CN111118217A - 检测羊口疮病毒的实时荧光rpa引物和探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病菌检测技术领域，具体公开一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。所述引物和探针的序列为：上游引物：5′‑GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG‑3′；下游引物：5′‑AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT‑3′；所述探针的序列为：5′–CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGCT‑THF‑CTCATCGTGGACGACAC‑3′。本发明引物和探针的组合用于对羊口疮病毒的实时荧光RPA检测，兼具特异性高、敏感性好、准确性高以及耗时短的优点。

Description

检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用 方法

技术领域

本发明涉及病菌检测技术领域，尤其涉及一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

羊口疮又称传染性脓疱，是由羊口疮病毒(ORFV)引起的一种急性接触性传染病，易感于羔羊。羊口疮不仅会交叉传染给其他牲畜，也会导致人的感染，是一种人畜共患病。该病以羊口唇、舌、鼻、乳房等处形成水疱、脓疱、丘疹、溃疡并干结形成疣状厚痂为主要特征。ORFV可以在体内长期存活，感染动物持续排毒。羊口疮对国内外绵羊和山羊养殖业造成了巨大的经济损失，早期、快速和有效诊断是预防和控制羊口疮疫情所必须的重要手段。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高的核酸等温扩增技术，可在短时间内完成扩增检测，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的监测。

ORFV的传统检测方法，如病毒分离、抗原捕获ELISA等，存在费时费力、灵敏性低、对操作人员和环境要求高等缺点，无法在基层广泛开展。目前对ORFV的检测，主要依赖于分子检测方法，如PCR、real-time PCR和LAMP方法。RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法主要应用于装备良好的实验室，需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外现场检测。目前，real-time PCR方法在已经得到了应用广泛，能够在几小时内给出检测结果，但是该方法需要昂贵的荧光PCR设备，同时临床样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室，需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的羊传染性脓疱病疫情采取进一步的有效措施。因此，若能建立ORFV的RPA检测方法，则对预防和控制羊口疮病疫情具有重要意义。

但是RPA检测方法对引物和探针的要求较为苛刻，且ORFV的临床症状及病变特征与山羊痘病毒、口蹄疫病毒O型、A型和亚洲I型、小反刍兽疫病毒和羊流感病毒相似，仅通过临床症状和病理变化中非常容易误诊，造成较大的经济损失或者疫情的扩散等，因此快速、敏感、特异性强的检测方法对于该病防控十分重要。

发明内容

针对现有羊口疮病毒(ORFV)的检测方法存在检测方法复杂、耗时长、检测条件要求苛刻及检测效率低的问题，本发明提供一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5＇-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3＇；

下游引物：5＇-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3＇；

所述探针的序列为：5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGCT-THF-CTCATCGTGGACGACAC-3＇。

优选的，在所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。

优选的，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGC/FAM-dT/-THF-C/BHQ1-dT/CATCGTGGACGACAC-C3-spacer-3＇。

本发明还提供一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒。该试剂盒包含上述引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

本发明提供了所述试剂盒的使用方法。该使用方法的具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

优选的，所述RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

优选的，所述RPA扩增体系的扩增条件为：37-47℃，15-20min。

优选的，所述RPA扩增体系的扩增条件为：39℃，15min。

相对于现有技术，本发明提供的检测羊口疮病毒(ORFV)的实时荧光RPA引物和探针可以特异性的结合到羊口疮病毒的DNA上，准确检测出羊口疮病毒，而与山羊痘病毒、口蹄疫病毒O型、A型和亚洲I型、小反刍兽疫病毒和羊流感病毒均无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到10²拷贝/μL，检测准确率为100％，用于实时荧光RPA检测方法中，恒温条件下仅需要15-20min即可完成反应，3-12min之内即可出现荧光信号，对反应条件和设备要求低，可以直接提取感染组织的DNA进行检测，无需对病毒进行进一步分离和培养，因此，上述引物和探针的组合用于羊口疮病毒的实时荧光RPA检测，兼具特异性高、敏感性好以及准确性高的优点，为羊传染性脓疱的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障。

本发明的实时荧光RPA扩增方法能够在疫情现场进行ORFV检测操作，对于羊传染性脓疱疫情的防控极其重要。另外，本发明建立的ORFV实时荧光RPA方法，结合具有荧光检测功能的便携式等温扩增仪，可组建Mccp快速检测平台，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖，在基层兽医部门，尤其在野外及疫情现场的羊传染性脓疱疫情快速诊断中具有极大的应用潜力。

附图说明

图1是本发明实施例1中的实时荧光RPA方法的特异性检测图谱；其中，1为检测的ORFV的基因组DNA，2-7分别为检测的小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型、山羊痘病毒、羊流感病毒的基因组DNA或cDNA；

图2是本发明实施例1中的实时荧光RPA方法的敏感性检测图谱；其中，1-8分别代表模板的拷贝数为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL和10⁰拷贝/μL。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1材料与方法

1.1.1病原和临床样品

羊口疮病毒(HCE疫苗株)和山羊痘病毒(CVCC AV41株)的基因组DNA，口蹄疫病毒O、A和亚洲I型(来自商业化口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒)、小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/1疫苗株)、羊流感病毒(HB03株)基因组cDNA；均保存于本实验室；

31份羊口唇部皮肤结痂组织样品，采自河北省不同地区具有疑似羊口疮症状的羊。

1.1.2主要试剂

实时荧光RPA核酸扩增检测试剂盒，购自杭州众测生物科技有限公司；

病毒DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；

Premix Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3引物和探针的设计

以ORFV的B2L基因(HQ694772.1)作为实时荧光RPA方法的靶基因，根据GenBank中的序列，设计实时荧光RPA的引物(ORFV-RPA-F、ORFV-RPA-R)和exo探针(ORFV-RPA-P)，扩增片段大小为139bp，引物和探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

1.1.4临床样品基因组提取

将羊口唇部皮肤结痂组织样品，按照1:10比例加入无菌PBS(pH7.4)，充分研磨，制备匀浆液，4℃，12000g离心10min，弃上清，沉淀用于基因组提取；

根据基因组DNA提取试剂盒的使用说明，提取上述临床样品的基因组，并溶解于50μL无核酸酶的ddH₂O中，使用ND-2000c核酸浓度测定仪(NanoDrop，Wilmington，USA)进行所提取核酸的浓度测定，并将提取的基因组DNA保存于-80℃备用。

1.1.5实时荧光RPA检测方法

使用检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒对病原进行检测，反应体系为：

反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀5-6次，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中39℃反应20min，进行扩增检测。

1.2方法考察

1.2.1引物特异性检测

以羊口疮病毒、山羊痘病毒的基因组DNA；口蹄疫病毒O型、A型和亚洲I型、小反刍兽疫病毒和羊流感病毒cDNA为模板，按照1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，反应重复5次。

如图1所示，所建立的实时荧光RPA方法对羊口疮病毒(ORFV)的基因组DNA呈现特异性扩增，而对山羊痘病毒、口蹄疫病毒O型、A型和亚洲I型、小反刍兽疫病毒和羊流感病毒的基因组DNA/cDNA没有任何扩增，5次重复结果一致，表明所建立的实时荧光RPA方法具有良好的特异性。

1.2.2引物灵敏性检测

将ORFV的靶DNA进行10倍倍比稀释，使其浓度为1.0×10⁷-1.0×10⁰拷贝/μL之间，取1μL不同浓度的DNA作为模板，按照1.1.5中的实时荧光RPA方法进行实时荧光RPA扩增，每个浓度重复5次，以确认该方法的检出限。

结果如图2所示，对于浓度在1.0×10⁷拷贝/μL到1.0×10²拷贝/μL之间的靶DNA，5次检测均可检出；浓度为1.0×10¹拷贝/μL和1.0×10⁰拷贝/μL的靶DNA，5次检测均未检出，五次重复试验结果一致。表明，所建立的实时荧光RPA方法的检出限为1.0×10²拷贝/μL。

1.2.3引物的重复性和稳定性检测

以1.0×10⁷-1.0×10⁰拷贝/μL的ORFV靶DNA为模板，根据1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，每个浓度进行8次重复性扩增，根据起峰时间(TT值)计算组内变异系数；

以1.0×10⁷-1.0×10²拷贝/μL的ORFV靶DNA为模板，根据1.1.5中的实时荧光RPA方法进行扩增，将上述浓度进行3次重复扩增检测，每个浓度3天检测1次，根据TT值计算组间变异系数，以验证该方法的重复性和稳定性。

上述检测结果如表2所示：

表2实时荧光RPA的重复性试验结果

由表2可知，组内和组间变异系数均小于3％，表明建立的ORFV实时荧光RPA方法稳定，具有良好的重复性。

实施例2

一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3′；

下游引物：5′-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3′；

所述探针的序列为：5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGC/FAM-dT/-THF-C/BHQ1-dT/CATCGTGGACGACAC-C3-spacer-3＇。

检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

RPA反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀5次，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中37℃反应15min，进行扩增检测。

对实施例1中提取的31份羊口唇部皮肤结痂组织样品的基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。

另外通过与常规实时荧光PCR检测方法同时进行检测，来验证本发明的实时荧光RPA方法的准确性。

其中常规实时荧光PCR方法进行检测所用的引物和探针为：

上游引物：5′-CAGCAGAGCCGCGTGAA-3＇；

下游引物：5＇-CATGAACCGCTACAACACCTTCT-3＇；

探针：5＇-FAM-CACCTTCGGCTCCAC-MGB-3′。

实时荧光PCR反应体系和条件为：

Premix Ex Taq12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，探针(10μmol/L)1.0μL，DNA模板2μL，ddH₂O补足至25μL；反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40cycles。

按照上述方法对31份羊口唇部皮肤结痂组织样品进行检测，检测结果为：

实时荧光RPA方法检出20份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阳性，11份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阴性，该结果与实时荧光PCR方法的检测结果一致。实时荧光RPA方法能够在12min内即可获得阳性结果，而实时荧光PCR则需要47min才能获得阳性结果。

实施例3

一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3′；

下游引物：5′-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3′；

所述探针的序列为：5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGC/FAM-dT/-THF-C/BHQ1-dT/CATCGTGGACGACAC-C3-spacer-3＇。

检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

RPA反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀6次，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中39℃反应15min，进行扩增检测。

对实施例1中提取的31份羊口唇部皮肤结痂组织样品的基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。

按照上述方法对31份羊口唇部皮肤结痂组织样品进行检测，检测结果为：

实时荧光RPA方法检出20份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阳性，11份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阴性，且该实时荧光RPA方法能够在3min内即可获得阳性结果。

实施例4

一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，所述引物的序列为：

上游引物：5′-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3′；

下游引物：5′-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3′；

所述探针的序列为：5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGC/FAM-dT/-THF-C/BHQ1-dT/CATCGTGGACGACAC-C3-spacer-3＇。

检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

上述试剂盒的使用方法为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

其中，重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：

RPA反应体系中的各组分分别加入反应管中混合，在反应开始之前在反应管盖上加入280mM的醋酸镁，盖上管盖，上下颠倒混匀5次，瞬时离心并涡旋后放入Genie III中47℃反应20min，进行扩增检测。

对实施例1中提取的31份羊口唇部皮肤结痂组织样品的基因组DNA分别通过本实施例中的实时荧光RPA方法进行检测。

按照上述方法对31份羊口唇部皮肤结痂组织样品进行检测，检测结果为：

实时荧光RPA方法检出20份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阳性，11份羊口唇部皮肤结痂组织样品呈ORFV阴性，且该实时荧光RPA方法能够在5min内即可获得阳性结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 石家庄海关技术中心

<120> 检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针、试剂盒及其使用方法

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> ORFV-RPA-F

<400> 1

gtggacatgt ccgtgcgcaa gttcgtggtg 30

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> ORFV-RPA-R

<400> 2

aggcgtggta gcggtagtgc gtgccgtcga ggtt 34

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> ORFV-RPA-P

<400> 3

cggccgggac gacgccgcga acaacactaa gctctcatcg tggacgacac 50

<210> 4

<211> 1137

<212> DNA

<213> HQ694772.1

<400> 4

atgtggccgt tctcctccat ccccgtgggc gccgactgcc gcgtcgttga gacgctgccc 60

gcagaggtgg cgtccctggc gcagggcaac atgagcaccc tcgactgctt caccgccatc 120

gccgagtccg cgaagaagtt tttgtacatc tgcagcttct gctgcaacct aagctccacc 180

aaggagggcg tcgacgtcaa ggacaagctc tgcacgctcg ccaaggaggg cgtagacgtc 240

acgctgctcg tggacgtgca gagcaaggac aaggacgcgg acgagctgcg cgaggcgggc 300

gtcaactact acaaagtcaa ggtgtccacg cgggaaggcg tcggcaacct tctcggcagc 360

ttctggattt cggacgccgg gcactggtac gtgggcagcg cctcgctcac gggcgggtcc 420

gtgtccacca tcaagaacct cgggctctac tccaccaaca agcacctggc ctgggacctc 480

atgaaccgct acaacacttt ttactccatg atcgtggagc cgaaggtgcc gttcacgcgg 540

ctctgctgcg ccatcgtcac gcccacagcc actaacttcc accttaacca ctccgggggc 600

ggcgtattct tctcggactc gccggagcgc ttcctaggct tctaccgcac gctcgacgag 660

gacctcgtgc tgcaccgcat cgagaacgcc aagaacagca ttgacctctc gctgctctcg 720

atggtgccgg tgatcaagca cgccagcgcc gtggagtact ggccgcagat cattgacgcg 780

ctgctgcgcg cggccatcaa ccgcggcgtg cgcgtgcgcg tgatcattac tgagtggaag 840

aacgcggacc cgctttcggt atcagccgcg cgcagcctcg acgactttgg tgtcggcagc 900

gtggacatgt ccgtgcgcaa gttcgtggta cccggccggg acgacgccgc gaacaacact 960

aagctgctca tcgtggacga caccttcgcg cacctcacgg tcgccaacct cgacggcacg 1020

cactaccgct accacgcctt cgtgagcgtg aacgccgaga agggcgacat cgtcaaggac 1080

ctgtccgcgg tcttcgagcg ggactggcgc tcggagttct gcaaaccaat aaattaa 1137

Claims (9)

1.一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：

上游引物：5′-GTGGACATGTCCGTGCGCAAGTTCGTGGTG-3′；

下游引物：5′-AGGCGTGGTAGCGGTAGTGCGTGCCGTCGAGGTT-3′；

所述探针的序列为：5′–CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGCT-THF-CTCATCGTGGACGACAC-3′。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：在所述探针序列中THF的5′端一侧与其最接近的T碱基上标记荧光基团，THF的3′端一侧与其最接近的T碱基上标记淬灭基团；对所述探针序列的3′末端进行封闭修饰。

3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1，所述封闭修饰为C3-spacer修饰；经过所述标记和修饰的探针为5′-CGGCCGGGACGACGCCGCGAACAACACTAAGC/FAM-dT/-THF-C/BHQ1-dT/CATCGTGGACGACAC-C3-spacer-3′。

4.一种检测羊口疮病毒的实时荧光RPA试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RPA冻干粉和去离子水。

6.权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：具体操作为：提取待测样品的基因组为模板，用所述试剂盒进行RPA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

7.如权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系包括以下试剂及用量：

8.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系的扩增条件为：37-47℃，15-20min。

9.如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系的扩增条件为：39℃，15min。

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