是有效减少新发感染和提高抗病毒治疗效果的前提和保证。
HIV感染后，血液中出现的病毒标志物依次是HIV-1RNA、HIV-1p24抗原和HIV-1抗体，标准的诊断方法是血清学抗体检测。HIV抗体检测包括筛查试验(初筛和复检)和确认试验两个部分，该检测特异性强、准确度高，不足之处为人体感染HIV后抗体的出现比较滞后，一般需要2-12周，平均45天左右血液中才可检测到HIV抗体。从感染HIV到机体产生抗体的这一段时间称之为窗口期。在窗口期虽检测不到HIV抗体，但体内已有HIV，同样具有传染性，传播的危险很大，特别是对血液安全构成很大威胁。因此，有效检出窗口期的HIV感染是切断传播途径、控制HIV新发感染的迫切需要。目前，常用ELISA方法检测p24抗原，感染后2～3周便可从感染者的血清中检出。对于血清抗体阴性的样品，可通过检测p24抗原来识别是否为早期感染。然而，在血清抗体阳转前，p24抗原存在的时间非常短(1～2周)，抗体出现后，迅速形成抗原抗体复合物，p24抗原的水平随抗体浓度的增长而降低。因而检测p24抗原无法满足HIV感染早期诊断的需要。
为了有效检出“窗口期”HIV感染，人们利用感染早期血液中核酸应答早、病毒载量高、病毒RNA可在体内稳定存在的特点，建立核酸检测技术来实现HIV感染的早期诊断。由于核酸检测的高敏感性与特异性，已作为HIV感染早期诊断的重要手段。目前已有许多国家采用测定病毒RNA的方法来缩短检测窗口期，我国亦根据《全国艾滋病检测技术规范》(2015年)版的规定：检测策略补充试验包括抗体确证以及核酸试验，将核酸检测提到了艾滋病检测诊断的关键地位。目前HIV核酸检测方法有Real-time RT-PCR、RT-PCR与核酸杂交、NASBA、bDNA检测技术等，仪器及使用试剂主要为国外厂家生产，价格相对较高。我国目前已有国产荧光定量RT-PCR试剂盒，但该检测依赖价格相对昂贵的荧光实时定量PCR仪，该仪器在艾滋病疫情高发的西南地区山区和多数基层单位配备不普及，且检测人员需要较高的专业知识和实验技能，因此该技术在我国的使用情况还不是很普遍。另外HIV具有高度的变异性，在我国已经发现了HIV-1的A、B、C、D、F等亚型毒株，以及CRF01_AE、CRF02_AG、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF55_01B等重组毒株，是HIV-1亚型最复杂的国家之一。荧光定量检测技术由于使用探针的特殊性，使得该方法在对多亚型毒株的检测方面还存在一定的局限性。
目前，PCR技术作为常规的分子生物学检测手段在我国大中小城市和基层单位已经广泛使用，检测成本相对低廉，因此如何将这一成熟技术成功应用于我国艾滋病感染者的早期诊断对艾滋病的防控具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于辅助诊断早期HIV感染的成套引物对。
本发明提供的用于辅助诊断早期HIV感染的成套引物对由特异性引物对甲和特异性引物对乙组成；
所述特异性引物对甲由P24_F1和P24_R1组成；
所述特异性引物对乙由P24_F2和P24_R2组成；
所述P24_F1为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述P24_R1为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述P24_F2为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述P24_R2为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
上述成套引物对中，所述特异性引物对甲中的所述P24_F1和所述P24_R1的摩尔浓度比为1:1；所述特异性引物对乙中的所述P24_F2和所述P24_R2的摩尔浓度比为1:1。
本发明的另一个目的是提供上述成套引物对的新用途。
本发明提供了上述成套引物对在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备诊断或辅助诊断早期HIV感染的产品；
c2)诊断或辅助诊断早期HIV感染；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒；
c5)制备检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒。
本发明又有一个目的是提供含有上述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：
d1)诊断或辅助诊断早期HIV感染；
d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒；
d3)检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒。
本发明的试剂盒还可包括如下试剂：2×1 Step Buffer、PrimeScript 1StepEnzyme Mix、2×PCR Mix和RNase Free dH2O。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒的制备方法为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)上述成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)上述成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的方法包括如下步骤：
e1)以待测病毒的RNA为模板，采用上述特异性引物对甲进行第1轮RT-PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
e2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用上述特异性引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒是否为HIV病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为480bp的条带，则所述待测病毒为或候选为HIV病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为480bp的条带，则所述待测病毒不为或候选不为HIV病毒。
本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒的方法包括如下步骤：
f1)以待测者的RNA为模板，采用上述特异性引物对甲进行第1轮RT-PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
f2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用上述特异性引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测者是否感染HIV病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为480bp的条带，则所述待测者感染或候选感染HIV病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为480bp的条带，则所述待测者未感染或候选未感染HIV病毒。
上述方法中，所述特异性引物对甲中的P24_F1和P24_R1在反应体系中的终浓度均为0.4μM。
所述特异性引物对乙中的P24_F2和所述P24_R2在反应体系中的终浓度均为0.4μM。
进一步的，所述第1轮RT-PCR扩增的反应体系如表2所示；反应条件如表3所示。
所述第2轮PCR扩增的反应体系如表6所示；反应条件如表7所示。
上述特异性引物对甲或上述特异性引物对乙或HIV病毒p24基因第1281-1760位所示的核酸分子均属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供上述特异性引物对甲或上述特异性引物对乙或HIV病毒p24基因第1281-1760位所示的核酸分子的新用途。
本发明提供了上述特异性引物对甲或上述特异性引物对乙或HIV病毒p24基因第1281-1760位所示的核酸分子在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备诊断或辅助诊断早期HIV感染的产品；
c2)诊断或辅助诊断早期HIV感染；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒；
c5)制备检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒的产品；
c6)检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒。
上述应用或方法中，所述HIV(人免疫缺陷病毒)为HIV-1型(1型人免疫缺陷病毒)。
本发明基于已成熟的分子生物学检测手段PCR技术，利用生物学分析软件筛选获得的303条HIV全长序列的保守区域，获得可覆盖多种亚型毒株的HIV核酸检测成套引物对。并通过利用我国主要HIV流行毒株的血浆标本及其他病毒(HBV、HCV)的标本，对成套引物对进行了特异性鉴定，证明本发明的成套引物对能有效检出我国主要的HIV-1流行毒株，适用于多种亚型毒株核酸检测，且与HBV、HCV无交叉反应，可用于HIV-1核酸诊断试剂的设计和开发。本发明对于HIV-1的检测鉴定以及HIV感染者的辅助诊断具有潜在的应用前景，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。
附图说明
图1为部分样本第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，数字标识1-22为临床样本；“+”为阳性对照，为临床分离病毒的培养上清(ZL2004 1 0048007 2)；“-”为阴性对照；DL-2000Marker片段自下向上依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，第二轮PCR检测目的基因片段大小为480bp，图中所示基因条带位于500～250bp之间，与预期目的基因片段大小一致。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的2×1 Step Buffer、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、2×PCRMix均为宝生物工程(大连)有限公司的产品。其中2×1Step Buffer、PrimeScript 1StepEnzyme Mix为PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit(RR055A)中的试剂，2×PCR Mix为Premix TaqTM(RR902A)。
实施例1、辅助诊断早期HIV感染的成套引物对
利用Vector NTI AdvanceTM10分析软件对来自HIV Database的170条HIV全长序列和本实验室前期工作积累获得的133条HIV gag全长基因序列的保守区域进行扫描，观察不同亚型gag区基因的变异程度。扫描结果显示获得gag区保守序列4条。以扫描获得的4条引物为蓝本，根据我国HIV-1主要流行毒株gag区差异情况，对扫描获得的引物进行序列优化，形成本发明的用于辅助诊断早期HIV感染的HIV核酸检测成套引物对。
本发明的HIV核酸检测成套引物对由特异性引物对甲和特异性引物对乙组成。其中，特异性引物对甲由P24_F1和P24_R1组成，可用于RT-PCR检测中cDNA的合成与目的基因的第一轮扩增检测；特异性引物对乙由P24_F2和P24_R2组成，用于目的基因的第二轮扩增，目的基因片段预期大小为480bp。大小为480bp的目的基因片段即为HIV病毒p24基因第1281-1760位所示的DNA片段。以CRF01_AE亚型序列为例，该目的基因片段的核苷酸序列如序列5所示。
表1、引物序列构成和位置*
引物名称 序列(5’→3’) 位置
P24_F1 TCACCTAGAACTTTAAATGCATGGG(序列1) 1231→1255
P24_R1 CACTCCCTGACATGCTGTCATCAT(序列2) 1825→1848
P24_F2 TAGCCCAGAAGTAATACCCATGTT(序列3) 1281→1304
P24_R2 TGGACTAGCAAGGTTTCTGTCATC(序列4) 1737→1760
*注：引物中个别碱基与目的基因中碱基不完全匹配属于正常现象，因为不同亚型间存在序列差异，核酸检测过程中引物往往可以通读过去。
实施例2、HIV核酸检测成套引物对的临床应用
一、实验样本
将临床确诊的260位HIV感染者(知情同意的志愿者)、病毒载量≥1000Copies/mL的血浆标本作为实验样本，同时以52例HCVRNA阳性者(其中1a亚型28例，1b亚型24例)和32例HBV核酸阳性的感染者样本为对照，进行成套引物对敏感性与特异性的验证。
二、成套引物对的应用
分别将步骤一的各个患者的血浆进行如下实验：
1、提取HIV、HCV感染者体内总病毒RNA和HBV DNA。
2、以步骤1获得的RNA或DNA为模板，使用上述特异性引物对甲进行RT-PCR(第一轮PCR扩增)，得到第一轮PCR扩增产物。HIV、HCV第一轮RT-PCR扩增的反应体系及反应条件见表2、表3；HBV反应体系及反应条件见表4、表5。P24_F1和P24_R1在反应体系中的终浓度均为0.4μM。
表2、HIV、HCV的RT-PCR反应体系
组分 体积(μl)
RNase Free dH<sub>2</sub>O 5.5
2×1 Step Buffer 12.5
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1
P24_F1(20μM) 0.5
P24_R1(20μM) 0.5
Template RNA 5
总体积 25
表3、HIV、HCV的RT-PCR反应条件
Figure BDA0001885073280000061
Figure BDA0001885073280000071
表4、HBV第一轮检测的反应体系
组分 体积(μl)
RNase Free dH<sub>2</sub>O 6.5
2×PCR Mix 12.5
P24_F1 0.5
P24_R1 0.5
HBV DNA 5
总体积 25
表5、HBV第一轮检测的反应条件
Figure BDA0001885073280000072
3、以第一轮PCR扩增产物为模板，使用特异性引物对乙进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。第二轮PCR扩增的反应体系及反应条件均见表6、表7。P24_F2和P24_R2在反应体系中的终浓度均为0.4μM。
表6、第二轮PCR扩增的反应体系
组分 体积(μl)
ddH<sub>2</sub>O 12.8
2×PCR Mix 15
P24_F2(20μM) 0.6
P24_R2(20μM) 0.6
cDNA 1
总体积 30
表7、第二轮PCR扩增的反应条件
Figure BDA0001885073280000073
4、将第二轮PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，HIV检测部分结果见图1。由图1可见，部分样本在相同位置显示一条特异性条带，将该部分样本作为阳性样本。各样本的检测结果见表8和表9。本发明的成套引物对及反应体系对HIV检测阳性率达到94.2％，与HBV检测无交叉反应，HCVRNA阳性检测1例为阳性，对该例样本进行复核，发现该样本HIV抗体检测呈现阳性，亦即该例患者为HIV/HCV共感染，排除该例特殊样本，本发明的成套引物对及反应体系对HCV不存在交叉反应。因此该反应体系对HIV具有较好的检测特异性。
表8、各样本的检测结果
Figure BDA0001885073280000081
Figure BDA0001885073280000091
Figure BDA0001885073280000101
Figure BDA0001885073280000111
Figure BDA0001885073280000121
Figure BDA0001885073280000131
注：+表示阳性结果，-表示阴性结果
表9、HIV、HCV、HBV检测特异性一览表
Figure BDA0001885073280000132
实施例3、HIV核酸检测成套引物对对HIV样本检测的敏感性与亚型特异性
一、检测敏感性分析
使用Roche Cobas病毒载量试剂(购自中原合聚经贸有限公司)对260例检测样本进行核酸定量检测(结果见表8)，然后对检测样本按照病毒载量进行分组，分析本发明的成套引物对及反应体系对不同病毒载量临床样本检测的差异性。
分析结果见表10。统计结果表明，本发明的成套引物对及反应体系对不同载量区间样本检测无显著性差异，检测阳性率保持在88％以上。
表10、不同病毒载量样本检测的阳性率分析结果
Figure BDA0001885073280000141
二、亚型检测特异性分析
将获得的245例HIV阳性结果进行序列测定，根据亚型进行分类，分析本发明的成套引物对及反应体系对不同HIV亚型的检测情况。
结果见表11。毒株的亚型以CRF07_BC、CRF01_AE为主，构成比分别为55.9％、33.1％，这与检测使用样本有关，因为样本主要来源于西南地区的吸毒人群和北京市性接触感染HIV的人群，而这也代表了我国艾滋病流行的真实情况，在西南艾滋病高流行地区感染以静脉药瘾为主，而在大中城市艾滋病的流行以性接触为主，流行亚型也以CRF07_BC和CRF01_AE为主。本发明的成套引物对及反应体系对CRF08_BC、B等流行毒株也可以很好地检测。
表11、不同HIV亚型检测情况
HIV亚型 检测亚型例数 构成比(％)
CRF07_BC 137 55.9
CRF08_BC 15 6.1
CRF01_AE 81 33.1
B 9 3.7
不确定 3 1.2
上述结果表明，本发明的成套引物对及反应体系可以很好地检测不同亚型、不同病毒载量的HIV-1，且操作方法简便易行，价格相对低廉(如核酸定量检测试剂费用成本价为约500元/人份，而本发明检测体系成本价格约为70元/人份)，而且检测使用仪器设备要求不高，检测结果具有很好的敏感性与特异性，因此本发明的成套引物对及反应体系对HIV-1早期感染可以起到辅助鉴定作用。
序列表
<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120>一种用于辅助诊断早期HIV感染的试剂盒及其专用成套引物对
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
tcacctagaa ctttaaatgc atggg 25
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
cactccctga catgctgtca tcat 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
tagcccagaa gtaataccca tgtt 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
tggactagca aggtttctgt catc 24
<210>5
<211>480
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
taacccagaa gtaataccca tgttctcagc attatcagag ggagccaccc cacaagattt 60
aaatatgatg ctaaacatag tggggggaca ccaggcagca atgcaaatgt taaaagaaac 120
catcaatgaa gaagctgcag actgggatag gacacaccca gtacaggcag ggcctattcc 180
accaggccag ataagggaac caaggggaag tgacatagca ggaactacta gtacccttca 240
agaacaaata gcatggatga caggcaatcc acctatccca gtaggagaca tctataaaag 300
gtggataatc ctggggttaa ataaaatagt aagaatgtat agccctgtta gcattttgga 360
cataagacaa gggccaaaag aacccttcag agactatgtg gataggttct ataaaactct 420
tagagcagaa caagctacgc aggaggtgaa aaactggatg actgaaacct tgctagtcca 480

Claims (6)

1.用于辅助诊断早期HIV感染的成套引物对，由特异性引物对甲和特异性引物对乙组成；
所述特异性引物对甲由P24_F1和P24_R1组成；
所述特异性引物对乙由P24_F2和P24_R2组成；
所述P24_F1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述P24_R1为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述P24_F2为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述P24_R2为序列表中序列4所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述的成套引物对在如下c1)-c4)中任一种中的应用：
c1)制备诊断或辅助诊断早期HIV感染的产品；
c2)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的产品；
c3)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒；
c4)制备检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒的产品；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
3.含有权利要求1所述的成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：
d1)诊断或辅助诊断早期HIV感染；
d2)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒；
d3)检测或辅助检测待测者是否感染HIV病毒。
4.权利要求3所述的试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)权利要求1所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)权利要求1所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为HIV病毒的方法，包括如下步骤：
e1)以待测病毒的RNA为模板，采用权利要求1中所述的特异性引物对甲进行第1轮RT-PCR扩增，得到第1轮PCR扩增产物；
e2)以所述第1轮PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的特异性引物对乙进行第2轮PCR扩增，得到第2轮PCR扩增产物；
根据所述第2轮PCR扩增产物判定待测病毒是否为HIV病毒：
若所述第2轮PCR扩增产物中含有大小为480bp的条带，则所述待测病毒为或候选为HIV病毒；
若所述第2轮PCR扩增产物中不含有大小为480bp的条带，则所述待测病毒不为或候选不为HIV病毒；
所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
6.根据权利要求2所述的应用或权利要求5所述的方法，其特征在于：所述HIV为HIV-1型。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006013144A2 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 Genomadrid S.A. Method of in-vitro detection and quantification of hiv dna by quantitative pcr
CN1969048A (zh) * 2004-04-16 2007-05-23 尤若芬斯维拉兰斯公司 研究hiv的遗传和功能变异性的方法以及用于该方法的试剂盒
CN102168152A (zh) * 2011-05-17 2011-08-31 首都医科大学附属北京佑安医院 单管多引物小型集合hiv核酸检测试剂盒
CN102250891A (zh) * 2011-07-26 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种辅助鉴定hiv的引物组合物及其应用
CN102250890A (zh) * 2011-07-26 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 辅助鉴定hiv的引物组合物及其应用
WO2012045820A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Roche Diagnostics Gmbh System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1969048A (zh) * 2004-04-16 2007-05-23 尤若芬斯维拉兰斯公司 研究hiv的遗传和功能变异性的方法以及用于该方法的试剂盒
WO2006013144A2 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 Genomadrid S.A. Method of in-vitro detection and quantification of hiv dna by quantitative pcr
WO2012045820A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Roche Diagnostics Gmbh System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions
CN102168152A (zh) * 2011-05-17 2011-08-31 首都医科大学附属北京佑安医院 单管多引物小型集合hiv核酸检测试剂盒
CN102250891A (zh) * 2011-07-26 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种辅助鉴定hiv的引物组合物及其应用
CN102250890A (zh) * 2011-07-26 2011-11-23 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 辅助鉴定hiv的引物组合物及其应用

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