CN116004916A - 一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针及试剂盒。本发明的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5’‑TTGGCGGGATGGCAGTTGTT‑3’；所述的下游引物的序列为5’‑ACAGGGTACGAGACGGGCAT‑3’；所述的探针的序列为5’‑ACGGGTTCGGGGTACGAGTGT‑3’。采用本发明的引物、探针进行猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光定量PCR检测，具有简单快速，灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高等优点。

Description

一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明具体涉及一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

生物制品主要是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成的用于人类疾病的预防、治疗或诊断的产品。相较于小分子药物而言，生物制品生产过程中使用的各种材料来源复杂，可能引入外源因子或毒性化学材料，加之制剂成分复杂且一般不能进行终端灭菌，质量控制仅靠成品检定难以保证其安全性和有效性。因此，对生物制品生产用原材料和辅料进行严格的安全质量控制，是降低外源因子或有毒杂质污染风险、保证生物制品安全有效的必要措施。为了检测病毒是否存在，需要使用一些检测方法对生物制品进行检测。

猪血凝性脑脊髓炎病毒作为生物制品病毒安全性评价的一个重要指标，高效检测猪血凝性脑脊髓炎病毒成为安全性评价中的重要环节。常规的生物制品安全评价方法中，多使用传统检测方法，例如细胞实验、动物抗体产生实验，存在操作复杂、耗时长、误差大以及成本高等问题，严重限制生物制品的生产推广。荧光定量PCR技术能够缩短实验周期，减少污染物，并且具有高灵敏度以及高特异性等优势从而渐渐推广开来，但是针对具体病毒，荧光定量PCR的实时准确的检测效果是建立在所选取的引物和探针的基础上的，因此，用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物和探针成为研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速、准确地检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针及试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5’-TTGGCGGGATGGCAGTTGTT-3’；所述的下游引物的序列为5’-ACAGGGTACGAGACGGGCAT-3’；所述的探针的序列为5’-ACGGGTTCGGGGTACGAGTGT-3’。

优选地，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团。

进一步优选地，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。

本发明还提供一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物、探针。

优选地，所述的试剂盒还包括DNA标准品，所述的DNA标准品的序列为TTGGCGGGATGGCAGTTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAATCAAAAGATACTAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGTCTCGTACCCTGT。

优选地，所述的试剂盒还包括购自上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液BeyoFast^TM Probe qPCR Mix(2×)。

本发明还提供所述的引物、探针或所述的试剂盒在检测生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒中的应用。

本发明还提供一种检测生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，以待检测生物制品中的DNA为模板，采用所述的引物、探针进行荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待检测生物制品中的猪血凝性脑脊髓炎病毒的含量。

优选地，所述的荧光定量PCR反应的反应体系为：购自上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液(BeyoFast^TM Probe qPCR Mix(2×))10μL；上游引物：10μM 0.6μL；下游引物：10μM 0.6μL；探针：10μM 0.4μL；待测生物制品总DNA 2μL；无酶无菌水补足20μL。

优选地，所述的荧光定量PCR反应的反应条件为95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，59℃退火/延伸30秒，循环数为40。在59℃退火/延伸时检测荧光信号。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

采用本发明的引物、探针进行猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光定量PCR检测，具有简单快速，检测灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高等优点。

附图说明

图1为实施例1得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度从左至右依次为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL、1×10³拷贝数/μL)；

图2为实施例1得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度从左至右依次为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL、1×10⁴拷贝数/μL、1×10³拷贝数/μL、1×10²拷贝数/μL)；

图3为实施例1得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度从左至右依次为10拷贝数/μL、1拷贝数/μL)；

图4为实施例1得到的扩增曲线示意图(从左至右依次包括浓度为1×10⁷拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁶拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁵拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁴拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁴拷贝数/μL的DNA标准品和ST细胞培养上清液的混合物、浓度为1×10³拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10²拷贝数/μL的DNA标准品)；

图5为对比例1得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度从左至右依次为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL、1×10⁴拷贝数/μL)；

图6为对比例2得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL、1×10⁴拷贝数/μL、1×10³拷贝数/μL)；

图7为对比例3得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度为1×10⁷拷贝数/μL，无明显扩增曲线)；

图8为对比例4得到的扩增曲线示意图(DNA标准品浓度为1×10⁷拷贝数/μL，无明显扩增曲线)；

图9为以实施例2的待测生物制品总DNA为模板得到的扩增曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明针对猪血凝性脑脊髓炎病毒DNA设计并筛选了用于荧光PCR定量检测的引物和探针。具体地，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5’-TTGGCGGGATGGCAGTTGTT-3’；所述的下游引物的序列为5’-ACAGGGTACGAGACGGGCAT-3’；所述的探针的序列为5’-ACGGGTTCGGGGTACGAGTGT-3’。

更具体地，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团TAMRA。

所述引物的扩增片段的长度为114bp，扩增片段的序列为TTGGCGGGATGGCAGTTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAATCAAAAGATACTAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGTCTCGTACCCTGT。

具体地，本发明以待检测生物制品中的DNA为模板，采用所述的引物、探针进行荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待检测生物制品中的猪血凝性脑脊髓炎病毒的含量。

更具体地，荧光定量PCR反应的反应体系为：购自上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液(BeyoFast^TM Probe qPCR Mix(2×))10μL；上游引物(10μM)0.6μL；下游引物(10μM)0.6μL；探针(10μM)0.4μL；待测生物制品总DNA 2μL；无酶无菌水补足20μL。荧光定量PCR反应的反应条件为95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，59℃退火/延伸30秒，循环数40。在59℃退火/延伸时检测荧光信号。

采用本发明的引物、探针进行生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒荧光定量PC检测具有以下优势：

1、简单快速：在病毒去除效果验证中，对猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测通常使用的是细胞实验，存在感染风险，需要时间长(8天左右)，而本发明从核酸角度对猪血凝性脑脊髓炎病毒进行检测，从生物制品总DNA提取开始到获得检测结果只需4小时左右。在操作前可进行适当的灭活处理，减少污染与感染的风险。

2、灵敏度高：在病毒含量较低的情况下，检测不到的情况有极大概率发生，本发明检测猪血凝性脑脊髓炎病毒时，DNA标准品在1×10²～1×10⁷拷贝数/μL浓度范围内，线性关系很好，R²≥0.999，灵敏度达到10拷贝数/μL。

3、重复性、准确性好，特异性强：本发明的引物探针在用于检测时，重复性SD＜0.5，以DNA标准品制作标准曲线，定量检测待测生物制品中可能含有的猪血凝性脑脊髓炎病毒的DNA含量，准确性高，以猪血凝性脑脊髓炎病毒核酸序列设计引物和探针，特异性强。

4、回收率高：荧光定量PCR方法回收率＞85％。

下面结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。

实施例1

本实施例提供一组用于生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的引物和探针。

引物及探针序列如表1所示。

表1

表1所示引物和探针的序列是根据NCBI基因库登录号为NC_007732.1的猪血凝性脑脊髓炎病毒的基因序列而设计的。

由基因合成公司通过人工合成的方式得到表1所示引物和探针，对探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团TAMRA。

由基因合成公司通过人工合成的方式得到猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的DNA标准品，DNA标准品的序列为：TTGGCGGGATGGCAGTTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAATCAAAAGATACTAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGTCTCGTACCCTGT(SEQ ID NO.16)，长度为114bp。

采用上述引物、探针及DNA标准品制作标准曲线。

1)将上述DNA标准品稀释至1拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1×10²拷贝数/μL、1×10³拷贝数/μL、1×10⁴拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁷拷贝数/μL，以制成不同浓度的DNA模板；

2)配制PCR反应体系：

PCR反应体系(20μL)：

上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液(BeyoFast^TM Probe qPCR Mix(2×))10μL；上游引物：10μM 0.6μL；下游引物：10μM 0.6μL；探针：10μM 0.4μL；待测生物制品总DNA(Total DNA)2μL；无酶无菌水(RNase/DNase free water)补足至20μL。

3)PCR反应条件：95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，59℃退火/延伸30秒，循环数40。在59℃退火延伸时检测荧光信号，获得各浓度标准品的扩增曲线图，每个浓度标准品重复PCR反应10次。

4)根据扩增曲线(图1～图3)，以每一标准品浓度得到的Cq值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数为横坐标制作标准曲线，其中，Cq值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数，阈值为仪器自动生成。

本实施例中，DNA标准品在10²～10⁷拷贝数/μL浓度范围内，线性关系很好，此范围内获得的标准曲线为：y＝-3.4066x+41.698，R²＝0.9994。DNA标准品为1×10⁷拷贝数/μL时，重复检测10次的Cq值的标准误差SD值为0.05；DNA标准品为1×10⁵拷贝数/μL时，重复检测10次的Cq值的标准误差SD值为0.12；DNA标准品为1×10³拷贝数/μL时，重复检测10次的Cq值的标准误差SD值为0.10。灵敏度为10拷贝数/μL。

以浓度为1×10⁷拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁶拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁵拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10⁴拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10³拷贝数/μL的DNA标准品、浓度为1×10²拷贝数/μL的DNA标准品制作标准曲线，以浓度为1×10⁴拷贝数/μL的DNA标准品和ST细胞培养上清液的混合物进行回收率检测，每个样品重复检测3次，扩增曲线见图4，回收率检测结果为89.12％。

对比例1

本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例使用的引物和探针如表2所示，表2所示引物和探针的序列同样是根据NCBI基因库登录号为NC_007732.1的猪血凝性脑脊髓炎病毒的基因序列而设计的。

表2

由基因合成公司通过人工合成的方式得到猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的DNA标准品，DNA标准品的序列为：ACGTGGGCTGCCAACTTTGAGCTCACATGTCTCCGTTACTTTGTAAAAGTTGGACGTGAGATTTGTTGTAATGTGTGCACTAAACGTGCCACAGTTTACAATTCTAGAACTGGTTACTATGGTTGTTGGCGCCATAGTGTTACATGTGATTACTTGTATAATCCACTTATTGTTGATATTCAACAGTGGGGATATACTGGTTCTTTATCAAGTAATCATGATTTATATTGTAGCATCCATAAAGGAGCACATGTTGCTTCCTCTGATGCTATAATGACACGGTGTTTGGCCGT(SEQ ID NO.17)，长度为293bp。

如图5所示，本对比例在DNA标准品浓度为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL和1×10⁴拷贝数/μL时具有明显的扩增曲线，但是重复性较差，复孔SD值＞0.5。灵敏度为1×10⁴拷贝数/μL，1×10³拷贝数/μL和1×10²拷贝数/μL未被检出。

对比例2

本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例使用的引物和探针如表3所示，表3所示引物和探针的序列同样是根据NCBI基因库登录号为NC_007732.1的猪血凝性脑脊髓炎病毒的基因序列而设计的。

表3

由基因合成公司通过人工合成的方式得到猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的DNA标准品，DNA标准品的序列为：CCGCGTGCTGAATTGAACGGCGTTGTGGTGGATAAAGTTGGAGACACTGATTGTGTGTTTTATTTTGCTGTGCGTAAAGAAGGTCAGGATGTCATCTTCAGCCAATTCGACAGCCTGGGA(SEQ IDNO.18)，长度为120bp。

如图6所示，本对比例在DNA标准品浓度为1×10⁷拷贝数/μL、1×10⁶拷贝数/μL、1×10⁵拷贝数/μL和1×10⁴拷贝数/μL、1×10³拷贝数/μL时具有明显的扩增曲线，但是线性关系较差，线性标准曲线为y＝-2.36x+26.18，R²＝0.9549。灵敏度为1×10³拷贝数/μL，且存在非特异性扩增。

对比例3

本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例使用的引物和探针如表4所示，表4所示引物和探针的序列同样是根据NCBI基因库登录号为NC_007732.1的猪血凝性脑脊髓炎病毒的基因序列而设计的。

表4

由基因合成公司通过人工合成的方式得到猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的DNA标准品，DNA标准品的序列为：TATATTTAGTGTGCCTTCTGATGTGTCTTTAACATATCTACTTGGTACTGCTACTAAACAAGTTGTTCTTGTTAGCAATAATCAAGAGGATTTTGATCTTATTTCTAAGTGTCAGATAACTGCTGTTGAGGGCACTAAGAAATTGGCAGAGCGTCTTTCTTTT(SEQ ID NO.19)，长度为163bp。

如图7所示，浓度为1×10⁷拷贝数/μL的DNA标准品无明显扩增曲线，特异性差。

对比例4

本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例使用的引物和探针如表5所示，表5所示引物和探针的序列同样是根据NCBI基因库登录号为NC_007732.1的猪血凝性脑脊髓炎病毒的基因序列而设计的。

表5

由基因合成公司通过人工合成的方式得到猪血凝性脑脊髓炎病毒检测的DNA标准品，DNA标准品的序列为：GCATGTCAGTTCTGCTTGTCAGGATTTGATATGTTAGATAATTATAAAGCTATTGATGTAGTACAGTATGAAGCTGATAGGAGAGTAGTTGTTGATTATACAGGTGTGTTGAAAATTGTCATTGAATTGATAGTAAGTTACGCCCTGTATACAGCATGGTTTTATCCTTTGTTTGCTCTTATCAGTCTTCAG(SEQ ID NO.20)，长度为192bp。

如图8所示，浓度为1×10⁷拷贝数/μL的DNA标准品无明显扩增曲线，特异性差。

实施例2

生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒检测方法验证

本实施例采用被猪血凝性脑脊髓炎病毒污染的ST细胞培养液进行验证，包括以下步骤：

(1)待测生物制品的总DNA提取：取400μL经过离心浓缩后的ST细胞培养液，分别加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液后使用旋涡混匀仪充分混匀，于15℃、13400rpm离心15分钟，收集上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，再次充分混匀后在-20℃放置30分钟，然后于4℃、13400rpm离心30分钟，弃上清，沉淀中加入500μL预冷的75％乙醇，4℃、13400rpm漂洗2次，沉淀于30℃真空干燥10分钟，最后加入10μL ddH₂O合并溶解两管沉淀，-20℃保存备用。

(2)以提取的待测生物制品的总DNA为模板，使用实施例1的引物和探针，参照实施例1的反应体系和PCR反应条件进行测试，以培养基为阴性对照，待测生物制品的扩增曲线如图9所示。

(3)根据实施例1得到的标准曲线，计算得到待测生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒的DNA含量为5.44×10⁴拷贝数/μL。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针，所述的引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述的上游引物的序列为5’-TTGGCGGGATGGCAGTTGTT-3’；所述的下游引物的序列为5’-ACAGGGTACGAGACGGGCAT-3’；所述的探针的序列为5’-ACGGGTTCGGGGTACGAGTGT-3’。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针，其特征在于，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的引物、探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。

4.一种用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1至3中任一项所述的引物、探针。

5.根据权利要求4所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括DNA标准品，所述的DNA标准品的序列为TTGGCGGGATGGCAGTTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAATCAAAAGATACTAATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGTCTCGTACCCTGT。

6.根据权利要求4所述的用于检测猪血凝性脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括购自上海碧云天生物技术有限公司的qPCR预混液BeyoFast^TM Probe qPCRMix（2×）。

7.如权利要求1至3中任一项所述的引物、探针或如权利要求4至6中任一项所述的试剂盒在检测生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒中的应用。

8.一种检测生物制品中猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测方法，其特征在于，以待检测生物制品的DNA为模板，采用权利要求1至3中任一项所述的引物、探针进行荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待检测生物制品中的猪血凝性脑脊髓炎病毒的含量。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应的反应条件为95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，59℃退火/延伸30秒，循环数为40。

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