CN116694822B - 实时荧光环介导恒温扩增检测人类嗜t淋巴细胞i型病毒的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实时荧光环介导恒温扩增检测人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒的方法及试剂盒，本发明通过对HTLV‑1的PX基因及ACTB基因通过专业软件分别设计用于实时荧光环介导恒温扩增技术检测的特异性寡核苷酸引物，以引物序列组扩增待测样品模板，进行目的基因片段的特异性扩增，根据加入的荧光染料判断是否出现两条荧光扩增曲线果来分析样本是否含有HTLV‑1病毒。本发明能够避免在扩增结束后电泳污染的情况，只需荧光扩增曲线就可以实现对HTLV‑1的检测，方便判读，保证了检测的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种实时荧光环介导恒温扩增检测人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒的方法及试剂盒，属于病毒的快速检测技术领域。
背景技术
在生物分子检测领域，实现核酸检测最重要手段的是qPCR方法。近几年，由于PCR技术的不断成熟，特别是实时荧光定量PCR(qPCR)的出现，使得基于qPCR的分子诊断产品日渐成为主流。但常规的PCR技术由于热循环的需要，使这一技术完全依赖于电源和昂贵的PCR仪器，从而限制了这一技术在实验室之外的应用，也正是实时荧光环介导恒温扩增(RT-LAMP)检测人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒需要解决的关键问题。
另外一个需要解决的重要问题是人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型(HTLV-1)病毒的快速检测。恒温核酸扩增技术的发展成为一个不可逆转的趋势，快速也是实时荧光环介导恒温扩增(RT-LAMP)最重要的特性，自2000年代早期环介导恒温扩增(LAMP)方法发明以来，它已被建立用于检测越来越多的对公共卫生具有重要意义的人类病毒，例如乙型和丙型肝炎病毒、HIV、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒一种病毒，以及最近的SARS-CoV-2，其性能等同于基于PCR的检测。但是速度却明显优于PCR检测，正常的PCR检测需要2小时左右，而环介导恒温扩增法只需30分钟左右就可以实现对阳性病毒的检测。然而，这种检测方法有以下两个缺点：这种测量需要在终点处开管，这在LAMP反应中是一个不明智的选择，因为携带污染的风险很大。此外，判断存在一定的主观性，会随着操作者不同的操作经验而变化，所以他们的方法可能不符合现代人对精准医疗的追求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单快速、检测效率高的实时荧光环介导恒温扩增检测HTLV-1病毒的方法。本发明不再通过琼脂糖凝胶电泳法来分析检测结果，避免造成交叉污染及气溶胶的产生。同时只需荧光扩增曲线就可以实现对HTLV-1病毒的检测，取代了传统的终点荧光法，更方便检验人员的判读而不是主观的肉眼观察。
本发明的另一目的是提供上述方法检测HTLV-1型病毒的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
首先通过对HTLV-1的PX基因(序列如序列表NO.25所示)及ACTB基因(序列如序列表NO.26所示)通过专业软件分别设计用于实时荧光环介导恒温扩增技术检测的特异性寡核苷酸引物，以引物序列组扩增待测样品模板，进行目的基因片段的特异性扩增。
本发明检测方法包括以下步骤：
(1)从待检血液样品中提取模板DNA；
(3)实时荧光环介导恒温扩增反应步骤：将上述模板DNA同时加入A、B两个反应体系中进行扩增反应，其中A体系所使用的引物序列如下：
SEQ NO1:ACATCGTCACGCCCTACT
SEQ NO2:TGTTGGGGGTTGTATGAGTG
SEQ NO3:CTGAGCCGATAACGCGTCCACCACCTGTCCAGAGCATCA
SEQ NO4:CCTTATCCCTCGACTCCCCTCCCGGGGTAAGGACCTTGAGG
SEQ NO5:TGGGGTCCCAGGTGATC
SEQ NO6:TTCCCCACCCAGAGAACC
B体系所使用的引物序列如下：
SEQ NO7：TGCTGCTGACCGAGGC
SEQ NO8：ATGGGGGAGGGCATACC
SEQ NO9：TACATGGCTGGGGTGTTGAAGGAAGGCCAACCGCGAGA
SEQ NO10：ATCCAGGCTGTGCTATCCCTGTGTGGGTGACCCCGTCA
SEQ NO11：TCAAACATGATCTGGGTCATCT
SEQ NO12：CGAGAAGATGACCCAGATCATGT
(4)根据加入的荧光染料判断是否出现两条荧光扩增曲线果来分析样本是否含有HTLV-1病毒。
对于阳性的样本：在配制的A体系的YO-PRO荧光染料，随着阳性的实时荧光环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链，同时YO-PRO分子会大量嵌入PX目的基因核苷酸链中，从而使YO-PRO分子产生荧光，并被仪器采集处理成一条“S”型扩增曲线；同时B体系的荧光染料，随着ACTB内参基因的实时荧光环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链，同时YO-PRO分子会大量嵌入ACTB目的基因核苷酸链中，从而使YO-PRO分子产生荧光，并被仪器采集处理成一条“S”型扩增曲线，即共产生两条“S”型扩增曲线。
对于阴性的样本：在配制的A体系的YO-PRO荧光染料，由于没有PX目的基因片段，无法扩增出相应的核苷酸链，YO-PRO分子无法嵌入PX目的基因核苷酸链中，从而YO-PRO分子无法产生荧光，无法产生一条“S”型扩增曲线；B体系的荧光染料，随着ACTB内参基因的实时荧光环介导恒温扩增会合成大量的核苷酸链，同时YO-PRO分子会大量嵌入ACTB目的基因核苷酸链中，从而使YO-PRO分子产生荧光，并被仪器采集处理成一条“S”型扩增曲线，即共产生一条“S”型扩增曲线。
本发明步骤(3)中实时荧光环介导恒温扩增反应条件为：
65℃45分钟；80℃2分钟。
一种应用上述检测方法的试剂盒，包括以下反应体系：
A反应体系
B反应体系
本发明试剂盒中A反应体系中扩增体系预混合物中含有10XIsothermal反应缓冲液II 2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL10mmol/L dNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱，B反应体系中的扩增体系预混合物中含有10X Isothermal反应缓冲液II 2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL 10mmol/L dNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱。
其中，10X Isothermal反应缓冲液II含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的硫酸铵、500mM的氯化钾、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；其中所述dNTPs中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。
此外为了测试本试剂盒的检测灵敏度，对HTLV-1感染血液中的DNA样本进行连续稀释，每管3.4×104，3.4×103，3.4×102，3.4×101，3.4×100拷贝，按上述步骤重复进行三次独立的反应和检测，结果显示本检测试剂盒的检测灵敏度为34拷贝。
与现有技术相比，本发明有如下优点：
本发明的与传统的环介导恒温扩增法电泳分析结果相比，实时荧光环介导恒温扩增法检测能够避免在扩增结束后电泳污染的情况。与传统的终点荧光法相比，本发明只需荧光扩增曲线就可以实现对HTLV-1的检测，更方便检验人员的判读而不是主观的肉眼观察，因此具有优势。本发明还加入内参基因ACTB作为对照，防止因为提取或试剂问题造成的假阴性结果。
本发明试剂盒的检测灵敏度为34拷贝，既提供了结果观察直观、简便快速的检测途径也保证了检测的特异性和灵敏度。本发明更加接近现在常用的核酸检测及分析，有利于现阶段新型输血传染病毒的基因检测在医疗单位等的推广使用，为输血传播病原体检测的发展和推广提供一个新的思路。
附图说明
图1a是使用不同引物的RT-LAMP的ΔTq值柱图。
图1b是包含SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3、SEQ NO4、SEQ NO5、SEQ NO6的反应管A，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图。
图1c是包含SEQ NO13、SEQ NO14、SEQ NO15、SEQ NO16、SEQ NO17、SEQ NO18的反应管C，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图。
图1d是包含SEQ NO19、SEQ NO20、SEQ NO21、SEQ NO22、SEQ NO23、SEQ NO24的反应管D，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图。
图2a是使用本试剂盒检测简单处理的感染HTLV-1的血液样本的扩增结果；
图2b是使用本试剂盒检测简单处理的未感染HTLV-1的血液样本的扩增结果。
图3是使用HTLV-1感染血液中连续稀释的DNA作为模板检测本试剂盒的灵敏度检测的实验结果。
图4是本试剂盒使用血液样本在3.4×104拷贝到3.4×101拷贝的范围内，Tq值与拷贝数的对数之间的线性关系，误差条是三次重复测量的标准差。
图5a是不同浓度dNTPs的RT-LAMPΔTq值柱图；
图5b为使用dNTPs浓度为1mM时，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图；
图5c为使用dNTPs浓度为1.2mM时，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图；
图5d为使用dNTPs浓度为1.4mM时，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图；
图5e为使用dNTPs浓度为1.6mM时，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线图。
图6a是使用不同浓度的Tte UvrD解旋酶的RT-LAMPΔTq值柱图；
图6b为使用Tte UvrD解旋酶在1×10-6μg浓度下，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线；
图6c为使用Tte UvrD解旋酶在2×10-6μg浓度下，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线；
图6d为使用Tte UvrD解旋酶在3×10-6μg浓度下，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线；
图6e为使用Tte UvrD解旋酶在4×10-6μg浓度下，HTLV-1阳性样本与空白对照的荧光曲线，在4×10-6μg浓度下，空白对照没有出现。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
献血者样本的筛选：
(1)从广东省中山市中心血站抽取2021年5月至2022年5月符合《中国献血者健康检查要求》和《中华人民共和国献血法》相关规定和标准的献血者；
(2)对以上献血者使用万泰HTLV-1病毒检测试剂盒(ELISA法)进行HTLV-1病毒的检测，结果显示阳性的血液样本送至广东省广州市血液中心进行HTLV-1病毒的确认实验，对于确认感染的血液样本作为待检血液样品。
实施例1：HTLV-1RT-LAMP引物的筛选
1、HTLV-1RT-LAMP引物设计
为了验证引物对实时荧光环介导恒温扩增检测HTLV-1病毒特异性的影响，我们根据HTLV-1[GenBank:L36905.1]的PX基因序列，使用PrimerExplorer V4软件(http://primerexplorer.jp；Eiken Chemical 125Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)分别设计3组针对HTLV-1病毒的RT-LAMP引物。3组引物序列如下：
SEQ NO1:ACATCGTCACGCCCTACT
SEQ NO2:TGTTGGGGGTTGTATGAGTG
SEQ NO3:CTGAGCCGATAACGCGTCCACCACCTGTCCAGAGCATCA
SEQ NO4:CCTTATCCCTCGACTCCCCTCCCGGGGTAAGGACCTTGAGG
SEQ NO5:TGGGGTCCCAGGTGATC
SEQ NO6:TTCCCCACCCAGAGAACC
SEQ NO13 AGCATCAGATCACCTGGGA
SEQ NO14 GGGGAGTATTTGCGCATGG
SEQ NO15 TTCTCTGGGTGGGGAAGGAGGCCATCGATGGACGCGTTAT
SEQ NO16 AGACCCTCAAGGTCCTTACCCCGAAGGAGGGTGGAATGTTGG
SEQ NO17 AACTGTAGAGCTGAGCCG
SEQ NO18 GCCAATCACTCATACAACCC
SEQ NO19 TGGGGGACTATGTTCGGC
SEQ NO20 TGTTGGGGGTTGTATGAGTG
SEQ NO21 TCCATCGATGGGGTCCCAGGCCTACATCGTCACGCCCTA
SEQ NO22 CCTTATCCCTCGACTCCCCTCCCGGGGTAAGGACCTTGAGG
SEQ NO23 TGCTCTGGACAGGTGGC
SEQ NO24 CCACCCAGAGAACCTCTAAG
2、待检血液样品DNA提取：
(1)取100μL血清加入1.5mLEP管中；
(2)加入500μL溶液DNA/RNA DirOut-A，漩涡混合30s；
(3)漩涡完毕后加入100μL的DNA/RNA DirOut-B溶液，漩涡混合均匀，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。
3、实时荧光环介导恒温扩增反应：
(1)其中用于实时荧光环介导恒温扩增反应的试剂盒包括：
实时荧光环介导恒温扩增反应管A，它包括扩增体系预混合物2x
12.5μL、SEQ NO1 100mM 0.4μL、SEQ NO2 100mM 0.4μL、SEQ NO3 20mM 0.25μL、SEQ NO4 20mM 0.25μL、SEQ NO5 100mM 0.2μL、SEQ NO6 100mM 0.2μL、Bst3.0 DNA聚合酶8U/μL 1μL、YO-PROTM-1碘化物25mM 0.5μL、灭菌水7.6μL、Tte UvrD解旋酶20x107μg/mL0.2μL。
实时荧光环介导恒温扩增反应管C，它包括扩增体系预混合物2x
12.5μL、SEQ NO13 100mM 0.4μL、SEQ NO14 100mM 0.4μL、SEQ NO15 20mM 0.25μL、SEQ NO16 20mM 0.25μL、SEQ NO17 100mM 0.2μL、SEQ NO18 100mM 0.2μL、Bst3.0 DNA聚合酶8U/μL 1μL、YO-PROTM-1碘化物25mM 0.5μL、灭菌水7.6μL、Tte UvrD解旋酶20x107μg/mL0.2μL。
实时荧光环介导恒温扩增反应管D，它包括扩增体系预混合物2x
12.5μL、SEQ NO19 100mM 0.4μL、SEQ NO20 100mM 0.4μL、SEQ NO21 20mM 0.25μL、SEQ NO22 20mM 0.25μL、SEQ NO23 100mM 0.2μL、SEQ NO24 100mM 0.2μL、Bst3.0 DNA聚合酶8U/μL 1μL、YO-PROTM-1碘化物25mM 0.5μL、灭菌水7.6μL、Tte UvrD解旋酶20x107μg/mL0.2μL。
其中的A、C、D反应扩增体系预混合物中含有10X Isothermal反应缓冲液II2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL 10mmol/LdNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱。其中所述dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。
(2)在装有22.5μL RT-LAMP反应液的反应管(反应管A、反应管C、反应管D)中分别加入2.5μL待检样品模板DNA。
(3)于恒温扩增仪65℃孵育45分钟，80℃孵育2分钟中止反应。
(4)观察扩增结果。
4、结果观察：
ΔTq被定义为阳性反应和空白对照(无质粒)之间的时间差距。，从图1a-图1d中我们可以看到，荧光环介导恒温扩增反应管A，即SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3、SEQ NO4、SEQNO5、SEQ NO6引物有最长的时间间隔(超过25分钟)，这表明在检测HTLV-1目标方面具有良好的特异性。
实施例2：
采用本发明的实时荧光环介导恒温扩增快速检测试剂盒对临床样品进行检测，检测程序包括下列步骤：
1、待检血液样品DNA提取：
(1)取100μL血清加入1.5mLEP管中；
(2)加入500μL溶液DNA/RNA DirOut-A，漩涡混合30s；
(3)漩涡完毕后加入100μL的DNA/RNA DirOut-B溶液，漩涡混合均匀，取上清到无菌离心管中，即为待检模板DNA。
2、实时荧光环介导恒温扩增反应：
(1)其中用于实时荧光环介导恒温扩增反应的试剂盒包括：
实时荧光环介导恒温扩增反应管A，它包括扩增体系预混合物2x
12.5μL、SEQ NO1 100mM 0.4μL、SEQ NO2 100mM 0.4μL、SEQ NO3 20mM 0.25μL、SEQ NO4 20mM 0.25μL、SEQ NO5 100mM 0.2μL、SEQ NO6 100mM 0.2μL、Bst 3.0DNA聚合酶8U/μL 1μL、YO-PROTM-1碘化物25mM 0.5μL、灭菌水7.6μL、Tte UvrD解旋酶20x107μg/mL0.2μL。
实时荧光环介导恒温扩增反应管B,它包含扩增体系预混合物2x
12.5μL、SEQ NO7 100mM 0.4μL、SEQ NO8 100mM 0.4μL、SEQ NO9 20mM 0.25μL、SEQ NO10 20mM 0.25μL、SEQ NO11 100mM 0.2μL、SEQ NO12 100mM 0.2μL、Bst 3.0DNA聚合酶8U/μL 1μL、YO-PROTM-1碘化物25mM 0.5μL、灭菌水7.6μL、Tte UvrD解旋酶20x107μg/mL0.2μL。
其中的A反应管和B反应管中的扩增体系预混合物相同，均含有10X Isothermal反应缓冲液II 2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL 10mmol/L dNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱；其中，10×ThermoPol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的硫酸铵、500mM的氯化钾、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100；其中dNTP中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。
(2)在装有22.5μL LAMP反应液的反应管(反应管A和反应管B)中分别加入2.5μL待检样品模板DNA。
(3)于恒温扩增仪65℃孵育45分钟，80℃孵育2分钟中止反应。
(4)观察扩增结果。
3、结果观察：
对于阳性的样本，产生两条“S”型扩增曲线(如图2a所示)；
对于阴性的样本，共产生一条“S”型扩增曲线(如图2b所示)。
实施例3：灵敏度检测：
此外为了测试本试剂盒的检测灵敏度，对HTLV-1感染血液中的DNA样本(同实施例1样本测)定OD值后进行连续稀释，每管3.4×104，3.4×103，3.4×102，3.4×101，3.4×100拷贝，按实施例1的扩增反应步骤重复进行三次独立的反应和检测，结果如图3所示，显示本检测试剂盒的检测灵敏度为34拷贝。
HTLV-1RT-LAMP标准曲线的线性关系是通过3.4×104，3.4×103，3.4×102，3.4×101，3.4×100拷贝的10倍稀释倍数连续检测3次建立的。结果图4所示，显示了到达阳性值的时间(Tq值)与DNA拷贝的log10之间具有良好的线性关系，决定系数(R2)为0.9417。
实施例4：dNTPs浓度优化：
为了提升本试剂盒的检测特异性，设置1.0、1.2、1.4、1.6mM 4个浓度梯度的dNTPs，对HTLV-1感染血液中的DNA样本(同实施例1样本)按实施例1的扩增反应步骤进行检测，扩增结果显示(如图5a-5e所示)，随着dNTPs浓度的增加，背景(不含质粒)时间先增加后减少。从图5a柱图中可以看出，在1.4mM处存在最长的时间间隔(29.67min)，说明在1.4mM浓度下dNTPs对HTLV-1靶点的检测特异性较好。
实施例5：Tte UvrD解旋酶的浓度优化：
为了提升本试剂盒的检测特异性，分别设置浓度为1×10-6、2×10-6、3×10-6和4×10-6μg的Tte UvrD解旋酶，对HTLV-1感染血液中的DNA样本(同实施例1样本)按实施例1的扩增反应步骤进行检测，结果如图6a所示，背景(不含质粒)时间随着Tte UvrD解旋酶浓度的增加而增加。从图6b-6e可以看出，当解旋酶的浓度增加到4×10-6μg时，如图6e所示，背景(空白对照)没有出现，扩增效率也没有明显降低，说明在4×10-6μg浓度下，Tte UvrD解旋酶检测HTLV-1靶标具有良好的特异性。
Claims (3)
1.一种实时荧光环介导恒温扩增检测人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒检测方法的试剂盒，其特征在于包括以下反应体系：
A反应体系
扩增体系预混合物 浓度2ⅹ 加样量12.5µL
SEQ NO1 浓度100mM 加样量0.4µL
SEQ NO2 浓度100mM 加样量0.4µL
SEQ NO3 浓度20mM 加样量0.25µL
SEQ NO4 浓度20mM 加样量0.25µL
SEQ NO5 浓度100mM 加样量0.2µL
SEQ NO6 浓度100mM 加样量0.2µL
Bst 3.0DNA聚合酶 浓度8U/µL 加样量1µL
YO-PRO™-1碘化物 浓度25mM 加样量0.5µL
灭菌水 加样量9.1µL
Tte UvrD 解旋酶 加样量4x10-6μg；
B反应体系
扩增体系预混合物 浓度2ⅹ 加样量12.5µL
SEQ NO7 浓度100mM 加样量0.4µL
SEQ NO8 浓度100mM 加样量0.4µL
SEQ NO9 浓度20mM 加样量0.25µL
SEQ NO10 浓度20mM 加样量0.25µL
SEQ NO11 浓度100mM 加样量0.2µL
SEQ NO12 浓度100mM 加样量0.2µL
Bst 3.0DNA聚合酶 浓度8U/µL 加样量1µL
YO-PRO™-1碘化物 浓度25mM 加样量0.5µL
灭菌水 加样量9.1µL
Tte UvrD 解旋酶 加样量4x10-6μg；
所述A反应体系和B反应体系的引物序列如下：
SEQ NO1:ACATCGTCACGCCCTACT
SEQ NO2:TGTTGGGGGTTGTATGAGTG
SEQ NO3:CTGAGCCGATAACGCGTCCACCACCTGTCCAGAGCATCA
SEQ NO4:CCTTATCCCTCGACTCCCCTCCCGGGGTAAGGACCTTGAGG
SEQ NO5:TGGGGTCCCAGGTGATC
SEQ NO6:TTCCCCACCCAGAGAACC
SEQ NO7：TGCTGCTGACCGAGGC
SEQ NO8：ATGGGGGAGGGCATACC
SEQ NO9：TACATGGCTGGGGTGTTGAAGGAAGGCCAACCGCGAGA
SEQ NO10：ATCCAGGCTGTGCTATCCCTGTGTGGGTGACCCCGTCA
SEQ NO11：TCAAACATGATCTGGGTCATCT
SEQ NO12：CGAGAAGATGACCCAGATCATGT。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于A反应体系中扩增体系预混合物中含有10X Isothermal 反应缓冲液 II 2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL 10mmol/LdNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱，B反应体系中的扩增体系预混合物中含有10X Isothermal 反应缓冲液 II 2.5uL、1.5μL 100mmol/L硫酸镁、3.5μL 10mmol/L dNTPs、5μL 5mol/L甜菜碱；所述10X Isothermal 反应缓冲液 II含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的硫酸铵、500mM的氯化钾、20mM的硫酸镁和1％的曲拉通X-100。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的dNTPs中含有的dATP、dTTP、dCTP、dGTP的质量比为1∶1∶1∶1。
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