CN110699492A - 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110699492A
CN110699492A CN201911201694.4A CN201911201694A CN110699492A CN 110699492 A CN110699492 A CN 110699492A CN 201911201694 A CN201911201694 A CN 201911201694A CN 110699492 A CN110699492 A CN 110699492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
yonganhe
detection
real
quantitative pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911201694.4A
Other languages
English (en)
Inventor
吴建国
刘为勇
刘映乐
谭秋萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Long Fan Biology Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Long Fan Biology Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Long Fan Biology Technology Co Ltd filed Critical Guangdong Long Fan Biology Technology Co Ltd
Priority to CN201911201694.4A priority Critical patent/CN110699492A/zh
Publication of CN110699492A publication Critical patent/CN110699492A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用。本发明采用单管双荧光通道同时检测永安河病毒和内参基因Rnase P的存在，能检测全血、血清、脑脊液、粪便和组织等标本中永安河病毒RNA的存在。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。

Description

一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂 盒、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
永安河病毒(Ljungan virus)属于小核糖核酸病毒科、副肠孤病毒属，是1999年被发现的一种人畜共患病毒，能在人和啮齿内动物之间相互传播感染，永安河病毒感染可导致胎儿发育畸形、胎儿死亡、新生儿突发死亡和心肌炎等，同时也发现永安河病毒感染与糖尿病具有显著相关性。
但是，目前针对永安河病毒的检测方法主要还是传统的电镜观察、血清中和等，这些检测方法均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病毒进行鉴定的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括永安河病毒特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。
一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
进一步地，还包括：
阳性对照品：永安河病毒标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物对和探针。
进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；95℃15sec、58℃45sec，45个循环。
进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为永安河病毒阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为永安河病毒阳性，否则判断样品为永安河病毒阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为永安河病毒阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
如权利要求1所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测永安河病毒病毒的试剂盒中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供了供了永安河病毒的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，更够快速、准确且灵敏地检测出永安河病毒，特异性强、灵敏度高，高达5拷贝/mL。
2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出永安河病毒，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。本发明采用单管双荧光通道同时检测永安河病毒和内参基因Rnase P的存在，能检测脑脊液、咽拭子等标本中永安河病毒RNA的存在。当脑脊液、全血、血浆或鼻咽拭子中的存在反转录或者PCR抑制时，容易造成病毒核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”，针对这个难点与技术问题，本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增这整个过程进行质量监控，能监控RNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。
3、本发明提供了永安河病毒的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是永安河病毒标准品扩增曲线；
图2是永安河病毒标准品浓度标准曲线；
图3是25例血清标本永安河病毒荧光定量PCR扩增曲线；
图4是25例血清标本内参基因Rnase P扩增曲线；
图5是本发明的定量线性范围分析；
图6是20例大便标本永安河病毒荧光定量PCR扩增曲线；
图7是18份标本内参基因Rnase P扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用。具体如下各实施例所示。
实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒的开发
1、本实施例中选取永安河病毒特异性的VP1基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，选用内标基因Rnase P设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，构建实时荧光定量PCR技术可对永安河病毒进行检测。VP1基因是永安河病毒的抗原决定基因，可以根据VP1序列确定种别，而其他技术一般是针对病毒5’UTR区域设计引物和探针，不能确定病毒种别。本发明本实施例中设计的引物序列及探针序列见下表1所示。
表1
Figure BDA0002296035140000031
试剂盒内还包括阳性对照：永安河病毒标准品；阴性对照：RNase Free H2O；内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；5×PCR Buffer和Enzyme Mix。其中5×PCRBuffer和Enzyme Mix的配制方法如下：
5×PCR Buffer配制：
Figure BDA0002296035140000041
配置混合后于冰箱-20℃保存。
Enzyme Mix配制：
配置混合后于冰箱-20℃保存。
2、永安河病毒的实时荧光PCR检测方法
(1)病毒核酸的提取
①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；
②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；
③将标本(如脑脊液、全血等)取200μl加入此管中，加入5μl内标溶液，充分混匀；
④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；
⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；
⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；
⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；
⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次；
⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；
⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50μl RNase-free H2O，室温静置2min；12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸；
按上述方法提取15份疑似永安河病毒感染病人疱疹液标本的核酸。
(2)实时荧光定量PCR扩增(每份25μl体系)
取5μl RNA作为模板，同时加入20μl PCR反应液(荧光定量PCR反应液的配制体系如表2所示)至八联管中进行荧光定量PCR扩增。
表2荧光定量PCR反应液的配制体系
Figure BDA0002296035140000051
(3)实时荧光定量PCR反应程序为：40℃15min；95℃5min；94℃15sec、58℃45sec，45个循环。从60℃步骤开始收集荧光信号。本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。
(4)得到实时荧光定量PCR扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为永安河病毒阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为永安河病毒阳性，否则判断样品为永安河病毒阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为永安河病毒阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
永安河病毒标准品扩增曲线如图1所示；图2是永安河病毒标准品浓度标准曲线，所述标准浓度曲线方程为：y＝-3.85x+48.21，其中x是浓度的log值，y是Ct值。
利用上述构建的方法检测疑似永安河病毒感染病人血清标本25份，检测出永安河病毒阳性2例；图3是这2例永安河病毒阳性标本及23份阴性标本的病毒荧光定量PCR扩增曲线，根据这2例阳性结果的所述Ct值结合标准曲线方程，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这2例永安河病毒阳性标本的病毒浓度，具体结果见表3。同时，这25份标本的内参基因Rnase P扩增曲线正常，如图4所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表3 2例永安河病毒阳性标本病毒浓度
样品编号 Ct值 永安河病毒浓度(拷贝/mL)
阳性样品1 31.33 2.53×10<sup>4</sup>
阳性样品2 36.26 1.32×10<sup>3</sup>
实施例2永安河病毒的实时荧光PCR试剂盒的性能测定
1.准确性验证
病毒核酸检测的金标准是基因组测序，将此试剂盒的检测结果与病毒基因组测序做比较，分析其准确性。本实施例选取了基因组测序确定为永安河病毒的22例标本，其中永安河病毒22例，用本发明提供的试剂盒检测后结果如下表4。由结果可见，22份阳性标本全部被检出，表明本发明提供的永安河病毒的实时荧光PCR的准确性为100％。
表4本发明的准确性分析
病毒型别 例数 测序阳性 此方法阳性 准确率
永安河病毒 22 22 22 100％
2.特异性验证
试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了22种常见病原体阳性标本，结果如下表5。经检测，此发明对22种常见病原体阳性标本无扩增，表明本发明提供的永安河病毒的实时荧光PCR的特异性为100％。
表5本发明的特异性分析
阳性病原体 是否有扩增 是否有扩增
腺病毒 无 人嗜T细胞病毒 无
巨细胞病毒 无 人疱疹病毒6型 无
甲型流感病毒 无 卡波西肉瘤病毒 无
乙型流感病毒 无 金黄色葡萄球菌 无
乙型肝炎病毒 无 大肠杆菌 无
丙型肝炎病毒 无 鲍曼不动杆菌 无
EB病毒 无 铜绿假单胞菌 无
人单纯疱疹病毒1型 无 白色念珠菌 无
人单纯疱疹病毒2型 无 耶氏肺孢子菌 无
HIV-1 无 曲霉 无
EV71 无
CAV16 无
3.灵敏度检测
灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，我们将永安河病毒的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表6。经验证，在5拷贝/ml浓度时，检出率为100％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的永安河病毒的实时荧光PCR的灵敏度为5拷贝/mL。
表6本发明的灵敏度分析
Figure BDA0002296035140000071
Figure BDA0002296035140000081
4.精确性检测
精确性是指相同阳性样本多次检测，结果判读的一致性，以变异系数(CV)小于5判定为精确性良好。本实施例在每个浓度梯度分3次检测了30份阳性标本，结果如下表7所示。经验证，在5～1×108拷贝/mL范围内，此发明的批内CV<5％，且批间CV<5％，精密度良好。
表7本发明的精确性分析
Figure BDA0002296035140000082
5.线性范围分析
本实施例分析了在1、5、10、20、50、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108拷贝/ml范围内，此发明的线性范围，结果如下图5所示，此发明提供的永安河病毒的实时荧光定量PCR在5～1×108拷贝/ml范围内呈良好的线性范围。
实施例3临床检测
用上述方法对另外疑似永安河病毒感染病人大便标本20例进行检测，其中永安河病毒病毒检测结果阳性3例，病毒荧光定量PCR扩增曲线见图6，根据这3例阳性结果的Ct值结合扩增曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这3例永安河病毒病毒阳性标本的病毒浓度，具体结果见表8。同时，这20例大便标本的内参基因Rnase P扩增曲线正常，如图7所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表8 5例永安河病毒病毒阳性标本病毒浓度
样品编号 Ct值 永安河病毒浓度(拷贝数/mL)
阳性样品1 34.83 3.44×10<sup>2</sup>
阳性样品2 30.51 6.66×10<sup>3</sup>
阳性样品3 29.14 1.69×10<sup>4</sup>
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东龙帆生物科技有限公司
<120> 一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(LV-F)
<400> 1
agttgctcac acatggtttg gcact 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(LV-R)
<400> 2
catcttaatg gaacctcaga ataat 25
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(LV-FAM)
<400> 3
ggacagctac tttggaatca aatggaacaa tg 32
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P-F)
<400> 4
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P-R)
<400> 5
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P-HEX)
<400> 6
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (7)

1.一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括永安河病毒特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。
2.一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
3.根据权利要求2所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：
阳性对照品：永安河病毒标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
4.一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的永安河病毒的实时荧光定量PCR检测引物和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；95℃15sec、58℃45sec，45个循环。
6.根据权利要求4所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为永安河病毒阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为永安河病毒阳性，否则判断样品为永安河病毒阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为永安河病毒阴性；当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
7.如权利要求1所述的一种永安河病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测永安河病毒病毒的试剂盒中的应用。
CN201911201694.4A 2019-11-29 2019-11-29 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用 Pending CN110699492A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911201694.4A CN110699492A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911201694.4A CN110699492A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110699492A true CN110699492A (zh) 2020-01-17

Family

ID=69208070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911201694.4A Pending CN110699492A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110699492A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057797A (zh) * 2020-01-19 2020-04-24 华中科技大学同济医学院附属同济医院 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111074006A (zh) * 2020-01-19 2020-04-28 武汉大学 Salivirus病毒的双通道实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒、方法及应用
CN116987821A (zh) * 2023-07-27 2023-11-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种检测猴痘病毒的荧光定量pcr试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101194026A (zh) * 2005-03-15 2008-06-04 阿波德漠斯有限公司 Ljungan病毒的检测方法
US20110300149A1 (en) * 2008-12-24 2011-12-08 Apodemus Ab Ljungan virus
US20120027777A1 (en) * 2009-01-22 2012-02-02 Apodemus Ab Ljungan virus with improved replication characteristics

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101194026A (zh) * 2005-03-15 2008-06-04 阿波德漠斯有限公司 Ljungan病毒的检测方法
US20110300149A1 (en) * 2008-12-24 2011-12-08 Apodemus Ab Ljungan virus
US20120027777A1 (en) * 2009-01-22 2012-02-02 Apodemus Ab Ljungan virus with improved replication characteristics

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONNY TOLF 等: "Molecular characterization of a novel Ljungan virus (Parechovirus; Picornaviridae) reveals a fourth genotype and indicates ancestral recombination", 《J GEN VIROL》 *
CONNY TOLF等: "Molecular characterization of a novel Ljungan virus (Parechovirus; Picornaviridae) reveals a fourth genotype and indicates ancestral recombination", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY *
HIROMICHI MITAKE等: "Isolation of a sp. nov. Ljungan virus from wild birds in Japan", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY *
KIERAN C POUNDER 等: "Genome characterisation of two Ljungan virus isolates from wild bank voles (Myodes glareolus) in Sweden", 《INFECT GENET EVOL》 *
M. STEVEN OBERSTE等: "Typing of Human Enteroviruses by Partial Sequencing of VP1", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY *
MANTKE 等: "A new quantitative real-time reverse transcriptase PCR assay and melting curve analysis for detection and genotyping of Ljungan virus strains", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057797A (zh) * 2020-01-19 2020-04-24 华中科技大学同济医学院附属同济医院 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111074006A (zh) * 2020-01-19 2020-04-28 武汉大学 Salivirus病毒的双通道实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒、方法及应用
CN116987821A (zh) * 2023-07-27 2023-11-03 宝瑞源生物技术(北京)有限公司 一种检测猴痘病毒的荧光定量pcr试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111057797B (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
CN111004870B (zh) 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒
WO2022095723A1 (zh) 用于检测SARS-CoV-2的试剂盒及方法
CN110273027B (zh) 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
CN111235316A (zh) 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN110699492A (zh) 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用
CN107653348A (zh) 用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法、应用
CN112094944A (zh) 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
CN113652505A (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN112176109A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法
CN110760618A (zh) 一种副肠孤病毒3型实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用
CN111593137A (zh) 非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂和试剂盒
LU500740B1 (en) REAL-TIME FLUORESCENT PCR DETECTION PRIMERS AND PROBES, KIT AND METHOD FOR NOVEL CORONAVIRUS 2019-nCoV
CN109234465A (zh) 用于检测a型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN116042917A (zh) 一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重rt-pcr引物组及其应用
CN115323073A (zh) 一种检测人巨细胞病毒核酸的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法
CN107974516A (zh) 用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN111074006B (zh) Salivirus病毒的双通道实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒、方法及应用
CN110819739A (zh) 一种Saffold病毒实时荧光PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及应用
CN113481324A (zh) 检测新型冠状病毒及其d614g突变株的方法和试剂盒
Roy et al. SARS-CoV-2 Detection using Real Time RT PCR by a Commercial Diagnostic Kit
CN113981137B (zh) 非洲猪瘟病毒a137r基因的实时荧光pcr引物、检测试剂盒及应用
CN110904254A (zh) 一种加林疏螺旋体实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200117