CN102399909B - 一种检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp可视化试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒及其应用。该可视化试剂盒包含引物组和显色物质；引物为如SEQ ID NO：1～4所示的序列，显色物质为钙黄绿素和氯化锰。该试剂盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反应体系，包含AMV逆转录酶、1倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰、MgSO₄、FIP引物、BIP引物组、F3引物、B3引物以及待测样品RNA；接着将反应体系于61～65℃恒温反应，灭活；通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：在自然光下反应产物为绿色，说明待测样品含有日本乙型脑炎病毒；在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品含有日本乙型脑炎病毒。

Description

一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒及其应用。

背景技术

日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其所导致的日本乙型脑炎是一种中枢神经系统性人畜共患的急性传染病。据估计，每年全球大约有50000人感染JEV，大约有15000例死亡，死亡率30％左右；同时JEV是严重危害养猪业的重要病毒之一，给养猪业造成巨大的经济损失，极大的限制肉产品的出口创汇。2008年我国农业部将猪日本乙型脑炎病归于二类动物疫病。

该病于19世纪70年代在日本首次报道，并于1924年首次分离到日本乙型脑炎病毒。中国是在1938～1940年间采用血清学和病毒分离的方法确诊了日本乙型脑炎病例，于1949年在北京首次分离到该病毒。自20世纪90年代以来，该病的流行区域有所扩大，目前该病的分布区北起俄罗斯西伯利亚、日本北海道，南到澳大利亚，东到美国关岛，西到印度西海岸。亚洲是JEV发病人数最多的地区，我国又占了其中的大多数。

目前常用于检测乙脑病毒的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和RT-PCR。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较麻烦；而RT-PCR技术需要特殊的仪器设备(如PCR仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediatedisothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratorysyndrome coronavirus.Clin Microbiol，2004May；42(5)：1956-61)于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(Rapid diagnosis ofH5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.VirolMethods.2007May；141(2)：173-80.)于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。

发明内容

本发明首要目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒。

本发明的另一目的在于提供实现上述检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒的使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，包含引物组和显色物质；

所述的引物组如下所示：

F3：5’-GGGCAACGGATGTGGATTT-3’；

B3：5’-GTTTGAGGGCTACCGAAGGA-3’；

FIP：5’-TGTTTTCTGGCTGGATTGTTCTCCTTTGGGAAGGGAAGCATTGACAC-3’；

BIP：5’-TTTTGTGCATGGAACCACCACTTCTTTGTAAACTTTGCCGCCTGGG-3’；

所述的显色物质为钙黄绿素(Calcein)和氯化锰(MnCl₂)；

所述的试剂盒还优选包含dNTP混合物、MgSO₄、10倍反应缓冲液(10×ThermoPol Reaction Buffer)、链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)、甜菜碱(Betaine)和AMV逆转录酶；

所述的试剂盒更优选为包含5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液(10×ThermoPol Reaction Buffer)、8U/L的链置换DNA聚合酶、2.5mmol/L的dNTP、10mol/L的甜菜碱(Betaine)、250μmol/L的Calcein、25mmol/L的MnCl₂、4mmol/L的MgSO₄、10μmol/L引物FIP、10μmol/L引物BIP、10μmol/L引物F3和10μmol/L引物B3；

所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为10⁵U/L、10倍反应缓冲液(10×ThermoPol Reaction Buffer)为1×/L、链置换DNA聚合酶0.32U/L、dNTP混合物为0.4mmol/L、甜菜碱(Betaine)为1～2mol/L、Calcein为25μmol/L、MnCl₂为0.5mmol/L、MgSO₄为4～6mmol/L、FIP引物为0.8μmol/L、BIP引物组为0.8μmol/L、F3引物为0.2μmol/L以及B3引物为0.2μmol/L；待测样品RNA为3～5g/L；

(2)反应：将步骤(1)配制好的反应体系反应，条件为61～65℃恒温反应，灭活；

(3)结果判读：通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：

①在自然光下反应产物为绿色，说明待测样品含有日本乙型脑炎病毒；在自然光下反应产物为橙色，说明待测样品不含有日本乙型脑炎病毒；

②在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品含有日本乙型脑炎病毒，无荧光或绿色荧光不明显，说明待测样品含有日本乙型脑炎病毒。

步骤(1)中所述的甜菜碱的终浓度优选为1mol/L；

步骤(1)中所述的MgSO₄的终浓度优选为4mmol/L；

步骤(2)中所述的恒温反应的时间优选为50～120min；

步骤(2)中所述的恒温反应的条件优选为64℃反应80min；

步骤(2)中所述的灭活的条件优选为75～86℃处理2～10min；更优选为80℃处理4min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNA polymerase在64℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的试剂盒使用成本低。

(2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无需增加42℃1h的反转录过程，可以在90min内完成反应，最快可以在17min内完成。

(3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果易于观察，LAMP在DNA扩增过程中产生大量焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳即可直接肉眼观察反应管中浑浊来判断阳性与否，如果在反应前加入钙黄绿素和氯化锰，阳性反应管在自然光下就会呈现出绿色，置于紫外光下则呈现强烈的绿色荧光。

(4)本发明提供的试剂盒特异性好，对黄病毒属内的猪瘟病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到10pg的RNA模板，即使是几个病毒粒子，也能被快速准确的检测出来。

(5)本发明所述的可视化RT-LAMP试剂盒可快速、灵敏地检测日本乙型脑炎病毒，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1为LAMP反应体系优化结果图，其中：

A为不同MgSO₄浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1为MgSO₄浓度为2mM反应的产物，泳道2为MgSO₄浓度为4mM反应的产物，泳道3为MgSO₄浓度为6mM反应的产物，泳道4为MgSO₄浓度为8mM反应的产物，泳道5为阴性对照组；

B为不同Betaine浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为阴性对照组，泳道2为Betaine浓度为0.5M反应的产物，泳道3为Betaine浓度为1.0M反应的产物，泳道4为Betaine浓度为1.5M反应的产物，泳道5为Betaine浓度为2.0M反应的产物；泳道6为Betaine浓度为2.5M反应的产物；

C为不同内外引物浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1内外引物浓度比为2∶1，泳道2内外引物浓度比为4∶1，泳道3内外引物浓度比为6∶1，泳道4内外引物浓度比为8∶1，泳道5为阴性对照组。

图2为LAMP反应条件优化结果图，其中：

A为不同温度下反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为反应温度为65℃的产物，泳道2为反应温度为64℃的产物，泳道3为反应温度为63℃的产物，泳道4为反应温度为62℃的产物，泳道5为反应温度为61℃的产物，泳道6为阴性对照组；

B为不同反应时间下的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为阴性对照组，泳道2为反应时间为50min的产物，泳道3为反应时间为70min的产物，泳道4为反应时间为80min的产物，泳道5为反应时间为100min的产物，泳道6为反应时间为120min的产物。

图3为本发明提供的可视化RT-LAMP试剂盒的特异性结果图，其中：

泳道M为DNA Marker DL2000；

泳道1是以JEV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；

泳道2是以CSFV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；

泳道3是以PRRSV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；

泳道4是以PPV基因组为模板的LAMP反应产物；

泳道5是以PRV基因组为模板的LAMP反应产物；

泳道6为阴性对照。

图4为RT-LAMP和RT-PCR的灵敏度检测结果图，其中：

A为利用本发明提供的可视化RT-LAMP试剂盒得到的产物在紫外线照射下得到的图；

B为利用本发明提供的可视化RT-LAMP试剂盒得到的产物在日光照射下得到的图；

C为利用RT-PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；

图中均为：

1的模板为JEV RNA进行10倍稀释；

2的模板为JEV RNA进行10²倍稀释；

3的模板为JEV RNA进行10³倍稀释；

4的模板为JEV RNA进行10⁴倍稀释；

5的模板为JEV RNA进行10⁵倍稀释；

6为阴性对照。

图5为RT-LAMP是可视化结果图，其中：

A为在紫外灯下观察反应体系，B为在自然光下观察反应体系；

图A和图B中，“+”表示反应呈现阳性结果，“-”表示反应呈现阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；BstDNA聚合酶大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、钙黄绿素(Calcein)、MnCl₂和MgSO₄购自Sigma公司。

实施例1

一、引物设计

根据LAMP引物设计原则，针对JEV基因的保守区域序列，用primer 5.0设计一套引物(如表1所示)，包括1对外部引物(F3和B3)和1对内部引物(FIP和BIP)。FIP由F1c(F1的互补序列)、TTT连接和F2序列组成；BIP由B1c(B1的互补序列)、TTT连接和B2序列组成。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成10pmol/μL溶液，-20℃保存。

AAGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCACTGACATCTCGACGGTGGCTCGGTGCCCCACGAC

TGGAGAAGCCCACAACGAGAAGCGAGCTGATAGTAGCTATGTGTGCAAACAAGGCTTC

ACTGACCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGATTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGACACAT

                    F3                     F2

GTGCAAAATTCTCCTGCACCAGTAAAGCGATTGGGAGAACAATCCAGCCAGAAAACAT

                                         F1

CAAATACAAAGTTGGCATTTTTGTGCATGGAACCACCACTTCGGAAAA

GAATT

                            B1c                   Ncol

ATTCAGCGCAAGTTGGGGCGTCCCAGGCGGCAAAGTTTACAGTAACACCCAATGCTCCT

                            B2c

TCGGTAGCCCTCAAACTTGGTGACTACGGAGAAGTCACACTGGACTGTGAGCCAAGGA

      B3

GTGGACTGAACACTGAAGCG；

下划线标示的为引物在基因中的位置，框中的是酶切位点。

表1 JEV可视化RT-LAMP的引物

二、RT-LAMP反应

1、病毒RNA的抽提：

取日本乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2(猪乙型脑炎活疫苗，武汉科前动物生物制品有限责任公司)。使用Trizol Reagent抽提RNA，按照以下步骤进行抽提：

(1)将250μL液体样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL冰预冷的RNAiso Reagent(TaKaRa)；

(2)将样品剧烈混匀后，在室温静置5min；

(3)加入250μL氯仿，剧烈振荡10s，使液体充分混匀呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5min；

(4)在4℃条件下，以12000r/min离心15min；

(5)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4℃条件下静置10～15min；

(6)在4℃条件下，以12000r/min离心15min，小心并尽可能去掉上清；

(7)用1mL体积百分比75％的乙醇溶液洗涤RNA沉淀和管壁，在4℃条件下，以12000r/min离心8min，然后小心弃去乙醇；

(8)将RNA沉淀进行干燥(不能完全干燥)处理后，用10μL RNase-free水将RNA溶解，加入0.5μLRNA酶抑制剂(TaKaRa公司)(40U)，-80℃冰箱中储存备用。

2、RT-LAMP检测体系的建立：

参照Notomi等(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28：E63)提供的方法构建25μL RT-LAMP反应体系，依次对MgSO₄、Betaine、内外引物浓度比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。

通过设置不同终浓度的MgSO₄：2mM、4mM、6mM、8Mm；其他成分的用量如表2所示(结果如图1A所示)；不同终浓度的Betaine：0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M)；其他成分的用量如表2所示(结果如图1B所示)；不同终浓度的内外引物浓度比例：2∶1，4∶1，6∶1，8∶1(内引物为BIP+FIP，外引物为B3+F3)，此时具体的引物浓度比为：0.2μM∶0.1μM，0.4μM∶0.1μM，0.6μM∶0.1μM，0.8μM∶0.1μM，其他成分的用量如表2所示(结果如图1C所示)。检测条件为64℃恒温80min，80℃灭活4min，然后终止反应。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系(25μL)如表2所示。

表2优化的检测体系

3、RT-LAMP检测条件的优化

为了得到最优化的反应温度，将LAMP反应分别置于61℃、62℃、63℃、64℃及65℃，反应时间是90min，反应体系如表2所示。从多次重复试验中确定最佳反应温度(结果如图2A所示)，图2A的结果说明最佳反应温度为64℃。

以最佳反应温度(64℃)，将反应时间按50min、70min、80min、100min及120min递增，反应体系如表2所示，从多次重复试验中确定最佳反应时间。每次扩增反应同时设DEPC处理的水为阴性对照(结果如图2B所示)，图2B的结果说明最佳反应时间是80min。优化后的检测条件为64℃恒温80min，80℃灭活4min，然后终止反应

4、检测体系特异性、灵敏性分析

使用日本乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2、猪瘟病毒GXW-07(猪瘟病毒感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及TNF-α和IFN-γ的影响.中国预防兽医学报，2011，33(2)：126-129)、猪繁殖与呼吸综合征病毒GD08-1(猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析.华南农业大学学报，2010，31(2)：108-112)、猪细小病毒(猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗，上海海利生物科技有限公司)、伪狂犬病毒(伪狂犬病活疫苗，上海海利生物科技有限公司)为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，结果如图3所示，结果显示检测体系的特异性良好，可特异地检测到日本乙型脑炎病毒。

从250μL日本乙型脑炎病毒液中提取病毒总RNA，在紫外分光光度计上测定其RNA含量(100ng/μL)，将RNA样品进行10倍梯度稀释，将稀释后的样品分别进行RT-LAMP(反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件)和RT-PCR(RT-PCR所使用的引物是P1：5′-ACAGTCCGTTGTTGCTCTTG-3′；P2：5′-GGTGGTTGATCTGCTTGTC-3′)取抽提的RNA溶液10μL，置于经DEPC处理过的离心管中，再依次加入反转录的其它成分进行反转录。具体反转录体系如表3所示：

表3

混匀后使用LX-100手掌型离心机瞬时离心，使液体集中于管底，置42℃水浴中，反应1小时。

反转录结束后，以该cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR，具体体系及程序表4所示：

表4

PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃45s，51℃40s，72℃45s为一个循环，运行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

比较两种检测方法的灵敏度，如图4所示，结果显示可视化RT-LAMP与RT-PCR能检测到的JEV基因组RNA的极限相似，最低可以检测到10pg的JEVRNA。可见，本发明提供的可视化RT-LAMP灵敏，而且用时更短，操作更加简单，结果比较直观，易于检测，无需电泳。

4、检测体系的结果鉴定

在自然光或者紫外灯下，肉眼可以直接观察RT-LAMP反应的产物。如图5-A所示，在紫外灯下可视化RT-LAMP阳性反应可以发出非常强烈的绿色荧光，而阴性反应几乎没有荧光；如图5-B所示，在自然光下，可视化RT-LAMP阳性反应产物为绿色，而阴性对照为橙色。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于包含引物组和显色物质；

所述的引物组如下所示：

F3：5’-GGGCAACGGATGTGGATTT-3’；

B3:5’-GTTTGAGGGCTACCGAAGGA-3’；

FIP:5’-TGTTTTCTGGCTGGATTGTTCTCCTTTGGGAAGGGAAGCATTGACAC-3’；

BIP:5’-TTTTGTGCATGGAACCACCACTTCTTTGTAAACTTTGCCGCCTGGG-3’；

所述的显色物质为钙黄绿素和氯化锰。

2.根据权利要求1所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含dNTP混合物、MgSO₄、10倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱和AMV逆转录酶。

3.根据权利要求2所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、8U/L的链置换DNA聚合酶、2.5mmol/L的dNTP、10mol/L的甜菜碱、250μmol/L的钙黄绿素、25mmol/L的氯化锰、4mmol/L的MgSO₄、10μmol/L引物FIP、10μmol/L引物BIP、10μmol/L引物F3和10μmol/L引物B3。

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