CN102676698A - Prv、pcv-2、ppv多重pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,它包括40μL等体积混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物,PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM,缓冲液600μL,阴性对照20μL,PCR酶250μL,超纯水170μL,50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。本发明针对PRV、PCV-2和PPV存在于同一反应体系的情况设计了3种引物,采用这3种引物制成的试剂盒,使用该试剂盒能同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒,而且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低,为猪传染病的防制提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒,尤其是一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒。
背景技术
随着规模化养猪的不断发展,当前猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)造成的繁殖障碍较为严重,并常常发生混合感染,给养猪业造成了巨大的经济损失。PRV、PCV-2和PPV的混合感染,仅根据临床症状较难进行鉴别诊断,而且PRV基因缺失疫苗的大规模应用,使野毒感染和疫苗接种的区分十分必要。目前,主要的检测方式有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法,而针对PRV基因缺失疫苗有gE-ELISA以区分野毒感染和疫苗接种。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别,而且常规的病原学和血清学检测方法,又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。
发明内容
本发明的目的是:提供一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,它可以同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒,特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低。
本发明是这样实现的:PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物,PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM,缓冲液600μL,阴性对照20μL,PCR酶250μL,超纯水170μL,50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL;PRV引物的目的基因为gE,PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1:5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’, PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2:5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ,片段大小为288bp;PCV-2引物的目的基因为ORF2,PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1:5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2:5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’,片段大小为419bp;PPV引物的目的基因为VP2,PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1:5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2:5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ,片段大小为681bp。
缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
阴性对照为超纯水。
阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。
PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/uL。
PRV引物的上游引物为PRV-1,下游引物为PRV-2、 PCV-2引物及PPV引物
为了验证本发明的效果进行了如下实验:
1 材料与方法
1.1 病毒和细菌
PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114、PRRSV美洲株 CH-1a株均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送;PRV(gE基因缺失Bartha-k61株)购自山东绿都生物科技有限公司;大肠杆菌为本研究室保存。
1.2 主要试剂
Goldview、Tris缓冲液、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase(5U/μL)及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物(大连)工程有限公司;TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。
1.3 引物设计
根据GenBank中登录的(PRV))gE、PCV-2 ORF2和PPV VP2基因组序列,应用DNAStar软件,设计了3对引物,用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段,引物的序列(见表1)。
1.4 病毒核酸的抽提
取待检样品肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg,加入500μl PBS缓冲液,待检样品研磨后-20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行,将提取的DNA和RNA于-70℃保存。
1.5 单一病毒PCR扩增
单一病毒的PCR反应在25 μL体系中进行,Primer1/2各2μL、10×TaqBuffer 5μL、dNTPmixture 4μL、Taq DNA polymerase0.5μL、ddH2O 加至25 μL,反应程序:94℃ 5 min;94℃ 30s,54℃(PPV)、55℃(PCV-2)、57℃(PRV)1 min,72℃ 1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min。取5μLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.6 多重PCR反应条件的优化
对多重PCR反应条件,包括退火温度(54~60℃),引物浓度(5~20 μmol/L),Taq DNA polymerase浓度(0.5~3.5 U)进行优化,以确定最佳反应条件,同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50 L反应体系中进行,10×Taq Buffer 10μL,dNTPmixture 8μL;Taq DNA polymerase 1μL,用双蒸水补足至50μL。反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 1 min,54~60℃ 1 min,72℃ 1min,30个循环;最后72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.7 敏感性试验
将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后,人为将3种病毒DNA混合,经5倍系列稀释的病毒核酸用于多重PCR反应;经10倍系列稀释的病毒核酸用于单一病毒的PCR反应。
1.8 特异性试验
以PRV、PCV-2、PPV、PRV(gE基因缺失株)、E.coli为模板分别进行多重PCR反应,CSFV和PRRSV反转录为cDNA进行多重PCR反应。
1.9 重复性试验
应用建立多重PCR诊断技术,重复检测PRV、PCV-2、PPV 单一病毒DNA或人为混合DNA样品3次以检验结果的可靠性。
1.10 多重PCR对临床样品的检测
对2009年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的87份病料进行检测。病毒核酸的抽提参照1.4,同时进行多重PCR和单一病毒PCR检测。
2 结果
2.1 PCR产物的鉴定
PRV、PCV-2、PPV的PCR扩增片段经胶回收,送大连宝生物工程有限公司测序,结果表明,扩增片段分别为各病毒的特异性条带。
2.2 多重PCR反应
多重PCR反应在50 μL反应体系中最佳反应条件为,退火温度55℃,Taq DNA polymerase1U,引物浓度10 μmol/L用各病毒的特异性引物均有效扩增出了其目的片段,分别为288bp(PRV),419 bp(PCV-2)、681bp(PPV),引物间无非特异性片段产生,如图1所示。
2.3 敏感性试验
在多重PCR反应中,病毒的最低检测量分别为PRV 48.2pg/L、PCV-2 36.7pg/L、PPV 0.25ng/L,如图2所示见。在单一病毒的PCR反应中,各病毒的最低检测量分别为,PRV 28.7pg/L、PCV-2 16.4pg/L、PPV 95.3pg/L,如图3、图4及图5所示。
2.4 特异性试验
以PRV(gE基因缺失株)、CSFV、PRRSV、E.coli为模板分别进行多重PCR反应均未扩增出条带,而PRV、PCV-2、PPV人为混合DNA均扩增出各病毒的特异性条带,如图6所示。
2.5 重复性试验
应用建立的多重PCR诊断技术,重复检测PRV、PCV-2、PPV 单一DNA或人为混合DNA样品3次,结果均一致。
2.6 多重PCR对临床样品的检测
利用建立的PRV、PCV-2和PPV多重PCR及单一病毒PCR方法对87份临床病料进行检测。87份病料中有63份PRV阳性,阳性率最高,为72.41%(63/87);35份PCV-2阳性,阳性率为40.22%(35/87);40份PPV阳性,为45.97%(40/87)。其中PRV、PCV-2和PPV三重感染10份;PRV和PPV双重感染33份;PRV、PCV-2双重感染17份;PPV、PCV-2双重感染11份。其结果与单一病毒PCR检测结果的符合率为100%。
3 结论
以上实验中的3种疾病病原均是DNA病毒,可见,本发明建立的多重PCR检测试剂盒可以在同一个反应体系中同时检测3种病毒,能够对临床样品中PRV、PCV-2和PPV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定,结果表明,该诊断方法敏感性好、特异性高,具有广阔的应用前景,在某种程度上还可以为研究这3种病毒之间在猪群中感染关系提供科学依据。
多重PCR中引物的设计至关重要,本发明设计的引物是针对3种猪病病毒各自相对保守的基因序列的,它们分别是PRV gE 基因、PCV-2 ORF2 基因、PPV VP2基因。在这3种DNA病毒中,PRV G + C含量较高,在设计引物时,PRV、PCV-2和PPV这3对引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增是多重PCR反应成功与否的关键。同时gE基因是猪伪狂犬病病毒的主要毒力相关基因,也是世界卫生组织所规定的基因缺失疫苗的缺失基因,猪伪狂犬病病毒gE基因缺失的PRV弱毒株在世界各国广泛使用。本发明为了区分伪狂犬病病毒野毒株和gE基因缺失疫苗株,根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物,成功地从猪伪狂犬病病毒全基因组中扩增出预期的288bp片段,而猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段,从而区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪。
通过临床病料检测结果显示,PRV、PCV-2和PPV混合感染,阳性率为11.49%,PRV、PCV-2和PPV混合感染除直接危害畜体外,更为严重的是造成机体免疫抑制,造成多种疫病继发感染,使病情加重、药物的有效性差,以及疫苗免疫接种失败,这也是今后猪病防制的重点。
由于采用了上述技术方案,本发明针对PRV、PCV-2和PPV存在于同一反应体系的情况设计了3种引物,采用这3种引物制成的试剂盒,使用该试剂盒能同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒,而且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低,为猪传染病的防制提供科学依据。本发明检测结果准确、特异,检测方式简单,使用效果好。
附图说明
附图1为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR ;
M: DL2000;1:PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物;2:PRV单一 PCR产物;3:PCV-2 单一PCR产物;4:PPV 单一PCR产物;5: 多重PCR空白对照;
附图2为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR敏感试验;
M: D2000;1~9:5-1~5-10稀释的病毒DNA PCR结果;
附图3为PRV 单一病毒PCR敏感试验;
M: D2000;1~9:10-1~10-8 稀释的病毒DNA PCR结果;
附图4为PCV-2 单一病毒PCR敏感试验;
M: D2000;1~9:10-1~10-8 稀释的病毒DNA PCR结果;
附图5为PPV 单一病毒PCR敏感试验;
M: D2000;1~9:10-1~10-8 稀释的病毒DNA PCR结果;
附图6为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR特异性试验;
M: DL2000;1:PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物;2:PRV 多重PCR产物;3:PCV-2 多重PCR产物;4:PPV 多重PCR产物;5: PRV(gE基因缺失株)多重PCR产物;6:CSFV多重PCR产物;7:PRRSV多重PCR产物;8:E.coli多重PCR产物。
具体实施方式
本发明的实施例:PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物,PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM,PRV引物的目的基因为gE,PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1:5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’, PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2:5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ,片段大小为288bp;PCV-2引物的目的基因为ORF2,PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1:5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2:5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’,片段大小为419bp;PPV引物的目的基因为VP2,PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1:5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2:5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ,片段大小为681bp;采用50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液600μ作为缓冲液,采用20μL超纯水作为阴性对照,250μL天根生化科技(北京)有限公司的PCR MasterMix产品的PCR酶,它组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/uL,超纯水170μL;50μL的MarkerDL2000;采用20μL重组pMD18-T-HBV-S质粒作为阳性对照。
Claims (5)
1.一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,其特征在于:它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物,PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM,缓冲液600μL,阴性对照20μL,PCR酶250μL,超纯水170μL,50μL的
Marker DL2000以及阳性对照20μL;PRV引物的目的基因为gE,PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1:5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’, PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2:5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ,片段大小为288bp;PCV-2引物的目的基因为ORF2,PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1:5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2:5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’,片段大小为419bp;PPV引物的目的基因为VP2,PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1:5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2:5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ,片段大小为681bp。
2.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,其特征在于:缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,其特征在于:阴性对照为超纯水。
4.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,其特征在于:阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。
5.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒,其特征在于:PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/uL。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |