CN107974516A - 用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 - Google Patents
用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用，其中，引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，下游引物：5'CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；探针的序列如下：5'FAM‑AGCGGGAGTCTGGT‑MGB 3'。本发明的有益效果是：使用本发明的试剂盒能够快速、准确地实现对猪圆环病毒2型的检测，本发明的试剂盒在5.0x101‑5.0x109copies·μL‑1模板范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR的100倍，与其他猪病病毒无交叉反应，重复性试验变异系数小于1.5%；与常规PCR方法相比，该方法的阳性检出率更高。综上所述，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪圆环病毒2型的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及病毒PCR检测技术领域，特别涉及一种用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒，也是目前发现的最小的动物病毒。PCV具有三个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是一种可以感染猪的常规病毒，对猪无致病性。PCV2于1998年首次报道，对猪具有致病性，在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS）、皮炎-肾病综合征（Porcine dermatitis andnephropathy syndrome, PDNS）、繁殖障碍以及呼吸道和肠道疾病，对全世界的养猪业造成了重大的经济损失。2016年美国报导出现一种新的圆环病毒血清型-PCV3，该病毒能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。目前PCV3病毒尚未分离成功，致病性也未进行深入研究。2016至2017年，我国安徽、福建、河北、河南、山东和重庆等地也相继检测到PCV3的存在。
病毒的常规检测方法包括病毒分离与鉴定、间接免疫荧光抗体实验(IFA)、血清中和实验(SN)、聚合酶链式反应(PCR)以及序列测定等。这些常规方法用于PCV2检测时在特异性、敏感性和时效性等方面存在不足，特别是在病毒感染早期诊断中体现得尤为明显。实时荧光定量PCR将常规PCR与荧光探针检测技术相结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，并且操作简便，用时短，污染少，通过分析软件可自动定量分析，结果更为准确直观，适用于大批量的病毒定性和定量的检测，已逐渐成为病原体检测的重要方法。
本发明根据GenBank中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测PCV2病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在5.0x101-5.0x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到5.0x101copies•μL-1，是常规PCR方法的100倍。利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2h内快速准确地对样品中的PCV2进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。该方法的建立为猪圆环病毒2型的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
发明内容
为了能够提供一种更加快速、特异及敏感的检测PCV2的检测试剂，为PCV2的快速特异性检测及其流行病学调查以及预防和控制我国PCV2的流行提供可靠的技术工具，本发明提供了一种用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于猪圆环病毒2型特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于猪圆环病毒2型特异性检测用引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
其中，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
一种制备检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
所述引物和探针或所述试剂或所述试剂盒，在检测猪圆环病毒2型或制备检测猪圆环病毒2型检测产品中的应用。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒分别提取内脏组织匀浆、病毒培养物和血清的DNA，溶于20μL RNase-free water，所得DNA可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增PCV2目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
所述步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 3min；94℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix ExTaq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），质粒标准品1μL。
本发明的有益效果是：本发明的引物和探针是根据GenBank中猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus 2, PCV2）序列设计出的一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，并建立了一种快速、准确检测PCV2病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，使得该方法在5.0x101-5.0x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到5.0x101 copies•μL-1，是常规PCR方法的100倍。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。将待检样品提取DNA后进行荧光定量PCR反应，可以在2h内快速准确地对样品中的PCV2进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。进一步地，通过试验表明，利用本发明引物和探针构建的荧光定量PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势，为PCV2的早期快速检测，及其流行病学调查以及预防和控制我国PCV2的流行提供快速、简便和可靠的技术工具。
附图说明
图1 为本发明实施例5中PCV2目的基因PCR扩增结果的示意图；其中，M：DL2000Marker；1-2：PCV2；3：阴性对照。
图2 为本发明实施例5中PCV2 TaqMan-MGB荧光定量PCR动力学曲线图；其中，1-9分别为5.0x101-5.0x109copies•μL-1的标准品。
图3为本发明实施例5中PCV2 TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线图。
图4 为本发明实施例5中PCV2 TaqMan-MGB荧光定量PCR特异性试验结果的示意图；其中，1：PCV2阳性对照；2-10分别为CSFV, PRRSV, PRV, PEDV, TGEV, RV, PPV, PCV2和阴性对照。
图5 为本发明实施例5中PCV2常规PCR敏感性试验结果的示意图；其中，M：DL2000Marker；1-8分别为：稀释度为6.12×107-6.12×101copies•μL-1的PCV2 DNA和阴性对照。
图6为本发明实施例5中PCV2 TaqMan-MGB荧光定量PCR重复性试验结果的示意图。
具体实施方式
本发明根据GenBank中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测PCV2病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在5.0x101-5.0x109copies•μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到5.0x101copies•μL-1，是常规PCR方法的100倍。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1 引物及探针
本发明实施例提供了一种用于猪圆环病毒2型特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
实施例2 荧光定量PCR检测试剂
本发明实施例提供了一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测猪圆环病毒2型的引物和探针；其中，
引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）；水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
实施例3 荧光定量PCR试剂盒
本发明实施例提供了一种制备检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR试剂盒，具体为含有实施例2荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
实施例4 荧光定量PCR检测方法
本发明实施例提供了一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒分别提取内脏组织匀浆、病毒培养物和血清的DNA，溶于20μL RNase-free water，所得DNA可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增PCV2目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 3min；94℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），质粒标准品1μL。
实施例5 应用
本实施例提供了一种引物和探针、或荧光定量PCR检测试剂、或荧光定量PCR试剂盒，用于猪圆环病毒2型特异性检测的应用，具体如下：
1材料与方法
1.1仪器与试剂
CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司，紫外分光光度计购自Thermo公司；质粒提取试剂盒购自AxyGen公司；E.coliDH5α购自TaKaRa公司，DNA/RNA核酸共提试剂盒购自invitrogen公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自AxyGen公司。
1.2引物和探针
特异性引物对和TaqMan-MGB荧光探针具体如下：
引物对的序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
探针序列为Probe: 5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团为 Non-fluorescentquencher和Minor Groove Binder (MGB)。
1.3病毒DNA的提取和质粒标准品制备
用DNA/RNA核酸共提试剂盒按其操作说明书分别提取内脏组织匀浆、病毒培养物和血清的DNA，溶于20μL RNase-free water，所得DNA可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用。
以上下游引物通过常规PCR扩增PCV2目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品。测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
1.4 荧光定量PCR反应条件的优化
以质粒标准品为模板，在不同退火温度下进行常规PCR反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧光定量PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。
1.5荧光定量PCR标准曲线的建立
将质粒标准品10倍倍比稀释至浓度范围为5.0x101-5.0x109copies•μL-1。每个稀释度设3个重复，进行荧光定量PCR检测，绘制标准曲线。
1.6 特异性试验
分别提取猪瘟病毒（CSFV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），猪伪狂犬病毒（PRV），猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），轮状病毒（RV），猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒3型（PCV3）等病毒的核酸，利用建立的荧光定量PCR方法对上述核酸进行检测验证该方法的特异性。
1.7敏感性试验
将阳性DNA按10倍倍比稀释至最低浓度为6.12x101copies•μL-1，进行荧光定量PCR反应。同时以该DNA为模板，进行常规PCR反应，上下游引物分别为5'TGAAGTAACGGGAGTGGTAGGAG 3'和5' TGGAGAAGGAAAAATGGCATC 3'。取扩增产物10μL，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较二者敏感性的差异。
1.8重复性试验
用5种浓度的标准品质粒分别进行4次批次内和批次间的重复性试验并且根据Ct值计算变异系数。
1.9对临床样品的检测
由新希望六和动保中心收集可疑PCV2临床样品78份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测，比较分析结果。
2 结果
2.1 质粒标准品的制备
以上下游引物通过常规PCR扩增PCV2目的基因，扩增结果如图1所示，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品。测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
2.2荧光定量PCR反应条件的优化
通过对退火温度及引物与探针浓度的优化，最终确定了荧光定量PCR方法的最优反应条件。荧光定量PCR反应体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μLRNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），质粒标准品1μL。反应条件为：95℃ 3min；94℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立
取浓度为5.0x101-5.0x109copies•μL-1的标准品质粒为模板进行荧光定量PCR扩增并建立标准曲线。由图2和图3可知，线性关系良好，标准曲线建立成功，可用于临床检测。
2.4 特异性试验
用所建立的荧光定量PCR方法对CSFV，PRRSV，PRV，PEDV，TGEV，RV，PPV和PCV3进行检测，检测结果均为阴性，这些病毒的扩增曲线均为水平线，未达到检出阈值（图4），试验结果表明该方法具有良好的特异性。
2.5敏感性试验
荧光定量PCR方法能检出的DNA模板最低浓度为5.0x101copies•μL-1（图2），而常规PCR能检出的模板最低浓度为6.12×103copies•μL-1（图5），试验结果表明所建立的荧光定量PCR方法的敏感性是常规PCR方法的100倍左右。
2.6 重复性试验
用5种不同浓度的标准品分别进行批次内和批次间的重复性试验。试验结果表明，批次内和批次间重复性试验的变异系数均小于1.5%（表1和图6），表明该方法具有良好的重复性与稳定性。
表1 PCV2 TaqMan-MGB荧光定量PCR重复性试验结果
2.7 临床样品检测结果
对收集的疑似PCV2临床样品78份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测。检测结果表明，荧光定量PCR方法阳性检出率（60.3%）比常规PCR方法（48.7%）更高（表2）。对临床样品的检测结果表明所建立的荧光定量方法比常规方法具有更高的敏感性，更适用于PCV2的临床检测，尤其是感染早期病毒含量较低时。
表2 临床样品检测结果
综上，通过上述将本发明的引物、探针应用于猪圆环病毒2型特异性检测以及样品结果，能够看出，采用本发明的引物、探针构建的荧光定量PCR检测方法与其它猪病病毒无交叉反应，具有良好的特异性，敏感性是常规PCR方法的100倍，且该方法将待检样品提取DNA后直接进行荧光定量PCR反应，利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2h内快速准确地对样品中的PCV2进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，为猪圆环病毒2型的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针，其特征在于，
所述引物序列如下所示：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
2.用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测猪圆环病毒2型的引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'。
3.根据权利要求2所述的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测猪圆环病毒2型的PCR检测试剂，其特征在于，所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
5.一种制备检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
6.如权利要求1所述引物及探针、或如权利要求2-4任一项所述检测试剂、或如权利要求5所述试剂盒，在检测猪圆环病毒2型或制备检测猪圆环病毒2型检测产品中的应用。
7.用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物： 5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3'，
下游引物： 5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3'；
所述探针序列如下：
5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
8.根据权利要求7所述的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒分别提取内脏组织匀浆、病毒培养物和血清的DNA，溶于20μL RNase-free water，所得DNA可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增PCV2目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coli DH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
9.根据权利要求7或8所述的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中，优化后的反应条件为： 95℃ 3min；94℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
10.根据权利要求7-9任一项所述的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×PremixEx Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），质粒标准品1μL。
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