CN115852055A - 一种通用型穿山甲瘟病毒荧光定量rt-pcr引物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型穿山甲瘟病毒荧光定量RT‑PCR引物及其检测方法。RT‑PCR引物为5qR1‑F：5’‑TGAGTACACTGCAGCCAACA‑3’；5qR1‑R：5’‑GGATTCATGCAACCGAC CC‑3’。本发明基于穿山甲瘟病毒5’‑UTR基因保守区序列，开发了1对快速鉴定穿山甲瘟病毒的荧光定量RT‑PCR引物，操作简单，灵敏度高。经过穿山甲咽拭子、肛拭子、肾脏、脾脏、淋巴结等组织样本的荧光定量RT‑PCR验证，具有特异性高、灵敏度高、操作简单的特点，可实际应用于穿山甲瘟病毒的特异性检测。
Description
技术领域：
本发明属于病毒鉴定领域，具体涉及一种通用型穿山甲瘟病毒荧光定量RT-PCR引物及其检测方法。
背景技术：
穿山甲瘟病毒，隶属于黄病毒科瘟病毒属(Pestivirus)，为单股正链RNA病毒。呈球形有包囊，直径为40-60纳米，大小为11.3-13.0kb，约3,900个氨基酸构成一个大的开放阅读框架(ORF)。瘟病毒主要感染猪和反刍动物，并造成动物严重的疾病，比如猪牛羊的出血性疾病、呼吸道症状等。通过下一代测序技术，已经在穿山甲、蝙蝠、竹鼠、野猪、野牛、长颈鹿和野鹿等野生动物以及节肢动物中发现瘟病毒。常见的瘟病毒包括经典猪瘟、牛病毒性腹泻和绵羊边界病等。
野生穿山甲救护失败的原因常见于应激、免疫力低下从而病原体侵入，其中穿山甲瘟病毒很可能是导致穿山甲死亡的病原体之一。目前穿山甲瘟病毒毒株种类多且每种毒株间差异较大，缺乏有效预防疫苗和特效治疗药物，因此急需建立一种穿山甲瘟病毒快速精准的检测方法，尤其是在海关检疫方面，能有效做到早发现早根除。PCR技术已成为核酸检测中广泛使用的分子生物学方法，但其存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，基于PCR技术，应用荧光定量RT-PCR策略已成为核酸检测方法的新方向
发明内容：
目前关于穿山甲瘟病毒的检测方法未有一个系统、完整的检测技术，检测的引物比较局限于某一个毒株。为了能够从含少量病毒样品中快速、高灵敏、低成本地鉴定穿山甲是否携带或感染穿山甲瘟病毒，本发明基于NCBI数据库中穿山甲瘟病毒的5’-UTR基因序列和本发明人收集的中国地区的穿山甲瘟病毒5’-UTR基因序列，开发了1对通用型、可快速鉴定穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物，其具有特异性高、灵敏度高、成本低、操作简单等特点。
本发明的通用型检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物，其包括：
5qR1-F：5’-TGAGTACACTGCAGCCAACA-3’；
5qR1-R：5’-GGATTCATGCAACCGACCC-3’
本发明的第二个目的是提供一种通用型检测穿山甲瘟病毒的试剂盒，其含有上述通用型鉴定穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物作为荧光定量RT-PCR的引物。
本发明的第三个目的是检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR方法，包括如下步骤：
提取样本总RNA，反转录合成单链cDNA，以其为模板，利用上述通用型检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物进行荧光定量RT-PCR反应，将cDNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到cDNA中穿山甲瘟病毒基因片段拷贝浓度。
所述的样本可以是活体动物的咽拭子、肛拭子、粪便等，或死亡个体的内脏组织。
优选，所述的荧光定量RT-PCR反应，其扩增体系和反应条件为：使用高效荧光定量PCR Mix(PowerUpTmSYBRTmGreen Master Mix)进行荧光定量RT-PCR扩增，扩增体系为：Mix10μL，ddH2O 1μL,模板1μL,上下游引物(2.5μM)各4μL，总体系共20μL；扩增条件为：50℃2min，95℃2min；95℃15s，58℃1min，40个循环；溶解曲线：60℃以0.5℃/s升至95℃。
本发明的荧光定量RT-PCR引物与检测方法，和现有的常规检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。
本发明基于穿山甲瘟病毒5’-UTR基因保守区序列，开发了1对快速鉴定穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物，操作简单，灵敏度高。经过穿山甲咽拭子、肛拭子、肾脏、脾脏、淋巴结等组织样本的荧光定量RT-PCR验证，具有特异性高、灵敏度高、操作简单的特点，可实际应用于穿山甲瘟病毒的特异性检测。
附图说明
图1是实施例中不同退火温度得到的5’UTR基因荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
图2是实施例中不同引物浓度得到的5’UTR基因荧光定量RT-PCR的扩增曲线图。
图3是实施例中5’UTR基因荧光定量RT-PCR标准曲线试验结果图；其中图3A中的107为2.4×107拷贝的阳性重组质粒；106为2.4×106拷贝的阳性重组质粒；105为2.4×105拷贝的阳性重组质粒；104为2.4×104拷贝的阳性重组质粒；103为2.4×103拷贝的阳性重组质粒；102为2.4×102拷贝的阳性重组质粒；图3B为扩增产物熔解曲线图；图3C为标准曲线方程图。
图4是实施例中5’UTR基因荧光定量RT-PCR的灵敏性检测结果图；其中，图4A中的1为2.4×108拷贝的阳性重组质粒；2为2.4×107拷贝的阳性重组质粒；3为2.4×106拷贝的阳性重组质粒；4为2.4×105拷贝的阳性重组质粒；5为2.4×104拷贝的阳性重组质粒；6为2.4×103拷贝的阳性重组质粒；7为2.4×102拷贝的阳性重组质粒；8为2.4×101拷贝的阳性重组质粒；图4B为常规PCR灵敏性检测结果图。
图5是实施例中5’UTR基因的特异性检测结果图；其中，1是以穿山甲瘟病毒5’UTR基因的阳性重组质粒2.4×104拷贝为模板的检测结果；2是以穿山甲源冠状病毒核酸为模板的检测结果；3是以穿山甲源细小病毒2核酸为模板的检测结果；4是阴性对照的检测结果。
图6是实施例中5’UTR基因的阳性重组质粒2.4×107拷贝的重复性检测结果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1.病毒株：穿山甲源冠状病毒(Coronavirus)、细小病毒2(Canine parvovirus 2)均由广东省科学院动物研究所野生动物疫病与免疫研究中心保存。
2.主要试剂及仪器：RNAiso Plus(生产批号：AL61152A)、逆转录试剂盒PrimeScript Tm 1st Strand cDNA Synthesei Kit(生产批号：AL91035A)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；2×GS Taq PCR Mix(生产批号：22ST11106)购自北京金莎生物科技有限公司；PowerUpTmSYBRTmGreen Master Mix(生产批号：91231257)和实时荧光定量PCR仪(QuantStudio 5Real-Time PCR Instrument)购自Thermo Fisher Scientific。
3.引物的设计与合成：在美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)下载穿山甲瘟病毒株的全基因组序列和本研究中心采集的许多样本的保守区域5’-UTR序列，通过DNAMAN软件筛选基因的保守区域5’-UTR，并使用Primer3根据穿山甲瘟病毒5’-UTR基因片段设计出3对特异性引物(详见表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。通过对引物的浓度与退火温度优化，最终选择5qR1-F、5qR1-R，并进行以下实验。
表1：引物序列表
4.阳性质粒的构建：将NCBI GenBank中公布的穿山甲瘟病毒(登录号:ON843279)5’-UTR基因部分序列(引物5qR1-F(5’-TGAGTACACTGCAGCCAACA-3’)、引物5qR1-R(5’-GGATTCATGCAACCGACCC-3’能扩增出的)送生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因片段，克隆到pUC57载体中，命名为pUC57-GDPV-5UTR。
5.病毒核酸的提取：采用RNAiso Plus分别提取穿山甲样品中的瘟病毒(Guangdong pangolin Pestivirus)、冠状病毒(Coronavirus)和细小病毒(Canineparvovirus 2)的核酸，按说明书操作，RNA保存在-80℃。提取的RNA根据PrimeScript Tm1st Strand cDNA Synthesei Kit说明书操作，使用随机引物，逆转录为cDNA，保存在-20℃。
6.RT-PCR反应条件优化：采用20μL反应体系，退火温度优化：将退火温度分成4组，分别为54℃，56℃，58℃，60℃，并以RNase free water为阴性对照。引物浓度优化：将引物浓度分别稀释到10μmol/L，体系内引物浓度从100-500μmol/L进行筛选，并以RNase freewater为阴性对照。
7.荧光定量RT-PCR扩增：
使用高效荧光定量RT-PCR Mix(PowerUpTmSYBRTmGreen Master Mix)进行荧光定量RT-PCR扩增，扩增体系为：
荧光定量RT-PCR程序如下：
8、通过对不同退火温度(Tm)扩增曲线的Ct值进行比较，结果如图1所示，58℃时的Ct值为27.656，是4个退火温度中的最小值。因此，退火温度为58℃时，pUC57-GDPV-5UTR阳性对照质粒的扩增效率最高。
9、通过对100、200、300、400、500nmol/L 5个不同终浓度的上下游引物的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化上下游引物浓度。结果如图2所示，上下游引物浓度为500nmol/L时，pUC57-GDPV-5UTR阳性对照质粒的扩增效率最高，Ct值最低，所以上下游引物的最佳浓度为500nmol/L。
10、标准曲线的建立和灵敏性试验：将步骤4中测定浓度和纯度后的阳性重组质粒pUC57-GDPV-5UTR稀释到标定的拷贝数(2.4×108copies/μL)，按10倍倍比稀释到2.4×103copies/μL，每个模板浓度作3个平行样。根据步骤7建立荧光定量RT-PCR的反应体系和反应参数进行荧光定量RT-PCR扩增，获得荧光扩增曲线并绘制标准曲线。通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，并最终以Ct值为纵坐标，拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线，对整个RT-PCR体系的灵敏性进行评价。结果显示，pUC57-GDPV-5UTR阳性对照质粒荧光定量RT-PCR扩增，获得了扩增曲线，如图3所示，2.4×107copies/μL～2.4×103copies/μL，呈现出较高的线性关系。相关系数(R2)为0.9994，标准曲线方程为：y＝-3.8796×X+41.45。本试验建立的荧光定量RT-PCR对穿山甲瘟病毒阳性重组质粒的扩增产物熔解曲线显示，在熔解温度Tm为83.5℃±0.1℃时出现了唯一的特异性峰，无引物二聚体和非特异性扩增产物。
11、将标准质粒分别稀释为2.4×108copies/μL～2.4×101copies/μL，组内重复2次，以最低检测拷贝数为敏感性试验结果，且与常规RT-PCR一同检测，比较两者间敏感程度。结果显示，实时荧光定量RT-PCR检测病毒的最低浓度为2.4×102copies/μL(图4A)，而常规RT-PCR检测病毒的最低浓度为2.4×103copies/μL(图4B)。本研究建立的SYBR GreenI单重实时荧光定量RT-PCR敏感性较高，实时荧光定量RT-PCR的敏感性是常规RT-PCR的10倍。
12、特异性检测：图5为特异性试验结果图，其中1为广东省穿山甲瘟病毒2.4×104copies/μL阳性重组质粒；2为穿山甲源冠状病毒；3为细小病毒2；4为RNase freewater。按优化好的反应体系和条件(步骤7)进行SYBR Green I单重实时荧光定量RT-PCR，比较该检测方法与穿山甲其他病毒有无交叉反应。结果如图5所示，只有pUC57-GDPV-5UTR阳性重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余均为阴性，证明该方法特异性较好。
13、重复性检测：采用2.4×107copies/μL拷贝的阳性质粒pUC57-GDPV-5UTR为模板，按步骤7进行荧光定量RT-PCR试验，重复检测三次分析其稳定性。结果如图6所示，曲线1至曲线3检测结果基本一致，在相同位置均可观察到相对应得荧光曲线，说明荧光定量RT-PCR方法重复性良好。
14、临床样品的检测
采用筛选出的引物(5qR1-F、5qR1-R)对142份穿山甲瘟病毒样品(其中包括29份已知穿山甲瘟病毒阳性样品)按照步骤7的体系和条件进行检测，无菌水做阴性对照。临床样品的检测结果显示，142份样品中有29份样品出现扩增曲线，均为阳性样品，其余均呈现阴性。
表2：样品信息表
Claims (6)
1.一种通用型检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物，其特征在于，包括：
5qR1-F：5’-TGAGTACACTGCAGCCAACA-3’；
5qR1-R：5’-GGATTCATGCAACCGACCC-3’。
2.一种通用型检测穿山甲瘟病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的通用型鉴定穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物作为荧光定量RT-PCR的引物。
3.一种检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取样本总RNA，反转录合成单链cDNA，以其为模板，利用权利要求1所述的通用型检测穿山甲瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物进行荧光定量RT-PCR反应，将cDNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到cDNA中穿山甲瘟病毒基因片段拷贝浓度。
4.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的样本是活体动物的咽拭子、肛拭子、粪便，或死亡个体的内脏组织。
5.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的荧光定量RT-PCR反应，其扩增体系为：Mix 10μL，ddH2O 7μL,模板1μL,上、下游引物(500nM)各1μL，总体系共20μL。
6.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的荧光定量RT-PCR反应，其扩增条件为：50℃2min，95℃2min；95℃15s，58℃1min，40个循环；溶解曲线：60℃以0.5℃/s升至95℃。
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