CN101565761A - 一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和使用所述试剂盒的检测方法，所述试剂盒包括10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、阳性对照试样以及选自SEQID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物、SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：8序列的5’端和/或3’端延长序列的引物混合物、与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列碱基互补的序列的引物混合物中任一种的引物。所述试剂盒和检测方法具有快速高效、稳定性好、准确性高和敏感性高等优势。

Description

一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法，更具体地，涉及四重PCR法检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法。

背景技术

猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。猪细小病毒感染的主要特征是孕猪尤其是初产母猪及血清学阴性经产母猪在怀孕前期容易受到感染，引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡。有研究证实PPV与猪的多系统衰竭综合征和猪的非化脓性心肌炎有关，同时还可引起仔猪腹泻和发生皮炎。

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员，是迄今已知最小的动物病毒之一。根据其抗原性及基因组成不同，PCV可分为2种血清型，即PCV1及PCV2。动物实验表明PCV1无致病性，广泛存在于正常猪体内各组织器官中。PCV2具有致病性，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)，虽然认为PMWS是一种多因子疾病，但大多数研究者认为PCV2是源发性病因，因此PCV2近年来引起了人们广泛关注。PCV2主要侵犯机体免疫系统，临床上常呈并发或继发感染，使病情加重，以至死亡，从而造成严重经济损失。同时，猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒(PPV)和传染性先天性震颤等也都与PCV-2感染有密切关系。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种或多种动物感染的急性传染病。PRV感染猪后，仔猪表现出严重的中枢神经症状，并导致高死亡率，成年猪则长期潜伏，并可导致妊娠母猪流产和死亡。猪感染PRV后，免疫系统受到损害，因而更易继发其它疾病，如猪瘟或猪繁殖与呼吸综合征等。猪PR在我国流行范围很广，迄今已有20多个省份发生该病。自上世纪70年代以来，人工筛选的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用对防治伪狂犬病做出了重要贡献。美国研制出的世界上第一个伪狂犬病病毒基因工程缺失疫苗(OMNIVAC-PRV)在1986年获得了美国政府颁发的生产许可证，该疫苗缺失了gE基因。我国使用Bartha-k61株弱毒疫苗，其基因中整个gE和大部分gI序列的缺失。90年代以后，欧美等国家则只允许gE基因缺失的疫苗上市。这些弱毒疫苗和基因工程疫苗可使猪免于发病，但不能阻止野毒潜伏感染，潜伏感染的野毒在一定条件下又会传染给其它猪进而使其发病。

由于上述几种疾病在临床上表现出相似的症状，因此常规诊断方法很难将这些症状相似的一类疾病加以区分，而混合感染多种病原时，则更难以进行早期快速检测。同时，常规的病原学和血清学检测方法又存在着操作繁杂、费时费力和敏感性低等不足。因此，建立准确快速的诊断方法对这些疾病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于实现对猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及其混合感染的早期快速检测。

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、阳性对照试样以及选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物、SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8序列的5’端和/或3’端延长序列的引物混合物、与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列碱基互补的序列的引物混合物中任一种的引物。

其中所述10×PCR buffer包含500mmol/L KCl、100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl₂，所述dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，所述Taq酶的浓度为5u/μL。

其中所述阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。

其中所述引物为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，各引物的浓度分别为10μM。

本发明另一方面提供了一种检测方法，所述方法包括以下步骤：

a.提取样品总DNA；b.使用权利要求1所述试剂盒分样品组、空白对照和阳性对照进行四重PCR扩增；c.电泳；d.实验结果分析。

其中所述10×PCR buffer包含500mmol/L KCl、100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl₂，所述dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，所述Taq酶的浓度为5u/μL。

其中所述阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。

其中引物为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，各引物的浓度为10μM。

其中样品组中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、样品总DNA和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL；空白对照中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、灭菌水和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL；阳性对照中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、阳性对照试样和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL。

其中所述步骤b中扩增的条件为95℃预变性5min，95℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30-35个循环，72℃延伸10min。

本发明试剂盒和检测方法具有快速高效、稳定性好、准确性高和敏感性高等优势，适用于我国各级防控单位、基层兽医站和大中型养殖场等，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为样品1、样品2、样品3、样品4和阳性对照试样扩增产物的电泳图。

具体实施方式

1.试剂来源

引物由上海生工生物工程有限公司合成；

UNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒来源于上海生工；

扩增用dNTP和高保真Taq酶来源于Takara公司。

2.引物设计

参照GenBank查找多个毒株，进行序列比对，根据比对结果设计出四对相对保守的特异引物，引物序列如表1所示：

表1

为避免产生非特异性反应，本发明所设计4对引物的Tm值相近，从而保证了可在相同的退火温度下对4个基因进行较好的扩增。

3.样品总DNA的提取

采集甘肃、宁夏等地猪场病猪的组织样品(心、肝、脾、肺和肾等)。取2-3mg新鲜组织，用高压灭菌过的石英砂和研钵充分研磨，加入适量TE Buffer(pH 8.0)，4℃浸泡过夜，2500r/min离心10min，取上清液。细胞毒及其他液体样本无需处理。

可使用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒依照试剂盒使用说明书进行样品总DNA的提取。将制得的部分样品总DNA溶解在灭菌水或TE(pH 8.0)中，浓度为1.3-3μg/mL。其余样品总DNA于-20℃保存备用。

也可利用Salah M.Aljanabi和Iciar mArtinez的方法进行样品总DNA的提取，具体操作如下：

1)取200μL组织样品研磨上清液或者细胞毒等液体样本置1.5mL eppendorf管中，加入400μLDNA提取缓冲液[0.4mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和2mmol/L EDTA(pH 8·0)]，充分混匀；

2)加入8μL20mg/mL蛋白酶K(终浓度为400μg/mL)，充分混匀，置于55-65℃水浴锅中温浴2小时；

3)加300μL6mol/L NaCl，在旋涡混合器上高速混合30秒，10000r/min离心30分钟，移上清至另一eppendorf管中；

4)加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1小时，然后10000r/min离心15分钟，弃上清；

5)用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。

将制得的部分样品总DNA溶解在灭菌水或TE(pH 8.0)中，浓度为1.3-3μg/mL。其余样品总DNA于-20℃保存备用。

4.四重PCR扩增

利用本发明试剂盒对如上所述获得的4个样品总DNA进行四重PCR扩增。所述试剂盒包括10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、阳性对照试样以及SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，其中10×PCR buffer包含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-Cl(pH8.3，室温下)和15mmol/L MgCl₂；dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP；Taq酶的浓度为5u/μL；SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物中各引物的浓度均为10μM；阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。反应总体系为20μL，各试剂的用量如表2所示：

表2

编号	10×PCRbuffer	dNTP	DMSO	Taq酶	引物	模板	灭菌水
								1	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	阳性对照试样4μL	7μL
2	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	样品1总DNA 4μL	7μL
								3	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	样品2总DNA 4μL	7μL
4	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	样品3总DNA 4μL	7μL
								5	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	样品4总DNA 4μL	7μL
6	2μL	2μL	1.5μL	0.5μL	3μL	灭菌水4μL	7μL

样品组2-5中各样品总DNA的浓度分别为2μg/mL。用阳性对照试样代替样品总DNA作为阳性对照1，用灭菌水代替样品总DNA作为空白对照6。

配好反应液后，高速离心10秒，将反应管置于扩增仪中，如下进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30-35个循环，72℃延伸10min。

本发明发明人发现由于伪狂犬病毒GC含量高达73％，利用常规10×PCR buffer对目的片段进行扩增存在着困难，而加入适量DMSO能增强对模板DNA的变性效果，使PCR扩增变得更加容易，扩增稳定且效率较高。

5.实验结果分析

本发明利用凝胶电泳对上文所述四重PCR扩增所得产物进行分析。

称取2.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液，加热溶解，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，加入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为约5mm。依据样品数选用合适的梳子，待凝胶冷却后拔出梳子以在胶中形成加样孔，将胶板放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。取5-8μLPCR扩增产物和2μL缓冲液混匀后加入一个加样孔中，每次电泳同时上样标准DNA Marker和空白对照。80V-100V电压或40mA-50mA电流电泳15min-25min。

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上观察。如图1所示，第1、2、3、4和5泳道分别对应于阳性对照1、样品组2、样品组3、样品组4和样品组5。阳性对照1的电泳结果为四条大小不一的条带，分别对应于657bp、490bp、372bp、298bp。空白对照6无扩增条带(没有示出)。样品组2的电泳结果出现了657bp大小的条带，而空白对照无扩增条带，可判定其中的样品1为PPV阳性。样品组3的电泳结果出现了490bp大小的条带，而空白对照无扩增条带，可判定其中的样品2为PCV2阳性。样品组4的电泳结果出现了372bp和298bp大小的条带，同时空白对照无扩增条带，可判定其中的样品3为PRV阳性。样品组5的电泳结果出现了657bp、490bp和372bp大小的条带，而没有出现298bp大小的条带，同时空白对照无扩增条带，可判定其中的样品4为PPV、PCV2和PRV疫苗毒阳性。

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒和方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

catgggccag catctacagg                                        20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgttggctcg ctccacggct                                        20

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gagaagggct gggttatggt atgg                                     24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acagcgcact tctttcgttt tcag                                     24

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agtactcgca ggggcgcaac t                                        21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgccgatctt ggtgtaggtg t                                        21

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gcccacgcac gaggactact acga                                            24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttaagcgggg cgggacatca acag                                            24

<210>9

<211>657

<212>DNA

<213>猪细小病毒

<400>9

catgggccag catctacagg aaaaagtata attgctcaac acattgcaaa cttagttggt     60

aatgttggtt gctacaatgc agccaatgtg aactttccat ttaatgactg tacaaataaa    120

aacttaatat ggattgaaga agcaggaaac ttctctaacc aagtaaacca attcaaagcc    180

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ccaactcctg taataatgac tacaaatgaa gacattacta aagttagagt aggatgcgag    300

gaaagaccag aacatacaca accaataaga gacagaatgt taaacataaa cctaaccaga    360

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gactctcaga tttccacatc agtgaaaact tcgccagcgg acaacaacta cgcagcaact    600

ccaatacagg aggacctgga tttagcttta gccttggagc cgtggagcga gccaaca       657

<210>10

<211>490

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型

<400>10

gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc ataggtgagg     60

gctgtggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cactggagcc cactcccctg    120

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agtgcgctgt                                                           490

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<211>372

<212>DNA

<213>猪伪狂犬病毒

<400>11

agtactcgca ggggcgcaac ttcacggagg ggatcgccgt gctcttcaag gagaacatcg     60

ccccgcacaa gttcaaggcc cacatctact acaagaacgt catcgtcacg accgtgtggt    120

ccgggagcac gtacgcggcc atcacgaacc gcttcacaga ccgcgtgccc gtccccgtgc    180

aggagatcac ggacgtgatc gaccgccgcg gcaagtgcgt ctccaaggcc gagtacgtgc    240

gcaacaacca caaggtgacc gccttcgacc gcgacgagaa ccccgtcgag gtggacctgc    300

gcccctcgcg cctgaacgcg ctcggcaccc gcggctggca caccaccaac gacacctaca    360

ccaagatcgg cg                                                        372

<210>12

<211>298

<212>DNA

<213>猪伪狂犬病毒

<400>12

gcccacgcac gaggactact acgacggcga cgacgacgac gacgacgagg aggcgggcgt     60

catccgccgg cggcccgcct cccccggcgg ggacagcggc tacgaggggc cgtacgcgag    120

cctggacccc gaggacgagt tcagcagcga cgaggacgac gggctgtacg tgcgccccga    180

gaaggcgccc cgctccggct tcgacgtctg gttccgcgat ccggagaaac cggaagtgac    240

gaatggaccc aactatggcg tgaccgccaa ccgcctgttg atgtcccgcc ccgcttaa      298

Claims (10)

1.一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10×PCRbuffer、dNTP、DMSO、Taq酶、阳性对照试样以及选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物、SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的5’端和/或3’端延长序列的引物混合物、与SEQ ID NO：1至SEQID NO：8序列同源性大于85％的序列的引物混合物或者与SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8序列碱基互补的序列的引物混合物中任一种的引物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述10×PCRbuffer包含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-Cl和15mmol/L MgCl₂，所述dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，所述Taq酶的浓度为5u/μL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述引物为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，各引物的浓度分别为10μM。

5.一种用于检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒及其混合感染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.提取样品总DNA；

b.使用权利要求1所述试剂盒分样品组、空白对照和阳性对照进行四重PCR扩增；

c.电泳；

d.实验结果分析。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述10×PCR buffer包含500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-Cl和15mmol/L MgCl₂，所述dNTP包含浓度各为25mmol/L的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，所述Taq酶的浓度为5u/μL。

7.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述阳性对照试样包含23.5μg/mL PPV、25μg/mL PCV2和20μg/mL PRV。

8.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中引物为SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：8序列的引物混合物，各引物的浓度为10μM。

9.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中：

样品组中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、样品总DNA和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL；

空白对照中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、灭菌水和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL；

阳性对照中10×PCR buffer、dNTP、DMSO、Taq酶、引物、阳性对照试样和灭菌水的体积分别为2μL、2μL、1.5μL、0.5μL、3μL、4μL和7μL。

10.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述步骤b中扩增的条件为95℃预变性5min，95℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30-35个循环，72℃延伸10min。

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