CN117403009B - 一种用于联合检测四种牛源性rna病毒的试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂及试剂盒。本发明的试剂包括用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针。通过特定的引物和探针序列，可实现在一管反应中进行一次扩增就能够同时检测生物制品中牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒以及牛副流感病毒3型，且本发明的检测试剂或试剂盒对四种牛源性RNA病毒均具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，相互之间无干扰，无交叉反应，可快速检测大量样品。
Description
技术领域
本发明属于生物制品病毒检测技术领域，具体涉及一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂及试剂盒。
背景技术
生物制品主要是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成的用于人类疾病的预防、治疗或诊断的产品。由于生物制品的原料来源广泛且复杂，易存在外源病毒污染，且很多生物制品成分复杂不能进行终端灭菌，在生产制备的不同环节均需要进行严格的安全质量控制，尤其是对原材料的安全质量控制时保证生物制品安全的关键环节。对于生物制品的安全质量控制，病毒检测是关键。
牛源性RNA病毒作为生物制品病毒安全性评价的一个重要指标。常规的生物制品安全评价方法中，多使用传统检测方法，例如细胞实验、动物抗体产生实验，存在操作复杂、耗时长、误差大以及成本高等问题，严重限制生物制品的生产推广。而且生物制品中牛源性RNA病毒通常会涉及牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型等多种，导致检测周期被严重拉长。荧光定量PCR技术能够缩短实验周期，减少污染物，并且具有高灵敏度以及高特异性等优势从而渐渐推广开来，但是针对具体病毒，荧光定量PCR的实时准确的检测效果是建立在所选取的引物和探针的基础上的，且对于多种病毒的联合检测，需要保证所有病毒检测的灵敏度和准确度。用于联合检测多种牛源性RNA病毒的引物、探针组合成为研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速、准确地联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂，所述试剂包括用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针，
用于检测所述牛腹泻病毒的上游引物的序列为：5’-TCTCCCCAGATACCCACAGAG-3’或其互补序列，用于检测所述牛腹泻病毒的下游引物的序列为：5’-GTTGCCCCCTAGCGGTATATT-3’或其互补序列，用于检测所述牛腹泻病毒的探针的序列为：5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’或其互补序列；
用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的上游引物的序列为：5’-CCCCCTGTTGGAAACTACACA-3’或其互补序列，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的下游引物的序列为：5’-ACACAGAGCCTGCATTGTCA-3’或其互补序列，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的探针的序列为：5’-GGGTCAAACATCTGCTTAACTAGGACAG-3’或其互补序列；
用于检测所述蓝舌病病毒的上游引物的序列为：5’-CAGCTGTCCAAGCCGCTTTA-3’或其互补序列，用于检测所述蓝舌病病毒的下游引物的序列为：5’-CTTGCGCAATCCAACCGTTC-3’或其互补序列，用于检测所述蓝舌病病毒的探针的序列为：5’-ACTACCGCTTGGAGAGTTTTCACCTG-3’或其互补序列；
用于检测所述牛副流感病毒3型的上游引物的序列为：5’-AGAGCGGCAATCGAACAGAA-3’或其互补序列，用于检测所述牛副流感病毒3型的下游引物的序列为：5’-CTGCTTGGTCCCATTGTGTG-3’或其互补序列，用于检测所述牛副流感病毒3型的探针的序列为：5’-ATCAGACATCAACCTCGGGACAGAA-3’或其互补序列。
优选地，用于检测所述牛腹泻病毒的上游引物的序列为：5’-TCTCCCCAGATACCCACAGAG-3’，用于检测所述牛腹泻病毒的下游引物为：5’-GTTGCCCCCTAGCGGTATATT-3’，用于检测所述牛腹泻病毒的探针的序列为：5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’；
用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的上游引物的序列为：5’-CCCCCTGTTGGAAACTACACA-3’，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的下游引物为：5’-ACACAGAGCCTGCATTGTCA-3’，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的探针的序列为：5’-GGGTCAAACATCTGCTTAACTAGGACAG-3’；
用于检测所述蓝舌病病毒的上游引物为：5’-CAGCTGTCCAAGCCGCTTTA-3’，用于检测所述蓝舌病病毒的下游引物为：5’-CTTGCGCAATCCAACCGTTC-3’，用于检测所述蓝舌病病毒的探针的序列为：5’-ACTACCGCTTGGAGAGTTTTCACCTG-3’；
用于检测所述牛副流感病毒3型的上游引物的序列为：5’-AGAGCGGCAATCGAACAGAA-3’，用于检测所述牛副流感病毒3型的下游引物的序列为：5’-CTGCTTGGTCCCATTGTGTG-3’，用于检测所述牛副流感病毒3型的探针的序列为：5’-ATCAGACATCAACCTCGGGACAGAA-3’。
优选地，所述探针的序列的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团，各探针的序列之间标记的荧光基团不同。
进一步优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、TAMRA、ROX和CY5，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3。
优选地，将用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针混合溶解在无酶水中得到所述试剂，其中用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物浓度分别为8~15μM，用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的探针的浓度分别为4~6μM。
本发明还提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括分别独立包装的牛腹泻病毒的核酸标准品、牛呼吸道合胞体病毒的核酸标准品、蓝舌病病毒的核酸标准品和牛副流感病毒3型核酸标准品，
所述牛腹泻病毒的核酸标准品的序列为：TCTCCCCAGATACCCACAGAGTCCCTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGGATGCCTTTCAGGCAGGAATACAATGGCTTTGTACAATATACCGCTAGGGGGCAAC；
所述牛呼吸道合胞体病毒的核酸标准品的序列为：CCCCCTGTTGGAAACTACACACCTCTCCATTATGCACCACTGATAATAAAGAAGGGTCAAACATCTGCTTAACTAGGACAGATCGTGGGTGGTATTGTGACAATGCAGGCTCTGTGT；
所述蓝舌病病毒的核酸标准品的序列为：CAGCTGTCCAAGCCGCTTTAAGCGATCCGCAAATAATGAATCTGGTCGAAGAACTACCGCTTGGAGAGTTTTCACCTGGACGCATTTCAAGAACTATGATGCATAGTGCTCTTCTGAAGGAGTCTAGCGCTAAGGCGTTATTATCTAGTGGTTATAGACTAGAATATCAGAAGGCTTTGAACGGTTGGATTGCGCAAG；
所述牛副流感病毒3型的核酸标准品的序列为：AGAGCGGCAATCGAACAGAATCAACAAACCAAACCCATCAGACATCAACCTCGGGACAGAACCACACAATGGGACCAAGCAG。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
本发明还提供一种联合检测生物制品中牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒和牛副流感病毒3型的方法，以待检测生物制品中的RNA为模板，采用所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂或所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒进行多重荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待检测生物制品中的牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒和牛副流感病毒3型的含量。具体包括以下步骤：
1）从待测生物制品样品中提取核酸；
2）以步骤1）的核酸为模板，使用上述用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒进行多重荧光PCR扩增反应，收集荧光信号；
3）根据荧光信号判定待测生物制品样品中是否含有牛源性RNA病毒（牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型）。
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
优选地，所述步骤2）中多重荧光PCR扩增反应体系如表1所示：
优选地，所述多重荧光定量PCR反应的反应程序为：
40~44℃ 8~12min；
94~96℃ 25~35sec；
94~96℃ 4~6sec，58~62℃ 25~35sec，循环38~42次。
根据一些具体实施方式，所述多重荧光定量PCR反应的反应程序为：
42℃/10min；
95℃/30sec；
95℃/5sec，60℃/30sec，共40个循环。
根据一些具体实施方式，在牛腹泻病毒的探针的5’端连接荧光基团FAM，3’端连接淬灭基团BHQ1；在牛呼吸道合胞体病毒的探针的5’端连接荧光基团ROX，3’端连接淬灭基团BHQ2；在蓝舌病病毒的探针的5’端连接荧光基团VIC，3’端连接淬灭基团BHQ1；在牛副流感病毒3型的探针的5’端连接荧光基团TAMRA，3’端连接淬灭基团BHQ2。
以上述具体实施方式为例，多重荧光定量PCR反应后的结果判定方法为：在实验成立的基础上，如果待测生物制品样本检测结果在FAM通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判断为牛腹泻病毒核酸阳性；如果在ROX通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判为牛呼吸道合胞体病毒核酸阳性；如果在VIC通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判为蓝舌病病毒核酸阳性；如果在TAMRA通道Ct值≤35且有扩增曲线，则判为牛副流感病毒3型核酸阳性；如果在四个通道检测无Ct值或Ct值＞38，则判对应的病毒为阴性；如果待测生物制品样本在任一通道35＜Ct值≤38，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测，重复检测结果无Ct值则为阴性，否则阳性。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
采用本发明的检测试剂或试剂盒，可同时检测生物制品是否被牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒以及牛副流感病毒3型污染，实现在一管反应中只进行一次扩增即可对4种牛源性RNA病毒的病原物进行检测。且本发明的检测试剂或试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，且相互之间无交叉反应，可快速检测大量样品。
附图说明
图1为实施例1中FAM通道的牛腹泻病毒的敏感性扩增曲线示意图（核酸标准品浓度从左至右依次为2×107拷贝数/μL、2×106拷贝数/μL、2×105拷贝数/μL、2×104拷贝数/μL、2×103拷贝数/μL、2×101拷贝数/μL、2×100拷贝数/μL）。
图2为实施例1中ROX通道的牛呼吸道合胞体病毒的敏感性扩增曲线示意图（核酸标准品浓度从左至右依次为2×107拷贝数/μL、2×106拷贝数/μL、2×105拷贝数/μL、2×104拷贝数/μL、2×103拷贝数/μL、2×101拷贝数/μL、2×100拷贝数/μL）。
图3为实施例1中VIC通道的蓝舌病病毒的敏感性扩增曲线示意图（核酸标准品浓度从左至右依次为2×107拷贝数/μL、2×106拷贝数/μL、2×105拷贝数/μL、2×104拷贝数/μL、2×103拷贝数/μL、2×101拷贝数/μL、2×100拷贝数/μL）。
图4为实施例1中TAMRA通道的牛副流感病毒3型的敏感性扩增曲线示意图（核酸标准品浓度从左至右依次为2×107拷贝数/μL、2×106拷贝数/μL、2×105拷贝数/μL、2×104拷贝数/μL、2×103拷贝数/μL、2×101拷贝数/μL、2×100拷贝数/μL）。
图5为实施例1中阳性参考品和阴性参考品的扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，包括含有引物、探针的试剂、核酸标准品、PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
含有引物、探针的试剂由人工合成的引物、探针溶解在无酶水中制得，保存在-20℃下。用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针，具体序列如表2所示。用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物浓度分别为10μM，用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的探针的浓度分别为5μM。
核酸标准品为独立包装的人工合成的牛腹泻病毒核酸标准品、牛呼吸道合胞体病毒核酸标准品、蓝舌病病毒核酸标准品和牛副流感病毒3型核酸标准品，分别放置于-20℃以下保存备用。具体序列见表3。
PCR反应液为上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液（BeyoFastTM ProbeqPCR Mix（2×））。
TaqDNA聚合酶（5 U/μL）为赛默飞世尔科技公司的TaqDNA聚合酶（DreamTaq DNAPolymerase（5 U/μL））
和逆转录酶为赛默飞世尔科技公司的逆转录酶（SuperScript™ IV One-StepRT-PCR System）。
采用上述试剂盒制作标准曲线。
1）将上述核酸标准品稀释至2×100拷贝数/μL、2×101拷贝数/μL、2×103拷贝数/μL、2×104拷贝数/μL、2×105拷贝数/μL、2×106拷贝数/μL、2×107拷贝数/μL，以制成不同浓度的模板；
阳性对照为2×106拷贝数/μL标准品预混液，阴性对照为无酶无菌水（RNase/DNase free water）。
2）配制多重PCR反应体系：
PCR反应体系（20μL）：2×qPCR 反应液 10μL；TaqDNA聚合酶 0.4μL；逆转录酶 0.4μL；引物、探针试剂 0.4μL；模板 2μL；无酶无菌水（RNase/DNase free water）补足至20μL。
3）PCR反应条件：42℃ 10min；95℃ 30sec；95℃ 5sec，60℃ 30sec，循环40次。在60℃退火延伸时检测荧光信号，获得各浓度标准品的扩增曲线图，每个浓度标准品重复多重PCR反应3次。
4）根据扩增曲线（图1~4），以每一标准品浓度得到的Cq值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数为横坐标制作标准曲线，其中，Cq值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数，阈值为仪器自动生成，对应的标准曲线统计于表4。
本实施例中，核酸标准品在2×100~2×107拷贝数/μL浓度范围内，四种病毒的线性关系都很好，灵敏度都比较高。图1~4显示，本实施例中四种病毒检测特异性好，均无假阳性出现。
对比例1
本对比例提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同以及核酸标准品的序列不同，具体见表5和表6。表5中所示引物和探针的序列、表6中所示核酸标准品的序列与实施例1中的引物和探针是根据同样的病毒基因序列而设计的。
参照实施例1中进行多重PCR反应，四种病毒的标准曲线和检测限统计于表7。
如表7所示，本对比例对牛腹泻病毒检测线性关系符合要求，但扩增效率较低，对于低浓度稳定性及准确度差。牛呼吸道合胞体病毒检测时，具有明显的扩增曲线，但是线性关系较差且存在非特异性扩增，在检测病毒准确度方面较差，阴性对照存在假阳性的情况。蓝舌病病毒扩增效率及线性关系良好，但存在非特异性扩增，在检测病毒准确度及稳定性方面较差，阴性对照存在假阳性的情况。牛副流感病毒3型病毒也存在扩增效率较低的问题，对于低浓度病毒检测稳定性及准确度较差，对于2×103拷贝数/μL以下浓度的无法稳定检出。本对比例不适合作为联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒。
对比例2
本对比例提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同以及核酸标准品的序列不同，具体见表8和表9。表8中所示引物和探针的序列、表9中所示核酸标准品的序列与实施例1中的引物和探针是根据同样的病毒基因序列而设计的。
参照实施例1中进行多重PCR反应，四种病毒的标准曲线和检测限统计于表9。
如表10所示，本对比例检测牛腹泻病毒检测线性关系符合要求，扩增效率良好，未干扰物影响，对于低浓度病毒检测稳定，灵敏度好。牛呼吸道合胞体病毒检测时，具有明显的扩增曲线，但是线性关系较差且扩增效率低，检测限较高，低浓度病毒无法稳定检出。蓝舌病病毒线性关系良好，扩增效率较低且存在非特异性扩增，在检测病毒准确度及稳定性方面较差。牛副流感病毒3型病毒检测时存在扩增异常的问题。本对比例不适合作为联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒。
对比例3
本对比例提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同以及核酸标准品的序列不同，具体见表11和表12。表11中所示引物和探针的序列、表12中所示核酸标准品的序列与实施例1中的引物和探针是根据同样的病毒基因序列而设计的。
参照实施例1中进行多重PCR反应，四种病毒的标准曲线和检测限统计于表13。
如表13所示，本对比例中牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型病毒检测中具有明显的扩增曲线，线性关系良好，2×101拷贝数/μL浓度均能稳定检出，牛腹泻病毒和蓝舌病病毒虽然检测线性关系符合要求，但扩增效率差。本对比例也不是理想的联合检测试剂盒。
对比例4
本对比例提供一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其基本同实施例1，区别在于引物、探针的序列不同以及核酸标准品的序列不同，具体见表14和表15。表14中所示引物和探针的序列、表15中所示核酸标准品的序列与实施例1中的引物和探针是根据同样的病毒基因序列而设计的。
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参照实施例1中进行多重PCR反应，四种病毒的标准曲线和检测限统计于表16。
如表16所示，本对比例对蓝舌病病毒检测具有明显的扩增曲线，线性关系良好，2×101拷贝数/μL浓度也能稳定检出。牛腹泻病毒检测线性关系差，扩增反应不稳定。牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型均存在非特异性扩增，阴性对照存在假阳性的情况。本对比例不适合作为联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒。
实施例2
生物制品中四种牛源性RNA病毒联合检测方法验证
本实施例采用被牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型污染的ST细胞培养液进行验证，包括以下步骤：
待测生物制品的总RNA提取：取500μL经过离心浓缩后的ST细胞培养液到1.5mL离心管中（其中人为加入牛腹泻病毒标准品、牛呼吸道合胞体病毒标准品、蓝舌病病毒标准品、牛副流感病毒3型标准品），之后加入500μL TRIZOL试剂充分混匀，室温静置10分钟。静置后加入200μL氯仿，震荡30s充分混匀。于4℃、13000rpm离心15分钟，取上层液相转移到干净的离心管中。加入等体积异丙醇，然后轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10min。4℃、13000rpm离心15分钟。弃上清，沉淀中加入500μL预冷的75%乙醇，4℃、13000rpm离心10分钟，使用枪头吸去所有上清，沉淀于生物安全柜中室温干燥10分钟，最后加入20μL DEPC水溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）以提取的待测生物制品的总RNA为模板，使用实施例1的试剂盒，参照实施例1的反应体系和PCR反应条件进行多重PCR检测，以培养基为阴性对照，获得待测生物制品中各病毒的扩增曲线，阴性对照无扩增曲线。
（3）将待测生物制品中各病毒的扩增曲线的Cq值代入实施例1得到的标准曲线，计算得到待测生物制品中牛腹泻病毒含量为1.26×106拷贝数/μL、牛呼吸道合胞体病毒含量为5.93×105拷贝数/μL、蓝舌病病毒含量为3.90×105拷贝数/μL、牛副流感病毒3型含量为1.33×105拷贝数/μL。
采用本发明的试剂盒进行生物制品中四种牛源性RNA病毒多重PCR联合检测具有以下优势：
1、简单快速：本发明从核酸角度对牛源性RNA病毒进行检测，从样品核酸提取开始到获得只需4小时左右。在操作前可对样品进行适当的灭活处理，减少污染与感染的风险。本发明可以同时检测四种牛源性RNA病毒，大大提高检测效率，适用于大规模样品检测。
2、灵敏度高：在病毒含量较低的情况下，检测不到的情况有极大概率发生，本发明检测牛源性RNA病毒时，每个病毒核酸标准品在2×100~2×107拷贝数/μL浓度范围内均具有很好的线性且灵敏度均可达到2×101拷贝数/μL。
3、重复性、准确性好，特异性强：本发明的试剂盒在用于检测时，重复性SD≤0.5，准确性高，特异性强，无假阳性，相互之间无干扰。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针，
用于检测所述牛腹泻病毒的上游引物的序列为：5’-TCTCCCCAGATACCCACAGAG-3’，用于检测所述牛腹泻病毒的下游引物的序列为：5’-GTTGCCCCCTAGCGGTATATT-3’，用于检测所述牛腹泻病毒的探针的序列为：5’-CTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGG-3’；
用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的上游引物的序列为：5’-CCCCCTGTTGGAAACTACACA-3’，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的下游引物的序列为：5’-ACACAGAGCCTGCATTGTCA-3’，用于检测所述牛呼吸道合胞体病毒的探针的序列为：5’-GGGTCAAACATCTGCTTAACTAGGACAG-3’；
用于检测所述蓝舌病病毒的上游引物的序列为：5’-CAGCTGTCCAAGCCGCTTTA-3’，用于检测所述蓝舌病病毒的下游引物的序列为：5’-CTTGCGCAATCCAACCGTTC-3’，用于检测所述蓝舌病病毒的探针的序列为：5’-ACTACCGCTTGGAGAGTTTTCACCTG-3’；
用于检测所述牛副流感病毒3型的上游引物的序列为：5’-AGAGCGGCAATCGAACAGAA-3’，用于检测所述牛副流感病毒3型的下游引物的序列为：5’-CTGCTTGGTCCCATTGTGTG-3’，用于检测所述牛副流感病毒3型的探针的序列为：5’-ATCAGACATCAACCTCGGGACAGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂，其特征在于，所述探针的序列的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团，各探针的序列之间标记的荧光基团不同。
3.根据权利要求2所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、TAMRA、ROX和CY5，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3。
4.根据权利要求1所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂，其特征在于，将用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物和探针混合溶解在无酶水中得到所述试剂，其中用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的上游引物、下游引物浓度分别为8~15μM，用于检测牛腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、蓝舌病病毒、牛副流感病毒3型的探针的浓度分别为4~6μM。
5.一种用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂。
6.根据权利要求5所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括分别独立包装的牛腹泻病毒的核酸标准品、牛呼吸道合胞体病毒的核酸标准品、蓝舌病病毒的核酸标准品和牛副流感病毒3型核酸标准品，
所述牛腹泻病毒的核酸标准品的序列为：TCTCCCCAGATACCCACAGAGTCCCTTGTCACATCTCATTTGGTTCACGGATGCCTTTCAGGCAGGAATACAATGGCTTTGTACAATATACCGCTAGGGGGCAAC；
所述牛呼吸道合胞体病毒的核酸标准品的序列为：CCCCCTGTTGGAAACTACACACCTCTCCATTATGCACCACTGATAATAAAGAAGGGTCAAACATCTGCTTAACTAGGACAGATCGTGGGTGGTATTGTGACAATGCAGGCTCTGTGT；
所述蓝舌病病毒的核酸标准品的序列为：CAGCTGTCCAAGCCGCTTTAAGCGATCCGCAAATAATGAATCTGGTCGAAGAACTACCGCTTGGAGAGTTTTCACCTGGACGCATTTCAAGAACTATGATGCATAGTGCTCTTCTGAAGGAGTCTAGCGCTAAGGCGTTATTATCTAGTGGTTATAGACTAGAATATCAGAAGGCTTTGAACGGTTGGATTGCGCAAG；
所述牛副流感病毒3型的核酸标准品的序列为：AGAGCGGCAATCGAACAGAATCAACAAACCAAACCCATCAGACATCAACCTCGGGACAGAACCACACAATGGGACCAAGCAG。
7.根据权利要求5所述的用于联合检测四种牛源性RNA病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶和逆转录酶。
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