CN103602761B - 检测猪瘟病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反应体系，包含AMV逆转录酶、1倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、MgSO4、FIP引物、BIP引物、Probe杂交探针、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待测样品RNA；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，易于大范围推广应用。

Description

检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。
背景技术
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高发病率和高死亡率的烈性传染病，感染过程可分为急性、亚急性、慢性、迟发性等多种。CSF急性病例多见于流行初期，主要表现为突然发病，皮肤、粘膜发绀，全身痉挛；初便秘，后腹泻。后期出现步态不稳，随后麻痹，倒地死亡。毒力较低的CSFV毒株可引起亚急性CSF或温和性CSF，症状比较轻。妊娠母猪感染后出现“带毒母猪综合征”，发生流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪死亡，耐过的猪终身带毒。猪瘟在世界范围内流行，是动物卫生组织要求申报的动物传染病之一。
该病1833年首次出现于美国的俄亥俄洲，现在遍布全世界。发达国家通常采取扑杀政策防止和消灭猪瘟，澳大利亚、加拿大、爱尔兰、新西兰、瑞士和美国等国家都陆续宣布消灭了猪瘟，但近年来欧洲一些已消灭猪瘟的国家又出现有猪瘟的报道。在我国，猪瘟流行呈现典型和非典型共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。我国自50年代中期以来，一直使用CSF兔化弱毒疫苗免疫控制CSF的大规模爆发流行。但是近半个世纪以来，CSF在我国仍屡禁不止，对畜产品造成的损失是无可估量的。
CSFV为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约1.23×104kb，仅含有一个大的开放读码框架（ORF）。整个ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒Npro蛋白和细胞的蛋白酶裂解，形成4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）以及至少7个非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。结构蛋白组装成熟的病毒粒子与病毒的感染和诱导机体的免疫应答反应有密切关系，而非结构蛋白则对病毒基因组复制、病毒粒子的组装成熟起调控作用。
目前常用于检测猪瘟病毒的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和RT-PCR、荧光定量PCR。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较复杂；而RT-PCR、荧光定量PCR技术需要特殊的仪器设备（如PCR仪和凝胶成像系统等）和专业人员进行相关的操作，对于在基层和现场检测有局限性。因此建立一种快速，敏感，特异的检测猪瘟病毒的方法是十分必要的。
日本学者Notomi等（2000）建立了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP），其原理是在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，即正向内侧引物（Forward inner primer,FIP）、正向外侧引物（Forwardouter primer,F3）、反向内侧引物（Backward inner primer,BIP）、反向外侧引物（Backward outer primer,B3），在60～65℃等温条件下高效特异地扩增目的基因，终产物是具有与目的基因反相重复序列的茎环DNA。Hong TC等人（Developmentand evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapiddetection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol,2004May；42(5):1956-61）于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection by newly developedinfluenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplificationmethod.Virol Methods.2007May;141(2):173-80.）于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。实现了一步法检测病毒RNA的方法，大大节省了检测时间。反应结果可通过肉眼观察，或者通过浊度仪检测反应过程中获得的副产品焦磷酸镁所形成的白色沉淀的混浊度来判定，但是浊度仪造价比较昂贵且不方便携带。有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。故又发明了在反应管中加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，对反应产物实时监测，实现了可视化LAMP,但此方法对弱阳性的判断不够准确。
发明内容
本发明首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒。该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单等优点。
本发明的另一目的在于提供实现上述检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-GGAAAGGGCAAAGAGGCA-3’；
B3：5’-CGAGAGCCCTTTCTGTGATC-3’；
FIP：5’-CCTCGCAGAAGGCGTAAACCAT-GTGGACAACCTGACACAAGC-3’；
BIP：5’-ACGGGAGTACCCTACAAGAGCT-AACCATCATCCCCGCACA-3’；
LoopB：5’-FITC-GACAGGGTGGCAAAAATTCATG-3’；
Probe：5’-CCACGGGAGTACCCTACAAGAG-Biotin-3’；
所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；
所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；
所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；
所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，还包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、甜菜碱（Betaine）溶液和AMV逆转录酶；
所述的试剂盒更优选为包含浓度为5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液（10×ThermoPol Reaction Buffer）、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO4溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的探针Probe和浓度为10μmol/L的引物LoopB；
所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：
（1）配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液（10×ThermoPol Reaction Buffer）为1倍（1×）、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4～0.6mmol/L、甜菜碱为1～2mol/L、MgSO4为0～3mmol/L、FIP引物为1.6μmol/L、BIP引物为1.6μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、探针Probe为1.2μmol/L、LoopB引物为1.2μmol/L，待测样品RNA为12ng/μL；恒温反应；
（2）反应：将步骤（1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；
（3）结果判读：直接肉眼判读
①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪瘟病毒感染；
②阳性（＋）：出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内，证明所检测的样本为猪瘟病毒感染；
③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。
步骤（1）中所述的dNTP混合物的终浓度优选为0.5mmol/L；
步骤（1）中所述的甜菜碱的终浓度优选为1.5mol/L；
步骤（1）中所述的MgSO4的终浓度优选为3mmol/L；
步骤（2）中所述的恒温反应的时间优选为30～60min；
步骤（2）中所述的恒温反应的条件优选为60℃反应50min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
（1）RT-LAMP核酸试纸条检测方法成本低廉，利用Bst DNA polymerase在60℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒使用成本低。
（2）本发明所提供的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无需增加42℃1h的反转录过程，可以在60min内完成反应，最快可以在30min内完成。
（3）本发明提供的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒得到的反应结果易于观察，虽然LAMP在DNA扩增过程中产生大量焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳即可直接肉眼观察反应管中浑浊来判断阳性与否，但弱阳性结果仍给判别带来较大困难。如果在环引物5’端进行特异性生物标记，对探针3’端进行特异性标记，探针与反应产物杂交。然后再用核酸检测试纸条对产物进行检测，既可以准确对结果进行快速判读，又可以防止污染。
（4）本发明提供的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒特异性好，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到30pg的RNA模板，与RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳和钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的检测限一致，比普通RT-PCR方法的灵敏度高10倍（即检测限低10倍）。即使是几个病毒粒子，也能被快速准确的检测出来。
（5）本发明所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒可快速、灵敏地检测猪瘟病毒，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为RT-LAMP反应检测体系优化结果图，其中：
A为dNTP不同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应dNTP终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM得到的反应产物；
B为甜菜碱不同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～5依次对应甜菜碱终浓度分别为0M、0.5M、1.0M、1.5M和2M得到的反应产物；
C为MgSO4不同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～5依次对应MgSO4终浓度分别为0mM、1mM、2mM、3mM和4mM得到的反应产物；
D为内引物（FIP+BIP）与外引物（F3+B3）不同浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应内引物和外引物按终浓度比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1和12:1得到的反应产物，其中，外引物终浓度为0.2μmol/L；
E为环引物（LoopF+LoopB）与外引物（F3+B3）不同浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应环引物和外引物按终浓度比为0:1、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1得到的反应产物，外引物终浓度为0.2μmol/L。
图2为RT-LAMP反应检测条件优化结果图，其中：
A为不同温度下RT-LAMP反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1～8依次对应反应温度为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃和66℃的产物；
B为不同反应时间下RT-LAMP反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～7依次对应反应时间为10min、20min、30min、40min、50min、60min和70min的产物。
图3为检测本发明试剂盒特异性的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：
泳道M为DNA Marker DL2000；泳道1是以CSFV疫苗株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道2是以CSFV石门株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道3是以JEV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道4是以PRRSV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道5是以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组为模板的LAMP反应产物；泳道6是以PRV基因组为模板的LAMP反应产物；泳道7是以PCV-2基因组为模板的LAMP反应产物。
图4为RT-LAMP和RT-PCR的灵敏度检测结果图，其中：
A为紫外条件下钙黄绿素法对本发明提供的RT-LAMP产物检测的结果图；
B为利用本发明试剂盒得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的结果图；
C为利用RT-PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；
图中均为：1的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行10倍稀释；2的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行102倍稀释；3的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行103倍稀释；4的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行104倍稀释；5的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行105倍稀释；6的模板为CSFV RNA标准品（10ng/μL）进行106倍稀释；7为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；BstDNA聚合酶大片段购自New England公司；甜菜碱（Betaine）和MgSO4购自Sigma公司；Trizol、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、随机引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP（2.5mM）、琼脂糖购自Takara公司；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司（货号：20120420-32）。
实施例1
一、引物设计
根据LAMP引物设计原则，针对CSFV NS5B基因的保守区域序列，根据LAMP引物的设计原则，应用在线引物设计软件PrimerExporer4.0设计引物三套，如表1所示（此时，引物未进行Biotin和FITC标记），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，-20℃避光保存。对这三套引物分别进行反应温度优化后，在各自最优反应温度下进行反应时间的优化，并对三套引物的反应时间优化结果进行比较，反应体系如表2所示，引物使用各套引物中相对应的引物。第一套引物的最优反应温度为60℃，反应60min产物量即可达到最高。第二套引物的最优反应温度为61℃，反应时间为80min才有产物形成。第三套引物的最优反应温度为61℃，反应为90min才有产物形成。通过筛选，得到反应时间最短的第一套引物（如表1所示），包括1对外部引物（F3和B3）、1对内部引物（FIP和BIP）和环引物（LoopB）。FIP由F1c（F1的互补序列）和F2序列组成；BIP由B1c和B2（B2c的互补序列）组成。由上海生工生物工程技术服务有限公司分别对第一套引物中的FIP引物的5’端进行Biotin（生物素）标记，再分别对BIP引物和LoopB引物的5’端进行FITC（异硫氰酸荧光素）标记。对FIP和BIP引物标记组和FIP和LoopB引物标记组分别进行RT-LAMP的空白样品试验，产物用核酸试纸条进行检测。结果发现FIP和BIP引物标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阳性，而FIP和LoopB引物标记组的空白样品也呈阳性。所以选择设计探针标记。对所设计的探针Probe的3’端进行Biotin（生物素）标记，再对LoopB引物5’端进行FITC（异硫氰酸荧光素）标记。对标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阴性。所以LoopB引物的5’端进行FITC（异硫氰酸荧光素），Probe3’端Biotin（生物素）标记为最佳标记方式（如表1所示）。
表1
面对第一套引物的设计进行详细描述（如下序列为CSFV NS5B基因部分序列，Genbank号：EU915211.1）：F3序列的位置如下所示，B3为B3c的反向互补序列；FIP由F1c（F1的反向互补序列）和F2序列组成；BIP由B1c和B2（B2c的反向互补序列）组成；LoopB与B4c序列相同；探针序列如图Probe所示
二、RT-LAMP反应（使用表1中第一套引物进行以下试验）
1、病毒RNA的抽提：
取本实验室保藏CSFV石门株（Xiao-Ying Dong,Wen-Jun Liu,Ming-QiuZhao,Jia-Ying Wang,Jing-Jing Pei,Yong-Wen Luo,Chun-Mei Ju and Jin-Ding Chen.Classical swine fever virus triggers RIG-I and MDA5-dependent signaling pathwayto IRF-3and NF-κB activation to promote secretion of interferon and inflammatorycytokines in porcine alveolar macrophages.Virology Journal,2013,10:286），使用Trizol Reagent抽提RNA，按照以下步骤进行抽提：
（1）将250μL液体样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL冰预冷的RNAiso Reagent（TaKaRa）；
（2）将样品剧烈混匀后，在室温静置5min；
（3）加入250μL氯仿，剧烈振荡10s，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5min；
（4）在4℃条件下，以12000r/min离心15min；
（5）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4℃条件下静置10～15min；
（6）在4℃条件下，以12000r/min离心15min，小心并尽可能去掉上清；
（7）用1mL体积百分比75%的乙醇溶液洗涤RNA沉淀和管壁，在4℃条件下，以12000r/min离心8min，然后小心弃去乙醇；
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL RNase-free水将RNA溶解，加入0.5μL RNA酶抑制剂（TaKaRa公司）（40U），-80℃冰箱中储存备用。
2、RT-LAMP检测体系的建立：
参照Notomi等（Notomi，T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,et al.Loop-mediatedisothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28:E63）提供的方法构建25μL RT-LAMP反应体系，依次对dNTP、甜菜碱、MgSO4、内外环引物浓度比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶（质量体积比2%）电泳检测。
通过设置不同终浓度的dNTP：0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1A所示）；不同终浓度的甜菜碱：0M、0.5M、1.0M、1.5M、2M，其他成分的用量如表2所示（结果如图1B所示）；不同终浓度的MgSO4：0mM、1mM、2mM、3mM、4mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1C所示）；不同终浓度的内外引物浓度比例（内引物为BIP+FIP按摩尔比1:1配比得到，外引物为B3+F3按摩尔比1:1配比得到）：2:1、4:1、6:1、8：1、10:1、12：1，此时具体的引物终浓度比为：0.4μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.2μM:0.2μM、1.6μM:0.2μM、2.0μM:0.2μM、2.4μM:0.2μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1D所示）；不同终浓度的环引物（环引物为LoopB）与外引物浓度比例：0：1、1:1、2:1、4:1、6:1，8:1，此时具体的引物终浓度比为：0μM:0.2μM、0.2μM:0.2μM、0.4μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.2μM:0.2μM、1.6μM：0.2μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1E所示）。检测条件为60℃恒温60min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系（25μL）如表2所示。
表2优化的检测体系
3、RT-LAMP检测条件的优化
为了得到最优化的反应温度，将RT-LAMP反应分别置于59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反应时间是60min，反应体系如表2所示。从多次重复试验中确定最佳反应温度，通过质量体积比2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2A所示，说明最佳反应温度为60℃。
以最佳反应温度（60℃），将反应时间按10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min递增，反应体系如表2所示，从多次重复试验中确定最佳反应时间（结果如图2B所示），图2B的结果说明最佳反应时间是50min。优化后的检测条件为60℃恒温50min。
4、检测体系特异性、灵敏性分析
使用猪瘟病毒（CSFV）石门株（Xiao-Ying Dong,Wen-Jun Liu,Ming-Qiu Zhao,Jia-Ying Wang,Jing-Jing Pei,Yong-Wen Luo,Chun-Mei Ju and Jin-Ding Chen.Classical swine fever virus triggers RIG-I and MDA5-dependent signaling pathwayto IRF-3and NF-κB activation to promote secretion of interferon and inflammatorycytokines in porcine alveolar macrophages.Virology Journal,2013,10:286）和猪瘟病毒（CSFV）疫苗株GXW-07（猪瘟病毒感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及TNF-α和IFN-γ的影响.中国预防兽医学报，2011,33（2）：126-129）、日本乙型脑炎病毒（JEV）GZ0409-31株（乔进平,赵明秋,张学涛,等.猪乙型脑炎病毒3种灭活疫苗的制备及免疫效果比较[J].华南农业大学学报,2011,32(2):85-88.）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GD08-2株（猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析.华南农业大学学报,2010,31(2)：108-112）、传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组（猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗，武汉科前生物技术有限公司）、伪狂犬病毒（PRV）（伪狂犬病毒活疫苗，上海海利生物科技有限公司）、猪圆环病毒2型（PCV-2）（猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗，上海海利生物科技有限公司）为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置以及浓度为质量体积比2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测（10min后看结果），得到的结果为：以CSFV石门株基因组为模板的RT-LAMP反应产物和以CSFV疫苗株基因组为模板的RT-LAMP反应产物，出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内；以PRRSV基因组、JEV基因组、PCV-2基因组、PRV基因组和猪传染性胸膜肺炎基因组分别为模板得到RT-LAMP反应产物，仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。使用琼脂糖凝胶电泳（需时60min）的检测结果（图3）如下：只有以CSFV石门株基因组为模板的RT-LAMP反应产物和以CSFV疫苗株基因组为模板的RT-LAMP反应产物有目的基因条带。结果显示检测体系的特异性良好，可特异地检测到猪瘟病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。
从250μL猪瘟石门株病毒中提取病毒总RNA，在紫外分光光度计上测定其RNA含量（100ng/μL），并制备10ng/μL的标准品。将RNA标准品进行10倍梯度稀释，将稀释后的样品分别进行RT-LAMP反应（反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）、钙黄绿素法可视化RT-LAMP反应（在表2的反应体系中再加入钙黄绿素（Calcein）和MnCl2，各自的终浓度分别为25μmol/L和0.5mmol/L，模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）。RT-PCR所使用的引物是
P1:5’-CCTGAGGACCAAACACATGTTG-3’
P2:5’-TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG-3’。
取10倍梯度稀释的RNA溶液10μL，置于经DEPC处理过的离心管中，再依次加入反转录的其它成分进行反转录。具体反转录体系如表3所示：
表3
混匀后使用LX-100手掌型离心机瞬时离心，使液体集中于管底，置42℃水浴中，反应1小时。
反转录结束后，以该cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR，具体体系如表4所示：
表4
PCR程序如下：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃45s为一个循环，运行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
比较RT-LAMP核酸试纸条检测试剂盒、钙黄绿素法可视化RT-LAMP、RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR琼脂糖凝胶电泳四种检测方法的灵敏度。结果如图4所示，RT-LAMP核酸试纸条检测试剂盒与RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳检测和钙黄绿素法可视化RT-LAMP限一致，比RT-PCR琼脂糖凝胶电泳方法对CSFV基因组RNA的灵敏度高10倍（即检测限低10倍），最低可以检测到30pg的CSFV RNA。可见，本发明提供的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒更加灵敏，操作更加简单，而且用时更短，结果比较直观，易于检测，无需电泳。
4、检测体系的结果鉴定
①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。证明所检测的样本没有猪瘟病毒感染；
②阳性（＋）：出现两条红色条带。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。证明所检测的样本为猪瘟病毒感染。
③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-GGAAAGGGCAAAGAGGCA-3’；
B3:5’-CGAGAGCCCTTTCTGTGATC-3’；
FIP:5’-CCTCGCAGAAGGCGTAAACCAT-GTGGACAACCTGACACAAGC-3’；
BIP:5’-ACGGGAGTACCCTACAAGAGCT-AACCATCATCCCCGCACA-3’；
LoopB：5’-FITC-GACAGGGTGGCAAAAATTCATG-3’；
Probe：5’-CCACGGGAGTACCCTACAAGAG-Biotin-3’。
2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。
3.根据权利要求2所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。
4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液和AMV逆转录酶。
5.根据权利要求4所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含浓度为5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO4溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的探针和浓度为10μmol/L的引物LoopB。
6.权利要求1～5任一项所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤：
(1)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液为1倍、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4～0.6mmol/L、甜菜碱为1～2mol/L、MgSO4为0～3mmol/L、FIP引物为1.6μmol/L、BIP引物为1.6μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、探针Probe为1.2μmol/L、LoopB引物为1.2μmol/L，待测样品RNA为12ng/μL；恒温反应；
(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；
(3)结果判读：直接肉眼判读
①阴性：仅在质控区出现一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪瘟病毒感染；
②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为猪瘟病毒感染；
③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效；
所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用用于非疾病诊断目的。
7.根据权利要求6所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：
步骤(1)中所述的dNTP混合物的终浓度为0.5mmol/L；
步骤(1)中所述的甜菜碱的终浓度为1.5mol/L；
步骤(1)中所述的MgSO4的终浓度为3mmol/L；
步骤(2)中所述的恒温反应的时间为30～60min。
8.根据权利要求6所述的检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的恒温反应的条件为60℃反应50min。
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