CN102676698A

CN102676698A - Prv、pcv-2、ppv多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN102676698A
Application number: CN2012101534399A
Authority: CN
Inventors: 余波; 谭诗文; 冉懋韬; 徐景峨; 王璇; 李干洲; 艾玉萍
Original assignee: GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开了一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40μL等体积混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。本发明针对PRV、PCV-2和PPV存在于同一反应体系的情况设计了3种引物，采用这3种引物制成的试剂盒，使用该试剂盒能同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，而且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，为猪传染病的防制提供科学依据。

Description

PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒。

背景技术

随着规模化养猪的不断发展，当前猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）造成的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。PRV、PCV-2和PPV的混合感染，仅根据临床症状较难进行鉴别诊断，而且PRV基因缺失疫苗的大规模应用，使野毒感染和疫苗接种的区分十分必要。目前，主要的检测方式有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法，而针对PRV基因缺失疫苗有gE-ELISA以区分野毒感染和疫苗接种。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。

发明内容

本发明的目的是：提供一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它可以同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低。

本发明是这样实现的：PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL；PRV引物的目的基因为gE，PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1：5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’， PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2：5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ，片段大小为288bp；PCV-2引物的目的基因为ORF2，PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1：5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2：5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，片段大小为419bp；PPV引物的目的基因为VP2，PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1：5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2：5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ，片段大小为681bp。

缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。

PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的Poymerase/uL。

PRV引物的上游引物为PRV-1，下游引物为PRV-2、 PCV-2引物及PPV引物

为了验证本发明的效果进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1 病毒和细菌

PRV闽-1株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株F114、PRRSV美洲株 CH-1a株均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送；PRV（gE基因缺失Bartha-k61株）购自山东绿都生物科技有限公司；大肠杆菌为本研究室保存。

1.2 主要试剂

Goldview、Tris缓冲液、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。

1.3 引物设计

根据GenBank中登录的（PRV)）gE、PCV-2 ORF2和PPV VP2基因组序列，应用DNAStar软件，设计了3对引物，用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列（见表1）。

1.4 病毒核酸的抽提

取待检样品肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约100 mg，加入500μl PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于－70℃保存。

1.5 单一病毒PCR扩增

单一病毒的PCR反应在25 μL体系中进行，Primer1/2各2μL、10×TaqBuffer 5μL、dNTPmixture 4μL、Taq DNA polymerase0.5μL、ddH₂O 加至25 μL，反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30s，54℃（PPV）、55℃（PCV-2）、57℃（PRV）1 min，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.6 多重PCR反应条件的优化

对多重PCR反应条件，包括退火温度（54～60℃），引物浓度（5～20 μmol/L），Taq DNA polymerase浓度（0.5～3.5 U）进行优化，以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50 L反应体系中进行，10×Taq Buffer 10μL，dNTPmixture 8μL；Taq DNA polymerase 1μL，用双蒸水补足至50μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，54～60℃ 1 min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.7 敏感性试验

将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，人为将3种病毒DNA混合，经5倍系列稀释的病毒核酸用于多重PCR反应；经10倍系列稀释的病毒核酸用于单一病毒的PCR反应。

1.8 特异性试验

以PRV、PCV-2、PPV、PRV（gE基因缺失株）、E.coli为模板分别进行多重PCR反应，CSFV和PRRSV反转录为cDNA进行多重PCR反应。

1.9 重复性试验

应用建立多重PCR诊断技术，重复检测PRV、PCV-2、PPV 单一病毒DNA或人为混合DNA样品3次以检验结果的可靠性。

1.10 多重PCR对临床样品的检测

对2009年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的87份病料进行检测。病毒核酸的抽提参照1.4，同时进行多重PCR和单一病毒PCR检测。

2 结果

2.1 PCR产物的鉴定

PRV、PCV-2、PPV的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为各病毒的特异性条带。

2.2 多重PCR反应

多重PCR反应在50 μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，Taq DNA polymerase1U，引物浓度10 μmol/L用各病毒的特异性引物均有效扩增出了其目的片段，分别为288bp(PRV)，419 bp(PCV-2)、681bp(PPV)，引物间无非特异性片段产生，如图1所示。

2.3 敏感性试验

在多重PCR反应中，病毒的最低检测量分别为PRV 48.2pg/L、PCV-2 36.7pg/L、PPV 0.25ng/L，如图2所示见。在单一病毒的PCR反应中，各病毒的最低检测量分别为，PRV 28.7pg/L、PCV-2 16.4pg/L、PPV 95.3pg/L，如图3、图4及图5所示。

2.4 特异性试验

以PRV（gE基因缺失株）、CSFV、PRRSV、E.coli为模板分别进行多重PCR反应均未扩增出条带，而PRV、PCV-2、PPV人为混合DNA均扩增出各病毒的特异性条带，如图6所示。

2.5 重复性试验

应用建立的多重PCR诊断技术，重复检测PRV、PCV-2、PPV 单一DNA或人为混合DNA样品3次，结果均一致。

2.6 多重PCR对临床样品的检测

利用建立的PRV、PCV-2和PPV多重PCR及单一病毒PCR方法对87份临床病料进行检测。87份病料中有63份PRV阳性，阳性率最高，为72.41%（63/87）；35份PCV-2阳性，阳性率为40.22%（35/87）；40份PPV阳性，为45.97%（40/87）。其中PRV、PCV-2和PPV三重感染10份；PRV和PPV双重感染33份；PRV、PCV-2双重感染17份；PPV、PCV-2双重感染11份。其结果与单一病毒PCR检测结果的符合率为100％。

3 结论

以上实验中的3种疾病病原均是DNA病毒，可见，本发明建立的多重PCR检测试剂盒可以在同一个反应体系中同时检测3种病毒，能够对临床样品中PRV、PCV-2和PPV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，结果表明，该诊断方法敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景，在某种程度上还可以为研究这3种病毒之间在猪群中感染关系提供科学依据。

多重PCR中引物的设计至关重要，本发明设计的引物是针对3种猪病病毒各自相对保守的基因序列的，它们分别是PRV gE 基因、PCV-2 ORF2 基因、PPV VP2基因。在这3种DNA病毒中，PRV G + C含量较高，在设计引物时，PRV、PCV-2和PPV这3对引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增是多重PCR反应成功与否的关键。同时gE基因是猪伪狂犬病病毒的主要毒力相关基因，也是世界卫生组织所规定的基因缺失疫苗的缺失基因，猪伪狂犬病病毒gE基因缺失的PRV弱毒株在世界各国广泛使用。本发明为了区分伪狂犬病病毒野毒株和gE基因缺失疫苗株，根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列，设计合成引物，成功地从猪伪狂犬病病毒全基因组中扩增出预期的288bp片段，而猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段，从而区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪。

通过临床病料检测结果显示，PRV、PCV-2和PPV混合感染，阳性率为11.49%，PRV、PCV-2和PPV混合感染除直接危害畜体外，更为严重的是造成机体免疫抑制，造成多种疫病继发感染，使病情加重、药物的有效性差，以及疫苗免疫接种失败，这也是今后猪病防制的重点。

由于采用了上述技术方案，本发明针对PRV、PCV-2和PPV存在于同一反应体系的情况设计了3种引物，采用这3种引物制成的试剂盒，使用该试剂盒能同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，而且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，为猪传染病的防制提供科学依据。本发明检测结果准确、特异，检测方式简单，使用效果好。

附图说明

附图1为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR ；

M: DL2000；1：PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物；2：PRV单一 PCR产物；3：PCV-2 单一PCR产物；4:PPV 单一PCR产物；5: 多重PCR空白对照；

附图2为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR敏感试验；

M: D2000；1～9：5^－1～5^－10稀释的病毒DNA PCR结果；

附图3为PRV 单一病毒PCR敏感试验；

M: D2000；1～9：10^-1～10^-8 稀释的病毒DNA PCR结果；

附图4为PCV-2 单一病毒PCR敏感试验；

M: D2000；1～9：10^-1～10^-8 稀释的病毒DNA PCR结果；

附图5为PPV 单一病毒PCR敏感试验；

M: D2000；1～9：10^-1～10^-8 稀释的病毒DNA PCR结果；

附图6为PRV、PCV-2和PPV多重 PCR特异性试验；

M: DL2000；1：PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物；2：PRV 多重PCR产物；3：PCV-2 多重PCR产物；4:PPV 多重PCR产物；5: PRV（gE基因缺失株）多重PCR产物；6：CSFV多重PCR产物；7：PRRSV多重PCR产物；8：E.coli多重PCR产物。

具体实施方式

本发明的实施例：PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，PRV引物的目的基因为gE，PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1：5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’， PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2：5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ，片段大小为288bp；PCV-2引物的目的基因为ORF2，PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1：5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2：5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，片段大小为419bp；PPV引物的目的基因为VP2，PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1：5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2：5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ，片段大小为681bp；采用50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液600μ作为缓冲液，采用20μL超纯水作为阴性对照，250μL天根生化科技（北京）有限公司的PCR MasterMix产品的PCR酶，它组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的Poymerase/uL，超纯水170μL；50μL的MarkerDL2000；采用20μL重组pMD18-T-HBV-S质粒作为阳性对照。

Claims

1.一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，其特征在于：它包括40μL等体积混合的PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、 PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的

Marker DL2000以及阳性对照20μL；PRV引物的目的基因为gE，PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1：5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’， PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2：5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ，片段大小为288bp；PCV-2引物的目的基因为ORF2，PCV-2引物的上游引物序列号为PCV-1：5’ –GGATTGTATGGCGGGAGG–3’、 PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2：5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，片段大小为419bp；PPV引物的目的基因为VP2，PPV引物的上游引物的序列号为PPV-1：5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’、 PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2：5’ –TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’ ，片段大小为681bp。

2.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，其特征在于：缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。

4.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。

5.根据权利要求1所述的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，其特征在于：PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的Poymerase/uL。