CN102277455A

CN102277455A - 猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN102277455A
Application number: CN2011102405475A
Authority: CN
Inventors: 王一成; 袁秀芳; 徐丽华; 李军星; 郭勇
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: CN102277455B

Abstract

本发明公开了猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。所述检测用引物和探针为序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：9，本发明还提供了猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，一次能检测三种病毒，节约成本、减少步骤，提高效率。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、低成本的特点，适合较大量样品的分析。

Description

猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒2型（Porcine circocirus type2，PCV-2）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）和猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是目前常见的引起猪繁殖障碍病的DNA病毒。目前，很多猪场都同时存在上述三种病毒引起的疾病，给养猪业造成巨大的经济损失。以上三种病毒常呈现混合感染，在临床上以受感染母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为主要特征，不容易区分。

国内外猪病现有常用诊断技术主要包括：临床诊断、病原诊断、血清学诊断，分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种类，难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法，特异性高，可直接确诊，但病毒分离所需时间较长，成本较高。血清学检测技术有血清中和试验（Neutralization test）、凝集性试验(Agglutination test)、荧光抗体技术(Fluorescent-labelled abtibody technic)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatography)等。荧光抗体技术具有快速、鉴别准确、可靠、分辨率高等优点，但费用昂贵(需配备荧光显微镜)、特异性差、主观性强（需有经验的检验员），同时难区分非特异性染色。其他血清学技术主要用于检测血清抗体水平。目前最常用的血清学诊断方法是ELISA，应用很广，发展很快，是检测抗体的主要免疫学方法，也是监测猪群抗体水平的主要技术手段，常用于规模化养猪场的免疫水平监测。分子生物学检测技术包括聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT－PCR)、实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）、实时荧光定量RT-PCR（Real Time Quantitative RT-PCR）核酸探针技术、基因芯片检测技术等。常规单项PCR及实时定量PCR一次只能检测一种病毒，费时费力，多种病因混合感染时，难以应用常规方法进行早期快速检测。多重PCR及实时定量PCR可以同时检测多种病毒，方便快捷，省时省力。

本发明首次将实时定量PCR技术应用于同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测领域，提供了针对猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测的特异性引物、探针序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸序列，包括引物和探针。

本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的引物和探针，具体如下：

1. 通过序列比较，根据PCV ORF2 基因的序列 (GenBank：EU257513)，在其保守区设计一对引物及一条探针：

1）PCV正义引物（PCV-F） 5' CCTCCCGCCATACCATAACC 3' （SEQ ID NO：1）；

2）PCV反义引物（PCV-R）5' CTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGG 3' （SEQ ID NO：2）；

3）PCV探针（PCV-probe）5' (FAM) CCCTTCTCCTACCACTCCCGSTACTTTAC (ECLIPSE) 3' （SEQ ID NO：3），该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE；

其中，S代表兼并碱基G或C。

2. 通过序列比较，根据PRV gH基因的序列(GenBank：X58868)，在其保守区设计一对引物及一条探针：

4）PRV 正义引物（PRV-F）5'ACATGGAGGAGCAGCTCATG 3'，（SEQ ID NO：4）；

5）PRV 反义引物（PRV- R）5' AAGAGCATCAGGGCCTTGAC 3'，（SEQ ID NO：5）；

6）PRV 探针（PRV- probe）：

5’ (TAMARA )CGCCAACTCCACCATCCCCAGC(ECLIPSE) 3’，（SEQ ID NO：6）。

3. 通过序列比较，根据PPV VP2基因的序列(GenBank：DQ464345)，在其保守区设计一对引物及一条探针：

7）PPV正义引物（PPV-F）5’ CAAGAAATATTCAATGTAGTRCTTAAAAC 3’ （SEQ ID NO：6）；

8）PPV反义引物（PPV-R）5’ GTGTGTATGGAAGTGTGTTATTGG 3’ （SEQ ID NO：7）；

9）PPV 探针（PPV-probe）

5’ (JOE) CAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAA (ECLIPSE) 3’ （SEQ ID NO：9），该探针的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE；

其中，R代表兼并碱基A或T。

本发明还提供了一种猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒，由以下组分组成：

1）DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或使用常规SDS裂解法中通常使用的各种试剂，DNA提取试剂盒可以选择例如上海博彩生物科技有限公司的DNA提取试剂盒（Genomic DNA Purification kit，cat.no K201）；

2）DNA标准品：含猪圆环病毒靶基因的T载体质粒，含猪伪狂犬病毒靶基因的T载体质粒和含猪细小病毒靶基因的T载体质粒；

3）实时定量PCR反应液，其包括：含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液，检测猪圆环病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪伪狂犬病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪细小病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，荧光定量PCR参比染料；

优选使用：1×含有TaqDNA聚合酶、dNTP PCR缓冲液，检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM， 1×荧光定量PCR参比染料；

进一步地，所述含有Taq DNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex TaqTM，购自Takra，货号（DRR039），所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号（DR0X01），所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。

所述premix Ex TaqTM为2×实时定量PCR缓冲液，包含有以下成分：Taq DNA聚合酶，200U；dNTP，5mM；MgCL₂，5mM；KCl ， 100 mM； Tris-HCl，20 mM；0.2% Triton X-100。

4）阴性对照：DEPC水；

5）DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore 纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。

其中，检测猪圆环病毒的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE；检测猪伪狂犬病毒的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团TAMARA，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE；检测猪细小病毒的正义引物为序列表SEQ ID No：7所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：8所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。

本发明还提供了上述猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒的使用方法：

1．样品采集、运送及制备

临床发病的猪场，采集病死猪的肾、脾和淋巴结，用50mL离心管收集，置于4℃保鲜盒中，运送回实验室。取100mg肾、脾和淋巴结，加入500μL的0.01M PBS液，用组织捣碎机捣碎，4000rpm离心20 min，取上清200μL。-70℃冻存备用。

2．DNA提取

有两种方法：试剂盒法和SDS裂解法

试剂盒法：

按照上海博彩生物科技有限公司的DNA提取试剂盒（Genomic DNA Purification kit，cat.no K201）提供的方法提取病毒DNA，具体方法如下：

1）取400μL 裂解液移入到1.5ml 离心管中。

2）加入200μL病料上清液，在漩涡振荡器上混匀（15s），加入3μL（120μg）蛋白酶K；混匀，55℃保温10-60分钟。

3）高速室温12000转、分离心5分钟，将上清转移到1.5ml无菌离心管中，加入300μl SolutionB，混匀。

4）将样品全部转移到3S柱，柱子放入2ml收集管中，盖上离心管盖子，12000转，室温离心1分钟。

5）取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μL Wash Solution，12000转室温离心1分钟。

6）重复步骤5）；

7）取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中， 10000转室温离心2分钟，以出去残余的Wash Solution。

8）把柱子放进1.5ml 无菌离心管中，弃去收集管，小心打开盖子，加入80μL TE，盖上盖子，室温或37-55℃放置2分钟，12000转室温离心1分钟，弃去柱子，1.5ml 离心管中即为病毒DNA。

SDS裂解法：

1）取病料200μL，加入等体积样品裂解缓冲液（20mM Tris-HCl pH 7.4， 20mMEDTA，1% SDS）及10μL 200μg/mL的蛋白酶K， 56℃水浴30分钟，

2）5000转/分钟，离心15分钟。

3）酚∶氯仿、氯仿各抽提一次，吸取水相。

4）用2.5倍样品体积的异丙醇-70℃沉淀 DNA 30分钟，10000转/分钟离心10分钟。

5）70%预冷乙醇洗涤2次，自然干燥后用200μL TE（10 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）溶解，加入50μg/mL 的RNase A，37℃作用1小时。

3. 实时定量RT-PCR反应：

96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。

反应体系为20μL，见表1：

表1

其中，含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex Taq ^TM，荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。

所述的模板DNA ，如果是制作标准曲线，用体外转录的DNA标准品作为模板，浓度为10¹~10⁸，如果是样品检测，用腹泻物提取的DNA为模板，阴性对照模板为DEPC水，

检测条件为：在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95℃10秒钟，然后经过95℃5秒钟，60℃30秒钟40个循环。

本发明的优点是：

本发明试剂盒在一个PCR管中同时检测三种病毒，大大提高了检测效率，并能做到鉴别诊断三种病毒。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1、试剂盒的组成

一、试剂盒的组成

1）DNA提取试剂；上海博彩生物科技有限公司的DNA提取试剂盒（Genomic DNA Purification kit，cat.no K201）；

3）实时定量PCR反应液，其包括：1×含有Taq DNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液，检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM， 1×荧光定量PCR参比染料；

4）阴性对照：DEPC水；

二、DNA标准品的制备

（1）猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的PCR扩增

利用上海博彩公司的DNA提取试剂盒（上海博彩生物科技有限公司的DNA提取试剂盒（Genomic DNA Purification kit，cat.no K201）），从冻存的PPV和PRV细胞毒以及PCV病料（PPV购于中国兽药监查所，PRV购自武汉科前动物生物制品有限责任公司，PCV为浙江省农业科学院分离鉴定保存）中提取病毒DNA，并以此为模板，分别以PCV(F) 和PCV(R)、PRV(F)和PRV(R)、PPV(F)和PPV(R)为上下游引物扩增目的基因，得到113bp、94bp和133bp大小的DNA片段，与预期大小相符。

（2）猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的T载体克隆

将猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒基因的PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后连接到大连宝生物公司购买的pMD18-T载体中，转化Top10感受态细胞，筛选出阳性克隆，送Invitrogen公司测序验证。

（3）猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒实时定量PCR标准品的制备

验证序列正确后大量提取阳性质粒，并纯化，测其浓度和纯度，-20℃保存，做标准品备用。

实施例2利用DNA标准品建立标准曲线

将上述已经测出的质粒DNA(PCV-T、PRV-T、PPV-T)的浓度，利用公式：（6.02 x 10²³拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) x10^-3 / (MW g/mol) = 拷贝/μl，分别计算出PCV-T、PRV-T和PPV-T拷贝数，共同十倍稀释，以10³～10⁷拷贝/μl的RNA为模板，在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应体系为20μl，其中2 x premix Ex TaqTM 10μl，PCV(F) 和PCV(R)、PPV(F)和PPV(R)、PRV(F)和PRV(R) (20μM)各0.2μl， PCV-Probe、PPV- Probe 和PRV- Probe (20μM) 各0.4μl，ROX Reference Dye (50x) 0.4μl，模板DNA 2μl，DDW至20μl。反应条件为95℃10秒钟，然后经过95℃ 5秒钟，60℃30秒钟40个循环。利用软件对数据进行分析，得到标准曲线。其R值分别为0.994587（PCV）、0.997931（PRV）、0.997765（PPV）。

实施例3、试剂盒的特异性试验

1材料，见表2：

病毒	来源
		猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒	上海海利生物药品有限公司
猪圆环病毒	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存
		猪伪狂犬病毒	武汉科前动物生物制品有限责任公司
猪细小病毒	购于中国兽药监察所
		猪瘟病毒	南京天邦猪瘟细胞苗
猪乙型脑炎病毒	湖南亚华种业股份有限公司生物药厂
		猪轮状病毒	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存
猪大肠杆菌	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存
		副猪嗜血杆菌	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存
猪链球菌	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存

2 方法：

利用本发明所述的试剂盒使用方法对猪常见病毒病进行检测，同时以10⁵浓度的质粒DNA为阳性控制，验证其特异性。

3 结果

本发明试剂盒对7种猪常见病毒病和3种细菌病进行检测，只有阳性控制出现扩增曲线，结果表明，所建立的方法特异性良好。

实施例4 试剂盒的敏感性检测

1材料：

猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品。

2 方法：

为了验证本发明试剂盒的敏感性，以10倍稀释的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品（2×100～2×107拷贝/μL）为模板，每个稀释度的模板分别加2μl，同时设阴性对照，每个样品平行做3个孔。按照所建立的方法，在定量PCR仪上进行扩增反应。

3 结果：

经过定量PCR仪上扩增，得出动力学曲线和标准曲线，当模板为2×10拷贝/μl 时，其CT值仍在可检测范围内（CT<40），表明本实验所建立的方法最低能检测到2×10拷贝/μl的D NA。

实施例5 批间重复和批内重复

（1）材料

猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品

（2）方法

批内重复试验

同一时间提取的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品，每组进行四个平行，均设阴性空白对照，按照建立的方法进行实时定量PCR。

批间重复试验

在3个不同时间提取猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒T载体质粒标准品，每组进行四个平行，均设阴性空白对照，按照建立的方法进行实时定量PCR。

（3）结果

按照进行了批间重复实验和批内重复实验，最后利用统计学方法对所得数据进行分析处理，结果显示猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒 Ct值变异系数CV%均不超过2%（表1，2），从而表明该检测方法具有很好的稳定性。

表3检测4份不同批次试剂盒批间重复检测结果

	1	2	3	4
					PCV Mean Ct±S.D	12.61±0.13	16.58±0.07	21.01±0.25	25.20±0.10
变异系数CV(%)	0.27	0.08	0.64	0.17
					PRV Mean Ct±S.D	12.59±0.13	17.91±0.04	22.69±0.14	26.35±0.16
变异系数CV(%)	0.27	0.22	0.04	0.23
					PPV Mean Ct±S.D	12.59±0.13	17.91±0.04	22.69±0.14	26.35±0.16
变异系数CV(%)	0.27	0.22	0.04	0.23

表4检测4份不同批次试剂盒批内重复检测结果

	1	2	3	4
					PCV Mean Ct±S.D	10.09±0.10	14.22±0.04	18.19±0.08	22.34±0.26
变异系数CV(%)	0.14	0.05	0.09	0.11
					PRV Mean Ct±S.D	16.58±0.07	19.00±0.01	26.56±0.05	33.26±0.06
变异系数CV(%)	0.08	0.03	0.16	0.17
					PPV Mean Ct±S.D	14.09±0.07	18.30±0.17	22.69±0.11	26.83±0.04
变异系数CV(%)	0.08	0.13	0.03	0.19

实施例6 临床验证

利用本实验建立的TaqMan三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，对从浙江7个县市采集到的30份猪病料样品进行猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为：30份腹泻粪样品中PCV阳性19份，阳性率为63.3%；PPV阳性4份，阳性率为13.4%；PRV阳性2份，阳性率为6.7%。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成PCV正义引物（PCV-F）

<400> 1

cctcccgcca taccataacc 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成PCV反义引物（PCV-R）

<400> 2

ctgatttctt ttgttgtttg gttgg 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成PCV探针（PCV-probe）

<400> 3

cccttctcct accactcccg stactttac 29

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成PRV 正义引物（PRV-F）

<400> 4

acatggagga gcagctcatg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成PRV 反义引物（PRV- R）

<400> 5

aagagcatca gggccttgac 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成PRV 探针（PRV- probe）

<400> 6

cgccaactcc accatcccca gc 22

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成PPV正义引物（PPV-F）

<400> 7

caagaaatat tcaatgtagt rcttaaaac 29

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成PPV反义引物（PPV-R

<400> 8

gtgtgtatgg aagtgtgtta ttgg 24

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成PPV 探针（PPV-probe）

<400> 9

cagaatcagc aacctcacca ccaaccaa 28

Claims

1.一组检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于，所述核苷酸引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪圆环病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测猪圆环病毒的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测猪伪狂犬病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测猪伪狂犬病毒的荧光探针，序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别为检测猪细小病的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：9为检测猪细小病的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。

3.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：6的5’端标记报告荧光基团TAMARA，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。

4.根据权利要求1所述的检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：9的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团ECLIPSE。

5.一种猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）DNA提取试剂；

4）阴性对照：DEPC水；

5）DEPT水；

6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。

7.根据权利要求5所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量PCR反应液包括：1×含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液，检测猪圆环病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪伪狂犬病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测猪细小病毒的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM， 1×荧光定量PCR参比染料。

8.根据权利要求7所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述含有TaqDNA聚合酶、dNTP的PCR缓冲液为premix Ex Taq ^TM，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。