CN117660702B - 检测丽水穿山甲病毒的荧光定量pcr引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测丽水穿山甲病毒的荧光定量PCR引物组及方法。本发明的引物组包括针对丽水穿山甲病毒VP11基因的一对特异性引物和TaqMan探针，利用该引物组制备的试剂盒扩增曲线良好，具有较好的特异性和灵敏度，与除丽水穿山甲病毒之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应，最低检测浓度为1.59×101 copies/μL。本发明的试剂盒和检测方法具有操作方法简单、反应结果特异性强、灵敏性高、耗时短等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测丽水穿山甲病毒的荧光定量PCR引物组及方法。
背景技术
丽水穿山甲病毒(Lishui pangolin virus，LSPV)是近几年来新发现的一种新型穿山甲瘟病毒。
目前对于穿山甲LSPV的研究甚少，尚无相关检测方法及诊断试剂盒，因此，开发能准确、快捷、有效的鉴定LSPV的技术和试剂盒对该病毒的防控是至关重要的。
发明内容
本发明的目的是为丽水穿山甲病毒检测提供一种特异、敏感、快速、简便、可定量检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法。
本发明的第一个目的是提供一种检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组，包括一对特异性引物和TaqMan探针，所述的特异性引物为LSPV-F和LSPV-R，所述的LSPV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的LSPV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
优选，所述的荧光报告基团为CY5，所述的荧光淬灭基团为BHQ2。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述的检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组的试剂盒。
优选，所述的试剂盒还包括2×Universal probe Mix、DEPC处理的ddH2O、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的VP11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
本发明的第三个目的是提供所述的检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组在制备用于检测丽水穿山甲病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
本发明的第四个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1. 提取待检样品的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用所述的检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S3. 反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有丽水穿山甲病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线（有特异性扩增反应），则待检样品中含有丽水穿山甲病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有丽水穿山甲病毒。
优选，所述的步骤S2的荧光定量PCR扩增的反应体系为20 μL，包含：10 μL 2×Universal probe Mix、1.0 μL 10 μM的引物LSPV-F、1.0 μL 10 μM的引物LSPV-R、0.4 μL10 μM的TaqMan探针（LSPV-probe）、1.0 μL cDNA模板，加DEPC处理的ddH2O补足至20 μL；所述的荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40个循环；在60℃延伸时收集荧光信号。
本发明具有如下优点和有益效果：
本发明的一种丽水穿山甲病毒TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，其含有用于检测LSPV的一对特异性引物和TaqMan探针。本发明的试剂盒检测结果特异性好，LSPV扩增曲线良好，其他相关病原未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为1.59×101copies/μL；解决了尚无LSPV检测方法的问题，对于LSPV的检测具有重要意义。
附图说明
图1为穿山甲LSPV TaqMan荧光定量PCR检测方法扩增曲线的建立。
图2为穿山甲LSPV TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性检测，图中：1代表LSPV基因组的扩增曲线；2代表其他可感染穿山甲相关病毒的扩增曲线（包括呼吸道合胞病毒A型（RSV-A）基因组、呼吸道合胞病毒B型（RSV-B）基因组、副流感病毒5型（PIV5）基因组、巴泰病毒（BATV）基因组、盖塔病毒（GETV）基因组或东阳病毒（DYPV）基因组，阴性对照）。
图3为用TaqMan荧光定量PCR检测LSPV病毒灵敏性时，LSPV病毒RNA浓度分别为1.59×105copies/μL到1.59×100copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品和阴性对照对应的扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1. 针对LSPV的VP11基因保守区设计特异性引物和探针
从GenBank上下载LSPV毒株的参考序列，根据序列比对结果，针对LSPV的VP11基因的高度保守片段，设计一对特异性引物(LSPV-F/LSPV-R，扩增的目的片段长度为915 bp)和相应的TaqMan探针（LSPV-probe）：
LSPV-F：5’- GGCATGTTGCCAGTTCTTATTC -3’ (SEQ ID NO.1)；
LSPV-R：5’- ACCTCATCCCACACTCTATCA -3’ (SEQ ID NO.2)；
LSPV-probe：5’- CCAACTATTGAGTCGATTGGTCCGTTGA-3’ (SEQ ID NO.3) ，将探针的5’端以荧光报告基团CY5标记，3’端以荧光淬灭基团BHQ2标记。
2. 穿山甲LSPV TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
按照体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书，提取LSPV RNA后反转录为cDNA为模板，采用以下引物浓度、探针浓度和反应条件。反应体系如表1所示。
表1 LSPV的TaqMan荧光定量PCR检测体系
反应条件：95℃ (预变性) 2 min；95℃（变性）15 s，60℃（退火）40 s，40个循环(PCR扩增)；在60℃延伸时收集荧光信号，报告基因设置为CY5。
3. 荧光定量检测
荧光定量检测中，对LSPV的VP11基因检测体系加入表1各种组分。各组分混合均匀后进入循环，荧光信号检测40个循环。利用荧光检测判定检测体系检测活性。利用荧光法结果判定方案，可实现对LSPV的检测。
将表1的荧光定量PCR检测体系和对应反应条件用于检测LSPV病毒，以LSPV的基因组的cDNA为模板，用所述引物进行PCR扩增目的片段。如图1所示，检测中发现LSPV病毒的检出有较高的荧光值。
根据上述所得结果，该体系和方法对检测的LSPV病毒基因组有较高荧光值，因此采用该体系进行后续检测。本检测采用20 μL体系如表1所示，但不限于此。
实施例2：对LSPV病毒的特异性检测
样品含有：丽水穿山甲病毒（LSPV）基因组、呼吸道合胞病毒A型（RSV-A）基因组、呼吸道合胞病毒B型（RSV-B）基因组、副流感病毒5型（PIV5）基因组、巴泰病毒（BATV）基因组、盖塔病毒（GETV）基因组或东阳病毒（DYPV）基因组，阴性对照。
分别提取各病毒基因组RNA后反转录为cDNA，用实施例1建立的穿山甲LSPVTaqMan荧光定量PCR检测方法进行检测，除LSPV外，其他样品均未检测到特异性扩增信号(图2)，表明实施例1所建立的检测方法具有良好的特异性。
实施例3：检测LSPV病毒灵敏度
在灵敏度检测中，将LSPV的pUC57-LSPV-VP11重组质粒（将丽水穿山甲病毒的VP11基因的目的片段连接到pUC57得到的）根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释后反转录，阳性标准品做1.59×105copies/μL到1.59×100copies/μL浓度，用实施例1建立的穿山甲LSPV TaqMan荧光定量PCR检测方法进行检测，所建立的方法其敏感性可达到1.59×101copies/μL (图3)，敏感性良好。
本实施例所得结果如图3所示，针对LSPV病毒灵敏性检测结果，所建立的方法其敏感性可达到1.59×101copies/μL，敏感性良好，可以应用于基层检测。
实施例4：待检测样品的定量检测
1. RNA模板的制备
1.1 质粒RNA模板的制备
LSPV的阳性重组质粒pUC57- LSPV-VP11由库美生物科技有限公司合成构建，将丽水穿山甲病毒的VP11基因的目的片段连接到pUC57得到的，质粒含有T7启动子区域。LSPV的VP11的RNA转录本依照T7体外转录试剂盒制备，具体各试剂组分和用量见表2。37℃孵育2h，孵育完全后加入2 μL的RNase free DNase I，37℃消化30 min，以除去残留DNA。
表2 体外转录反应体系
1.2 待检样品RNA模板的制备
利用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（诺唯赞），提取样品基因组RNA，具体方法如下：
（1）向RNase-free离心管中加入200 μL样本(如样本量不足，使用PBS或0.9% NaCl补足)，加入500 μL Buffer VL，涡旋混匀15-30 s，将混合液瞬时离心收集至管底。
（2）将FastPure RNA Columns置于2 mL收集管中，转移上述混合液至FastPureRNA Columns中，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min，弃滤液。
（3）向FastPure RNA Columns中加入600 μL Buffer RW，12,000 rpm (13,400×g)离心30 s，弃滤液。重复步骤3。空柱12,000 rpm (13,400×g)离心2 min。
（4）小心将FastPure RNA Columns转移至新的1.5 mL RNase-free收集管(试剂盒提供)中，向膜中央悬空加入30 - 50 μL的RNase-free ddH2O，室温放置1 min，12,000 rpm(13,400×g)离心1 min。
（5）弃去FastPure RNA Columns，RNA可直接用于后续检测或置于-30 ~ -15℃短期保存或置于-85 ~ -65℃长期保存。
2. cDNA模板的制备
将上述制备的RNA模板逆转录反应为cDNA模板，反应体系见表3。反应程序为：30℃反应10 min，42℃反应40 min后95℃灭活5 min，产物-20℃储存备用。
表3 逆转录反应体系
3.将阳性标准品（LSPV的阳性重组质粒pUC57- LSPV-VP11）做2.35×105copies/μL到2.35×100copies/μL系列稀释后按照上述1.1和2中的方法制备cDNA作为模板，以实施例1所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。
4.待检测样品按照上述1.2和2中的方法制备cDNA模板，以实施例1所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增。
5.根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量。若用于定性检测，则无需构建标准曲线。
Claims (4)
1. 一种检测丽水穿山甲病毒（Lishui pangolin virus，LSPV）的TaqMan荧光定量PCR引物探针组，其特征在于，包括一对特异性引物和TaqMan探针，所述的特异性引物为LSPV-F和LSPV-R，所述的LSPV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的LSPV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述的荧光报告基团为CY5，所述的荧光淬灭基团为BHQ2。
3.一种含有权利要求1所述的检测丽水穿山甲病毒的TaqMan荧光定量PCR引物探针组的试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括2×Universalprobe Mix、DEPC处理的ddH2O、阳性对照品、阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的VP11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
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Citations (5)
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-
2024
- 2024-02-01 CN CN202410137972.9A patent/CN117660702B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117660702A (zh) | 2024-03-08 |
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