CN113005229A - 一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用 - Google Patents
一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用。所述检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针中，上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，下游引物的序列如SEQIDNO:2所示，探针的序列如SEQIDNO:3所示。利用本发明的引物和探针的组合，可实现对鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RAA检测，该检测方法兼具特异性高、灵敏度好以及准确高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用。
背景技术
传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirous，IBV)引起的一种鸡的呼吸系统疾病，是一种常见的接触性、急性呼吸道疫病。患有该疫病的鸡会出现咳嗽、打喷嚏、产蛋量和产蛋品质下降的症状，给养殖业带来较大的经济损失。IBV的血清型较多，并且不同的血清型之间的交叉保护性基本没有或者十分微弱，容易造成免疫失败，给IB的防治带来极大的困难。同时，IB与多种禽类呼吸道疫病如传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis)、禽流感(Avianinfluenza)、鸡新城疫(Newcastle Disease)等呼吸道症状相似，导致临床诊断比较困难，延误最佳治疗时机，导致治疗失败。传统PCR方法中需要琼脂糖凝胶电泳观察结果，存在灵敏度不高、耗时长、需使用致癌的EB染料等弊端。
发明内容
针对现有传染性支气管炎诊断过程存在的上述问题，本发明提供一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用，利用该检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针可在恒温条件下快速检测出传染性支气管炎病毒，且具有特异性好、灵敏度和准确度高的优势，为快速、简便且准确诊断出IB提供了基础。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′(SEQIDNO:1)；
下游引物：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′(SEQID NO:2)；
所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGCTGC(去除碱基修饰THF)TAAGGGTGCTGATGTA-3′(SEQID NO:3)。
相对于现有技术，本发明提供的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，可以特异性的结合到鸡传染性支气管炎病毒的cDNA上，准确检测出鸡传染性支气管炎病毒，且与鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和禽流感病毒等无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，最低检测限能达到10拷贝/μL(3.18×10-9ng/μL)，能实现对鸡传染性支气管炎疾病的早期诊断和实时监测，且检测准确度高、用时短，在37℃下进行重组酶介导等温核酸扩增，仅需要20min即可进行对检测结果的判断，对反应条件和设备要求低。因此，上述引物和探针的组合，对鸡传染性支气管炎病毒进行检测，兼具特异性高、灵敏度好以及准确高效的优点，为鸡传染性支气管炎病毒的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障。
优选的，所述探针上标记有荧光基团和淬灭基团。
优选的，标记所述荧光基团和所述淬灭基团的所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′。
优选的，对所述探针的3′端进行C3封闭。
本发明还提供一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，该试剂盒包含所述的引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。
本发明还提供了利用所述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，具体检测方法为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
利用上述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，具有耗时短、反应条件简单、反应结果直观，可实现对鸡传染性支气管炎病毒快速检测。
优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：
优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37-41℃，20-25min。
优选的，所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37℃，20min。
附图说明
图1是本发明实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法在不同温度条件下检测到荧光值随扩增时间变化的曲线图；
图2是本发明实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法对IBV、NDV、AIV和ILTV进行检测得到的扩增曲线图；其中，1、IBV，2、NDV，3、AIV，4、ILTV，5、蒸馏水；
图3是本发明实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法在不同浓度的模板下获得的扩增曲线图；其中，1、蒸馏水，2、100拷贝/μL，3、101拷贝/μL，4、102拷贝/μL，5、103拷贝/μL，6、104拷贝/μL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、材料与方法
1.1、DNA/RNA样本的提取及保存
鸡传染性支气管炎病毒IBV(AV1511)和鸡传染性喉气管炎病毒ILTV(AV195)由中国兽医药品监察所提供；禽流感病毒AIV和鸡新城疫病毒NDV均为本实验室临床检测后保存。
病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。
2、引物和探针的设计
根据IBV基因组中保守稳定的NA基因序列(Sequence ID:HM159258.1)，设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由上海生工生物工程有限公司合成。
表1引物和探针
1.3、病毒DNA/RNA的提取
按照天根病毒DNA/RNA提取试剂盒使用说明书分别提取IBV、AIV、NDV和ILTV的DNA/RNA；对62份临床疑似传染性支气管炎病鸡的咽拭子样本提取病毒DNA/RNA，以供后续检测。
1.4、用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法的建立
上述试剂盒包括IBV-RAA-F、BV-RAA-R、IBV-T、荧光基础缓冲液(VI缓冲液)、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。
提取待测病毒的基因组为模板，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增(RFQ-RT-RAA)，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
进行重组酶介导等温核酸扩增的体系包括以下试剂及用量：
其中，280mM的醋酸镁在进行扩增前再加入反应体系中。
将上述扩增体系放入恒温核酸扩增仪中混匀，混匀后，立即取出后放入RAA恒温荧光检测仪(江苏奇天生物科技有限公司)中进行扩增反应。反应过程中收集FAM信号。
1.5、检测鸡传染性支气管炎病毒的方法的优化
按照上述重组酶介导等温核酸扩增体系(RFQ-RT-RAA反应体系)，对反应温度和时间进行优化，将RAA恒温荧光检测仪的温度分别设置为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，反应时间设置为25min，按照最短时间检测到荧光值最高为最佳反应条件。
观察反应结果，如图1所示，其中在37℃的反应条件下荧光值最佳，20min时反应效率最高。故该RFQ-RT-RAA检测的最优条件为37℃反应20min。
1.6、标准品的制备
通过常规PCR扩增得到NA基因片段，常规PCR扩增的引物序列如表2所示，常规PCR反应体系为：
，其中，IBV-PCR-F的序列为：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCA-3′(SEQID NO:4)；IBV-PCR-R的序列为：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAG-3′(SEQID NO:5)。
常规PCR反应的条件为：94℃5min；94℃变性45s；53℃退火45s；72℃延伸60s，35个循环扩增；72℃延伸10min，4℃保存。
对上述常规PCR扩增得到的产物进行胶回收，得到的回收产物通过重组的方法连接到T-Vector PmdTM20质粒(Takara公司)中，通过蓝白筛选的方法选出含有目的基因片段的质粒的菌斑，并将质粒提取后进行测序(生工生物工程股份有限公司)。
根据摩尔定律计算单位体积质粒所含DNA拷贝数。
质粒拷贝数(拷贝/L)＝[质粒浓度(g.μL-1)×6.02×1023]/[总片段长度(bp)×660g/mol]
总片段长＝载体长度(bp)+片段长度(bp)
通过10倍稀释法，将质粒浓度稀释为108-100拷贝/μL，并保存。
1.7、特异性验证
用引物IBV-RAA-F、BV-RAA-R和探针IBV-T，通过上述优化的RFQ-RT-RAA检测方法对IBV、NDV、AIV、ILTV的DNA/RNA进行检测，验证该方法的特异性，并设置蒸馏水作阴性对照。
检测结果如图2所示，只有模板为IBV的DNA的条件下，才能监测到明显的荧光信号。即上述RFQ-RT-RAA检测方法对IBV表现出高度的特异性。
1.8、引物的灵敏度检测
将1.6中得到包含IBV目的基因片段的质粒依次稀释成104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL和100拷贝/μL，用1.4中建立的RFQ-RT-RAA检测方法，以上述浓度的质粒为模板进行检测，并以蒸馏水为阴性对照。
检测结果如图3所示，当模板为10拷贝/μL时，仍然可以观察到明显的荧光扩增曲线，结果显示为阳性，证明上述引物及RFQ-RT-RAA检测方法的灵敏度可达到10拷贝/μL。
1.9、准确度验证
采用上述优化后的RFQ-RT-RAA方法，以IBV-RAA-F、BV-RAA-R和IBV-T为引物和探针，以1.3中提取的62份临床疑似传染性支气管炎病鸡的咽拭子样本的DNA/RNA为模板，进行病毒检测。并同时采用1.6中的常规PCR反应体系和方法(RT-PCR-AGE)对上述62份样品进行检测，以计算临床检测的符合率。
通过对临床样本进行检测，利用RT-PCR-AGE对比验证RFQ-RT-RAA反应的准确度。结果显示，RT-PCR-AGE检测出阳性45例，阴性17例。RFQ-RT-RAA检测阳性病例49例，阴性13例。两种方法的符合率为93.54％，RFQ-RT-RAA的检出率更高，且经过对RFQ-RT-RAA检出的49例阳性样本进行目的片段的测序验证，确定其均为IBV阳性。
实施例2
一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物IBV-RAA-F：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′(SEQID NO:1)；
下游引物IBV-RAA-R：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′(SEQID NO:2)；
探针IBV-T：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′C3 Spacer。
检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂、鸡传染性支气管病毒阳性对照基因和去离子水。
利用上述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法：分别以实施例1中提取的62份临床样品的基因组为模板，以鸡传染性支气管病毒阳性对照基因为阳性对照，以去离子水为阴性对照，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
所用的扩增体系包括以下试剂及用量：
。其中，280mM的醋酸镁在进行扩增前再加入反应体系中。
将上述扩增体系放入恒温核酸扩增仪中混匀，混匀后，立即取出后放入RAA恒温荧光检测仪(江苏奇天生物科技有限公司)中37℃反应20min。并在反应过程中收集FAM信号。
经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度与扩增反应时间成正比，62份临床待测样品中，阳性结果为49例，阴性结果13例。检测结果与实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法相同。
实施例3
一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，所述引物的序列为：
上游引物IBV-RAA-F：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′(SEQID NO:1)；
下游引物IBV-RAA-R：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′(SEQID NO:2)；
探针IBV-T：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′C3 Spacer。
检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，包含上述引物和探针、荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂、鸡传染性支气管病毒阳性对照基因和去离子水。
利用上述试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法：分别以实施例1中提取的62份临床样品的基因组为模板，以鸡传染性支气管病毒阳性对照基因为阳性对照，以去离子水为阴性对照，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
所用的扩增体系包括以下试剂及用量：
。其中，280mM的醋酸镁在进行扩增前再加入反应体系中。
将上述扩增体系放入恒温核酸扩增仪中混匀，混匀后，立即取出后放入RAA恒温荧光检测仪(江苏奇天生物科技有限公司)中37℃反应20min。并在反应过程中收集FAM信号。
经检测，其中阴性对照无荧光信号，阳性对照的荧光信号强度与扩增反应时间成正比，62份临床待测样品中，阳性结果为49例，阴性结果13例。检测结果与实施例1中的RFQ-RT-RAA检测方法相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用
<130> 2021
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> IBV-RAA-F
<400> 1
caggtaaagg tggaagaaaa ccagtcccag 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> BV-RAA-R
<400> 2
aggtccccca tctgaaaatc gtagtggata ttg 33
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> IBV-T
<400> 3
tgattctcag gatggtataa tgtgggttgc tgctaagggt gctgatgta 49
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> IBV-PCR-F
<400> 4
caggtaaagg tggaagaaaa cca 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> IBV-PCR-R
<400> 5
aggtccccca tctgaaaatc gtag 24
Claims (10)
1.一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物的序列为：
上游引物：5′-CAGGTAAAGGTGGAAGAAAACCAGTCCCAG-3′；
下游引物：5′-AGGTCCCCCATCTGAAAATCGTAGTGGATATTG-3′；
所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGCTGATGTA-3′。
2.如权利要求1所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：所述探针上标记有荧光基团和淬灭基团。
3.如权利要求2所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：标记所述荧光基团和所述淬灭基团的所述探针的序列为：5′-TGATTCTCAGGATGGTATAATGTGGGTTGC/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/AAGGGTGCTGATGTA-3′。
4.如权利要求1所述的检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针，其特征在于：对所述探针的3′端进行C3封闭。
5.一种用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-4任一项所述的引物和探针。
6.如权利要求5所述的用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：还包括荧光基础缓冲液、醋酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。
7.利用权利要求6所述的用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。
8.如权利要求7所述的利用所述用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系包括以下试剂及用量：
9.如权利要求8所述的利用所述用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37-41℃，20-25min。
10.如权利要求9所述的利用所述用于检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒检测鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于：所述重组酶介导等温核酸扩增体系的扩增条件为：37℃，20min。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110423814.6A CN113005229A (zh) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | 一种检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针及检测方法和应用 |
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Cited By (1)
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| CN115323075A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-11-11 | 华南农业大学 | 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用 |
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| CN110468235A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-19 | 山东省农业科学院家禽研究所 | 基于rpa技术检测鸡传染性支气管炎病毒（ibv）的引物、探针、试剂盒及其应用 |
| CN110938711A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 河北农业大学 | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 |
-
2021
- 2021-04-20 CN CN202110423814.6A patent/CN113005229A/zh active Pending
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