CN117265186A - 一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法。本发明以穿山甲东阳病毒检测的5'UTR区域作为目标基因，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的检测方法。本发明的穿山甲东阳病毒检测方法扩增曲线良好，特异性强，与除穿山甲东阳病毒之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，最低检出限度为1.86×101copies/μL；本发明方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法。
背景技术
东阳病毒(Dong Yang pangolin virus，DYPV)是一种新型的包膜RNA瘟病毒，其具有高度可变的单链正义RNA基因组，包含一个大的开放阅读框(ORF)，编码一个长度约为3900个氨基酸的多蛋白。该病毒可能引发亚临床症状或引起一系列临床症状，包括急性腹泻、急性出血性综合征、急性致命性疾病等消耗性疾病典型病症。有研究显示，感染DYPV的穿山甲出现肝肺充血、皮肤病变、肝细胞的癞核、脾脏淋巴细胞固缩、肝板坏死和肾小球坏死等病理变化。虽然DYPV暂未对我国畜牧业及林业造成严重影响，相关研究及报道也较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，避免DYPV呈现爆发性流行、危害动物健康造成严重损失。因此，建立一种灵敏、快速、准确的方法来进一步对DYPV进行调查、诊断、预防是非常有必要的。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，该方法可用于DYPV快速检测，应用前景广阔。
本发明的第一个目的是提供检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组，包括一对引物F、R和探针P，所述的引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，探针P的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
优选，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组的试剂盒。
优选，所述的试剂盒还包括：荧光定量PCR预混液2×TaqMan Universal probeMix、阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的5'UTR基因的重组质粒，所述的阴性对照为ddH2O。
本发明还提供所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
S1.提取待检样品的RNA并反转录为cDNA；
S2.利用所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S3.反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有穿山甲东阳病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线(有特异性扩增反应)，则待检样品中含有穿山甲东阳病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲东阳病毒。
优选，所述的步骤S2的荧光定量PCR扩增的反应体系为20μL，包含：2×Taq ManUniversal probe Mix 10μL、10μM的引物F1.0μL、10μM的引物R1.0μL、10μM的探针P 0.4μL、cDNA模板1.0μL，加ddH2O补足至20μL；所述的荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。
本发明具有以下有益效果：
本发明以DYPV的5'UTR基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR较易扩增，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对DYPV的5'UTR区域为靶基因的特异性区域，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量等优势。这些优势使得本发明开发的基于TaqMan荧光定量PCR检测方法方便用于实验室对DYPV的快速检测和诊断。
附图说明
图1为对重组质粒pUC57-5'UTR进行TaqMan荧光定量PCR敏感性检测的扩增曲线图。
图2为基于穿山甲TaqMan荧光定量PCR用荧光定量探针法检测DYPV灵敏性时，DYPVRNA浓度105、104、103、102、101、100copies/μL和阴性对照对应的灵敏度检测结果。
图3为基于TaqMan荧光定量PCR、用荧光定量探针法检测DYPV的扩增曲线和其他病原(包括丽水病毒(Lishui pangolin virus，LSPV)基因组、副流感病毒5型(Parainfluenzavirus5，PIV5)、穿山甲呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV-A)基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒B(Respiratory syncytial virus B，RSV-B)基因组、盖塔病毒(Getah virus，GETV)基因组、巴泰病毒(Batai virus，BATV)基因组)和阴性对照对应的特异性检测图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例提供一种穿山甲TaqMan荧光定量PCR检测方法，通过以下技术方案实现：
(1)荧光定量PCR反应液：主要成分是2×TaqMan Universal probe Mix。
(2)引物和探针：应用oligo 6.0软件设计DYPV-5'UTR区域特异性引物和探针，上游引物F、下游引物R和探针P分别是按下述碱基序列合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)的DNA片段：
引物F:5’-CCGCTTCATACACATTGGACTA-3’(SEQ ID NO.1)；
引物R:5’-CTCGCATATTATCAGGGCTAGTG-3’(SEQ ID NO.2)；
探针P:FAM-5’-TGAAGGGCGAAAGGATGTTAGCCA-3’(SEQ ID NO.3)-BHQ1。
(3)阳性对照：该对照为含有目的基因片段的重组质粒pUC57-5'UTR，由库美生物技术有限公司构建。其方法是：将利用上述引物F和R对DYPV进行扩增的扩增产物克隆至pUC57转化DH5α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，命名为pUC57-5'UTR，该质粒含东阳病毒412bp基因片段。
(4)阴性对照，该对照为去离子水(ddH2O)。
操作程序：
(1)被检标本RNA提取：参照基因组RNA提取试剂盒说明书提取RNA(诺唯赞，北京)，并反转录成cDNA，-20℃保存备用。
(2)荧光定量PCR反应体系：
将2×Taq Man Universal probe Mix 10μL、10μM的引物F1.0μL、10μM的引物R1.0μL、10μM的探针P 0.4μL、cDNA模板1.0μL，加ddH2O 6.6μL(共20μL反应体系)混匀后稍微低速离心，进行荧光PCR反应操作。
(3)TaqMan荧光定量PCR反应参数：
所述的反应参数为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。
如图1所示，以构建的目的基因质粒pUC57-5'UTR做模板：其扩增曲线见图1。
如图2所示，针对DYPV灵敏性检测结果，在灵敏度检测中，将重组质粒pUC57-5'UTR根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，阳性标准品做1.86×105copies/μL到1.86×100copies/μL浓度，用上述建立的穿山甲DYPV TaqMan荧光定量方法进行检测，所建立的方法其敏感性可达到1.86×101copies/μL，敏感性良好，可以应用于基层检测。
如图3所示，进行特异性鉴定分析，有DYPV组表现出强烈的荧光信号，有典型荧光扩增曲线；检测其他相关可感染穿山甲病毒例如丽水病毒(Lishui pangolin virus，LSPV)基因组、副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5，PIV5)、穿山甲呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV-A)基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒B(Respiratorysyncytial virus B，RSV-B)基因组、盖塔病毒(Getah virus，GETV)基因组、巴泰病毒(Batai virus，BATV)基因组的核酸均未见信号扩增，该测试显示上述建立的穿山甲DYPVTaqMan荧光定量方法特异性较好。
实施例2：待检测样品的定量检测
1.待检样品RNA提取：参照基因组RNA提取试剂盒说明书提取RNA(诺唯赞，北京)，并反转录成cDNA，-20℃保存备用。
2.以特异性引物和探针进行TaqMan荧光定量PCR：将2×Taq Man Universalprobe Mix10μL、10μM的引物F1.0μL、10μM的引物R1.0μL、10μM的探针P 0.4μL、cDNA模板1.0μL，加ddH2O 6.6μL(共20μL反应体系)混匀后稍微低速离心，进行荧光PCR反应操作。反应参数为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。
3.检测待检样品携带的DYPV 5'UTR基因:运行上述的反应参数，检出穿山甲血液或蜱虫血液中含有的DYPV 5'UTR基因，通过Bio-Rad CFX Manager 3.1(Model No.CFXConnect Optics Module)得到荧光定量PCR扩增曲线，与阳性对照(重组质粒pUC57-5'UTR)的扩增曲线比对，实现DYPV的快速检测和诊断，完成定性检测。
4.将阳性标准品做1.86×105copies/μL到1.86×100copies/μL系列稀释后作为模板，以步骤2所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增，建立标准曲线。
5.待检样品按步骤1制备cDNA模板，以步骤2所述的特异性引物、探针、反应体系和反应条件进行荧光定量PCR扩增.
6.根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量。
Claims (7)
1.检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组，其特征在于，包括一对引物F、R和探针P，所述的引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述的探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，探针P的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
3.一种含有权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：荧光定量PCR预混液2×TaqMan Universal probe Mix、阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照为含有穿山甲东阳病毒的5'UTR基因的重组质粒，所述的阴性对照为ddH2O。
5.权利要求1所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
6.一种非疾病诊断目的的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待检样品的RNA并反转录为cDNA；
S2.利用所述的检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S3.反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有穿山甲东阳病毒；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线，则待检样品中含有穿山甲东阳病毒；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲东阳病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2的荧光定量PCR扩增的反应体系为20μL，包含：2×Taq Man Universal probe Mix 10μL、10μM的引物F1.0μL、10μM的引物R1.0μL、10μM的探针P 0.4μL、cDNA模板1.0μL，加ddH2O补足至20μL；所述的荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min，40个循环：变性95℃15s、退火60℃40s延伸，并在60℃收集荧光信号。
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Citations (2)
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| CN115852055A (zh) * | 2022-12-05 | 2023-03-28 | 广东省科学院动物研究所 | 一种通用型穿山甲瘟病毒荧光定量rt-pcr引物及其检测方法 |
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2023
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| Title |
|---|
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN117660702A (zh) * | 2024-02-01 | 2024-03-08 | 广东省林业科学研究院 | 检测丽水穿山甲病毒的荧光定量pcr引物组及方法 |
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