CN101629215A

CN101629215A - 一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN101629215A
Application number: CN200910047186A
Authority: CN
Inventors: 曹广文; 李淑华; 刘世建; 常文军; 张宏伟
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2010-01-20

Abstract

本发明涉及一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒，由主反应液和特异性引物组成。主反应液包括反应缓冲液、禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶、核酸酶抑制剂、Bst DNA聚合酶、dNTP、硫酸镁、酣菜碱、焦碳酸二乙脂和处理水；特异性引物包括特异性扩增乙脑病毒引物、特异性扩增登革病毒引物和特异性扩增西尼罗病毒引物。本发明用环介导等温扩增技术，设计高度特异性引物，快速检测3种黄病毒，达到高效特异性扩增的目的。本发明提供了检测方法，利用紫外－可见光分光光度计检测反应体系的吸光度值，间接反应目的基因的DNA扩增情况。适于基层和现场快速检测，有较大的应用价值。

Description

一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物试剂，具体涉及检测临床样品中乙型脑炎的病毒(JEV)，登革病毒(DEV)及西尼罗病毒(WNV)存在的方法及试剂盒。特别涉及一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒及其检测方法。

背景技术

黄病毒科中多种病毒能引起人类和动物的严重疾病，特别是脑炎和出血热，有较高的死亡率。该类病毒感染的临床表现比较复杂，常常被误诊或冠以“无名热”。目前常见的黄病毒感染为登革热和乙型脑炎，可能还会有新的黄病毒出现，如西尼罗病毒目前在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，带来突发传染病的严重威胁，可预见的后果非常严重。因此有必要进行完善的技术储备，加强突发传染病病原体来源追踪和早期快速侦检研究对及时控制急性传染病疫情和生物灾难意义重大，但目前对于这些疾病的早期快速诊断尚无完善的方法。

1.流行性乙型脑炎(乙脑)病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)，有包膜的单正链RNA病毒，三带喙库蚊为主要传播媒介，主要在亚洲流行，可引起严重的神经系统传染病，致死率高达30％左右；另有50％的患者会留下永久性的神经系统后遗症。据统计，亚洲每年乙脑发病人数达16 000例左右，死亡5 000例左右，中国除新疆、西藏、青海外，其它各省均有发病与流行，脑炎发病数占世界总发病数的80％以上，是危害人民生命及畜牧业的最重要的虫媒病毒之一，近年澳大利亚本土和美国的关岛地区也出现乙脑病例，说明该病的流行区域在不断扩大，成为严重的公共卫生问题。加强监测和诊断是十分重要的。

乙型脑炎病例的诊断主要依靠流行病学、临床特征和实验室检查三方面证据。实验室检查主要有血清学诊断、分离培养和分子生物学方法，然而，主要针对抗体的血清学诊断方法不能在疾病早期提供有力的诊断证据。不利于病人的早期诊断和治疗。病毒分离培养方法耗时、费力，检出率低。RT-PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使用受到限制。实时荧光定量PCR技术虽然具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。但由于实验成本高，使用仪器精良而不宜在基层和现场使用。

2.登革病毒(dengue virus，DV)属黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)，根据抗原性不同，可将登革病毒分为1、2、3、4四个血清型。登革病毒感染(dengue virus infect，DVI)可引起登革热(dengue fever，DF)和登革出血热(dengue hemorrhage fever，DHF)，后者死亡率较高。登革热是一种热带传染病，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，其传染性仅次于艾滋病和非典。近年来，登革热广泛流行于100多个国家和地区，特别是东南亚一带的流行甚为严重。据世界卫生组织报道，每年约有0.8～1亿例DVI，50万例DHF，2.5万人死亡，15亿人受到威胁。由于登革热临床表现复杂多样、传播迅速、发病率高、人群易感染，严重影响了人们的生活质量和身体健康。由于登革热没有特异性的治疗方法，也没有有效的疫苗进行预防，因此及时发现登革热疫情、阻止或减少本地登革热疫情传播就变得尤为重要。研究快速检测方法在登革热的预防和控制中具有重要意义。

目前，登革病毒感染的诊断，主要依靠病毒分离和血清学检测。但病毒分离法费时繁琐、至少需1周时间才能出结果，达不到早期快速诊断的目的。血清学诊断因与其他黄病毒存在广泛的交叉反应而受到干扰。近年来，随着分子生物学技术的不断发展与完善，以及技术服务市场化，对登革病毒感染的诊断，已经从传统的病毒分离、血清学检查，进入到对病毒RNA进行分子检测的新阶段，为登革热早期诊断和流行监测提供了有效手段，如RT-PCR，nested-PCR，Real-time PCR，TaqMan探针，基因芯片等，但这些技术方法可能出现假阳性，并由于检测烦琐，成本高，实验室及仪器设备要求精良等，不适宜在基层和现场使用。

3.西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)，为西尼罗病毒病病原体。西尼罗病毒是以鸟类为主要宿主，经库蚊等嗜鸟蚊传播的虫媒病毒，可引起人和马的西尼罗脑炎。该病毒广泛分布于非洲、中东、欧亚大陆及澳大利亚，近期又传人北美。特别是在美国，自1999年发现首例患者以来，西尼罗脑炎已连续流行5个季节，发病人数逐年攀升。西尼罗病毒病目前在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，加拿大和欧洲一些国家相继出现了人感染而死于西尼罗脑炎的报道。西尼罗病毒病的危害已迫使各有关国家加大了对其研究的力度。因此开展WNV相关研究，建立WNV快速检测方法，对于WNV控制流行意义重大。

目前，已初步建立了一系列针对WNV的检测方法，PCR、TaqMan RT-PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)、SYBR Green RT-PCR等核酸检测以及病毒分离、血清学分析等，核酸检测、活病毒分离培养等方法较成熟，但这些方法耗时较长，不能在短时间内进行快速检测和大范围筛查，使WNV的早期监测受到了影响。

环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal amplification，LAMP)技术是近年来建立的一种快速检测方法。具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其原理是针对靶基因的6个部位设定3对引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增((图1，图2)。最终产物形成不同柄-环结构的DNAs和不同分子量的如菜花样的多环产物(电泳结果如图3)。扩增效率较PCR大大提高(目的基因每半个循环被放大3倍)，可以扩增几个拷贝数的目的基因，检测的灵敏度是常规PCR的10-100倍(图4)。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及现场快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，利用LAMP反应原理研究设计快速，特异，灵敏，简便的相关黄热病毒的检测方法及所使用的试剂盒。

本发明提供了一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒。

本发明试剂盒由主反应液和特异性引物组成：

(1)主反应液的组成：

10×等温反应缓冲液(Buffer)、浓度为5U/μl的禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV)、浓度为40U/μl的核酸酶抑制剂(Rnasin))、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶、浓度为10mM的dNTP、浓度为100mM的硫酸镁(MgSO4)、和浓度为5M的酣菜碱(betaine)和1.25μl焦碳酸二乙脂(DEPC)处理水，总体积量为16μl。

其中：

10×等温反应缓冲液含有浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(200mM Tris-HCl，pH 8.8)、浓度为100mM的氯化钾(100mM KCl)、浓度为100mM硫酸按(100mM(NH4)2SO4)、浓度为20mM的硫酸镁(20mM MgSO4)和浓度为1％的曲拉通X-100(1％ Triton X-100)。

(2)特异性引物：特异性引物1，特异性引物2，特异性引物3。每组特异性引物都共有3对引物，它们分别为内引物1(Forward internal primer，FIP)和内引物2(Backward internal primer，BIP)；外引物1(Forward outer primer，F3)和外引物2(Backward outer primer，B3)；环引物1(Forward loop primer，FLP)和环引物2(Backward loop primer，BLP)

特异性引物1为特异性扩增乙脑病毒引物(PJEV)；

特异性引物2为特异性扩增登革病毒引物(PDV)，包括特异性扩增I型登革病毒引物(PDV1)，II型登革病毒引物(PDV2)，III型登革病毒引物(PDV3)，IV型登革病毒引物(PDV4)。

特异性引物3为特异性扩增引物西尼罗病毒引物(PWNV)。

所述各引物浓度及序列分别如下：

1)特异性引物1(乙脑病毒特异引物PJEV)：包括20μM乙脑病毒内引物1(PJEVFIP)，20μM乙脑病毒内引物2(PJEVBIP)，10μM乙脑病毒外引物1(PJEVF3)，10μM乙脑病毒外引物2(PJEVB3)，20μM乙脑病毒环引物1(PJEVFLP)，20μM乙脑病毒环引物2(PJEVBLP)总体积量为7μl。

PJEV包括：

PJEVFIP：GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTG

PJEVBIP：AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTG

PJEVF3：GGAATGGGCAATCGTGACT

PJEVB3：CGTTGTGAGCTTCTCCAGT

PJEVFLP：TCGTTTGCCATGATTGTC

PJEVBLP：GAAGTTACTGCTATCATGCT

2)特异性引物2(登革病毒特异引物PDV)：包括I型登革病毒引物(PDV1)，II型登革病毒引物(PDV2)，III型登革病毒引物(PDV3)，IV型登革病毒引物(PDV4)。

I型登革病毒引物PDV1包括20μM I型登革病毒内引物1(PDV1FIP)，20μMI型登革病毒内引物2(PDV1BIP)，10μM I型登革病毒外引物1(PDV1F3)，10μMI型登革病毒外引物2(PDV1B3)，20μM I型登革病毒环引物1(PDV1FLP)和20μM I型登革病毒环引物2(PDV1BLP)，总体积量为7μl。

II型登革病毒引物PDV2包括20μMII型登革病毒内引物1(PDV2FIP)，20μMII型登革病毒内引物2(PDV2BIP)，10μM II型登革病毒外引物1(PDV2F3)，10μMII型登革病毒外引物2(PDV2B3)，20μMII型登革病毒环引物1(PDV2FLP)和20μMII型登革病毒环引物2(PDV2BLP)，总体积量为7μl。

III型登革病毒引物PDV3包括20μMIII型登革病毒内引物1(PDV3FIP)，20μMIII型登革病毒内引物2(PDV3BIP)，10μMIII型登革病毒外引物1(PDV3F3)，10μMIII型登革病毒外引物2(PDV3B3)，20μMIII型登革病毒环引物1(PDV3FLP)和20μMIII型登革病毒环引物2(PDV3BLP)，总体积量为7μl。

IV型登革病毒引物PDV4包括20μMIV型登革病毒内引物1(PDV4FIP)，20μMIV型登革病毒内引物2(PDV4BIP)，10μMIV型登革病毒外引物1(PDV4F3)，10μMIV型登革病毒外引物2(PDV4B3)，20μMIV型登革病毒环引物1(PDV4FLP)和20μMIV型登革病毒环引物2(PDV4BLP)，总体积量为7μl。

PDV1包括：

PDV1FIP：GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGC

PDV1BIP：CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGG

PDV1FLP：CTCCTCTAACCACTAGTC

PDV1BLP：GGTGGTAAGGACTAGAGG

PDV1F3：GAGGCTGCAAACCATGGAA

PDV1B3；CAGCAGGATCTCTGGTCTCT

PDV2包括：

PDV2FIP：TTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGG

PDV2BIP：GGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGG

PDV2FLP：GATCTGTAAGGGAGGGG

PDV2BLP：GCATATTGACGCTGGGA

PDV2F3：TGGAAGCTGTACGCATGG

PDV2B3：GTGCCTGGAATGATGCTG

PDV3包括：

PDV3FIP：TGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTG

PDV3BIP：CTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGC

PDV3FLP：CCTTGGACGGGGCT

PDV3BLP：GGAGGCTGCAAACCGTG

PDV3F3：GCCACCTTAAGCCACAGTA

PDV3B3：GTTGTGTCATGGGAGGG

PDV4包括：

PDV4FIP：TGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACC

PDV4BIP：GGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCG

PDV4FLP：GGCGGAGCTACAGGCAG

PDV4BLP：TCACCAACAAAACGCAG

PDV4F3：CTATTGAAGTCAGGCCAC

PDV4B3：ACCTCTAGTCCTTCCACC

3)特异性引物3(西尼罗病毒特异引物PWNV)：包括20μM西尼罗病毒内引物1(PWNVFIP)，20μM西尼罗病毒内引物2(PWNVBIP)，10μM西尼罗病毒外引物1(PWNV F3)，10μM西尼罗病毒外引物2(PWNVB3)，20μM西尼罗病毒环引物1(PWNVFLP)，20μM西尼罗病毒环引物2(PWNVBLP)。总体积量为7μl。

PWNV包括：

PWNVFIP TTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGT

PWNVBIP TGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG

PWNVFLP CATCGATGGTAGGCTTGTC

PWNVBLP TCTCCACCAAAGCTGCGT

PWNVF3 TGGATTTGGTTCTCGAAGG

PWNVB3 GGTCAGCACGTTTGTCATT

其中，主反应液最佳组成是：2.5μl 10×Buffer，1.0μl AMV(5U/μl)，0.25μl Rnasin(40U/μl)，2.0μl Bst DNA聚合酶(8U/μl)，3.5μl 10mM dNTP，1.5μl 100mM的MgSO4，4.0μl 5M的betaine和1.25μl DEPC处理水。总体积量为16μl。

特异性引物的最佳组成包括：

特异性引物1(乙脑病毒特异引物PJEV)最佳组成为：2μl 20μM内引物PJEVFIP，2μl 20μM内引物PJEVBIP，0.5μl10μM外引物PJEVF3，0.5μl 10μM外引物PJEVB3，1.0μl 20μM环引物PJEVFLP和1.0μl 20μM环引物PJEVBLP。总体积量为7μl。

特异性引物2(登革病毒特异引物PDV)最佳组成为：包括

I型登革病毒引物PDV1最佳组成为：2μl 20μM内引物PDV1FIP，2μl20μM内引物PDV1BIP，0.5μl 10μM外引物PDV1F3，0.5μl 10μM外引物PDV1B3，1.0μl 20μM环引物PDV1FLP和1.0μl 20μM环引物PDV1BLP。总体积量为7μl。

II型登革病毒引物PDV2最佳组成为：2μl 20μM内引物PDV2FIP，2μl20μM内引物PDV2BIP，0.5μl 10μM外引物PDV2F3，0.5μl 10μM外引物PDV2B3，1.0μl 20μM环引物PDV2FLP和1.0μl 20μM环引物PDV2BLP。总体积量为7μl。

III型登革病毒引物PDV3最佳组成为：2μl 20μM内引物PDV3FIP，2μl20μM内引物PDV3BIP，0.5μl 10μM外引物PDV3F3，0.5μl 10μM外引物PDV3B3，1.0μl 20μM环引物PDV3FLP和1.0μl 20μM环引物PDV3BLP。总体积量为7μl。

IV型登革病毒引物PDV4最佳组成为：2μl 20μM内引物PDV4FIP，2μl 20μM内引物PDV4BIP，0.5μl 10μM外引物PDV4F3，0.5μl 10μM外引物PDV4B3，1.0μl 20μM环引物PDV4FLP和1.0μl 20μM环引物PDV4BLP。总体积量为7μl。

特异性引物3(西尼罗病毒特异引物PWNV)最佳组成为：2μl 20μM内引物PWNVFIP，2μl 20μM内引物PWNVBIP，0.5μl 10μM外引物PWNVF3，0.5μl10μM外引物PWNVB3，1.0μl 20μM环引物PWNVFLP和1.0μl 20μM环引物PWNVBLP。总体积量为7μl。

本发明提供了联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒的检测方法与结果判定：具体步骤如下：

(一)样品中RNA的提取

1)病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取RNA：在装有250μl细胞培养上清液的1.5ml Eppendorf管中加入750μlLS Reagen(invitrogen)漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2-15min，4℃12000r/min离心15min；小心取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μl Nuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用

2)组织样品中提取RNA：取-70℃冷冻的样品组织标本室温下加入Reagen(invitrogen)，在研钵中研磨(100mg组织样品加2mlTRIzol，研钵使用前要用DEPC水处理)，匀浆加入1.5mlEppendorf管中，室温放置5min，加入200μl/mlTRIzo氯仿，用力振荡3-5min，室温静置15min，4℃12000r/min离心15min；取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl/mlTRIzo异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml/mlTRIzo洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μl Nuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用。

(二)环介导等温扩增：

在装有16μl主反应液A和7μl特异性引物P的反应管中，加入2μl待检RNA，充分混合后，于63℃恒温水浴箱中放置30分钟。同时设立RNA阴性对照。总反应体系为25μl，各成分如下：

成分用量终浓度

特异性引物： FIP(20μM) 2μl 40pmol

BIP(20μM) 2μl 40pmol

F3(10μM) 0.5μl 5pmol

B3(10μM) 0.5μl 5pmol

FLP(20μM) 1μl 20pmol

BLP(20μM) 1μl 20pmol

主反应液： 10×Buffer 2.5μl 1×

dNTP(10mM) 3.5μl 1.4mM

MgSO4(100mM) 1.5μl 6mM

Betaine(5M) 4.0μl 0.8mM

AMV(5U/μl) 1.0μl 5U

Bst DNA聚合酶(8U/μl) 2.0μl 16U

Rnasin(40U/μl) 0.25μl 10U

H2O 1.25μl

检测RNA： 2μl

25μl

三、扩增产物的检测：

紫外-可见分光光度计400nm波长检测最终反应体系的吸光度(OD)值。步骤如下：

1)开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm，

2)用DEPC处理水调节零和调百，向比色皿中加入99μlDEPC处理水和1μl待检样品(样品要充分漩涡混匀)，读取的吸光度值/100即为样品的检测OD值。

四、结果判定：

测定管吸光度(OD)＞0.4为结果判定阳性。RNA阴性对照管吸光度OD值为0.2.通常以OD值超过阴性对照OD值2倍以上的者为判定阳性。

上述发明基于以下试验：

1)LAMP反应中焦磷酸镁生成量的检测：根据LAMP反应DNA扩增的同时产生大量焦磷酸镁(Magnesium Pyrophosphate)的原理，反应体系呈现一定的混浊度，因此可以通过检测浊度即焦磷酸镁盐的吸光度OD值(吸收波长400nm)间接反应DNA的扩增情况。

方法：将已知病毒的RNA作10²倍比稀释(10^-1 10^-3 10^-5 10^-7 10^-9 10^-11 10^-13 10^-15)，取16μl的主反应液和7μl的特异性引物混合，各管分别加入经10²倍比稀释的不同浓度的RNA 2μl，总体积为25μl，混匀后置于63℃恒温水浴箱中放置60分钟，利用紫外-可见光分光光度计检测反应体系的OD值，每隔5分钟检测一次，每个时间点设计3个平行管，取各时间点3个平行管OD值的平均值计为检测结果。同时设立RNA阴性对照。(检测结果见图5，图7，图9)

2)LAMP反应real-time(染料荧光强度)检测：SYBR Green I荧光染料与双链DNA结合后，能产生增强的荧光信号，在real-time扩增仪上，SYBR Green I的荧光可被实时检测，因此通过检测SYBR Green I的荧光信号强度反应LAMP反应中DNA的扩增情况。

方法：按上述方法配制25μl不同RNA浓度(10^-1 10^-3 10^-5 10^-7 10^-9 10^-11 10^-13 10^-15)的LAMP反应体系，各体系中分别加入1μl 20× SYBR Green I染料(使用浓度为0.8×)，每个浓度作3个平行孔，放入Real-time仪中(Rochelightcycler 480)，63℃ for 60min(每间隔1分钟为1个循环)。收集检测各时间点的荧光信号强度。同时设立RNA阴性对照。(检测结果见图6，图8，图10)3)同一反应体系中OD值与荧光值检测结果相关性分析

将同一RNA浓度相同时间点LAMP反应体系中吸光度的检测结果(OD值)与real-time检测结果(染料荧光强度)进行相关性分析，若两者存在数量上的相关关系，可以通过对反应体系OD值的检测间接反应DNA的扩增情况。(结果见表1，表2，图11，图12，图13，图14，图15，图16)

结果表明①3中黄热病毒RNA的LAMP扩增中，各个时间点吸光度(OD值)的检测结果(反应浊度变化)与同一时间点real-time两种荧光染料的检测结果(DNA的生成量)呈现高度的线性相关性，相关系数r在0.90以上。因此可以通过检测反应产物中浊度的变化间接反应LAMP的扩增情况。②所有不同浓度的RNA阳性的病毒在LAMP反应进行30分钟内均出现明显的扩增，OD≥0.4，RNA阴性对照的平均OD值为0.2。③以检测样品吸光度超出阴性对照吸光度2倍以上者为检测结果阳性，考虑到所用样本LAMP反应出现阳性的时间(the time ofpositivity，Tp)均在30分钟内，规定LAMP反应阳性结果的CUTOFF值为：LAMP反应进行30分钟内，检测样品的OD值＞0.4以上者为结果阳性。

表1 3种黄病毒(RAN 10^-1)LAMP反应紫外-可见光分光光度计吸光度检测结果

表2 3种黄病毒(RAN 10^-1)LAMP反应real-time荧光检测结果

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属锅或水浴箱即可，结果不必用凝胶电泳方法或使用荧光染料来观察，只需用普通的分光光度计即可，快速、准确性高、灵敏性好、应用方便，可广泛应用于医疗卫生、出入境检疫等领域。

本发明的流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒联合检测试剂盒不仅适用于病人的诊断，还适用于对蚊体内病毒的检测。对于了解蚊体内病毒的携带情况以及可携带和传播病毒的蚊种具有重要意义。

附图说明

图1：LAMP反应原理

图2：LAMP反应引物设计

图3：LAMP反应结果电泳图(shows a ladder-like pattern，Lanes：M，100-bpDNA ladder；1，10,000PFU；2，1,000PFU；3，100PFU；4，10PFU；5，1PFU；6，0.1PFU；7，0.01PFU；8，0.001PFU；9，0.0001PFU；10，0PFU)

图4：常规PCR反应结果电泳图(shows a 201-bp amplification product.Lanes：M，100-bp DNA ladder；1，10,000PFU；2，1,000PFU；3，100PFU；4，10PFU；5，1PFU；6，0.1PFU；7，0.01PFU；8，0.001PFU；9，0.0001PFU；10，0PFU)

图5：乙脑病毒LAMP反应OD值检测(图中A：RNA10^-1，B：RNA10^-3，C：RNA10^-3，D：RNA10^-7，E：RNA10^-9，F：RNA10^-11，G：RNA10^-13，H：RNA10^-15，I：RNA(-))

图6：乙脑病毒LAMP反应real-time检测

图7：登革病毒LAMP反应OD值检测(图中A：RNA10^-1，B：RNA10^-3，C：RNA10^-3，D：RNA10^-7，E：RNA10^-9，F：RNA10^-11，G：RNA10^-13，H：RNA10^-15，I：RNA(-))

图8：登革病毒LAMP反应real-time检测

图9：西尼罗病毒LAMP反应OD值检测(图中A：RNA10^-1，B：RNA10^-3，C：RNA10^-3，D：RNA10^-7，E：RNA10^-9，F：RNA10^-11，G：RNA10^-13，H：RNA10^-15，I：RNA(-))

图10：西尼罗病毒LAMP反应real-time检测

图11：乙脑病毒LAMP反应OD值与real-time检测相关性(r＝0.970，p＜0.001)

图12：I登革病毒LAMP反应OD值与real-time检测值相关性(r＝0.983，p＜0.001)

图13：II登革病毒LAMP反应OD值与real-time检测值相关性(r＝0.997，p＜0.001)

图14：III登革病毒LAMP反应OD值与real-time检测值相关性(r＝0.975，p＜0.001)

图15：IV登革病毒LAMP反应OD值与real-time检测值相关性(r＝0.980，p＜0.001)

图16：西尼罗病毒LAMP反应OD值与real-time检测值相关性(r＝0.996，p＜0.001)

具体实施方式

实施例1

按下列配方制作流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒联合快速检测的LAMP试剂盒：

(1)16μl主反应液：2.5μl 10×Buffer，1.0μl AMV(5U/μl)，0.25μlRnasin(40U/μl)，2.0μl Bst DNA聚合酶(8U/μl)，3.5μl 10mM dNTP，1.5μl100mM的MgSO4，4.0μl 5M的betaine和1.25μl DEPC处理水总体积量为16μl。

其中：

(2)特异性引物：包括特异性扩增乙脑病毒，登革病毒，西尼罗病毒的LAMP特异性引物PJEV，PDV(包括PDV1，PDV2，PDV3，PDV4)和PWNV。

PJEV引物组成为：2μl 20μM内引物PJEVFIP，2μl 20μM内引物PJEVBIP，0.5μl 10μM外引物PJEVF3，0.5μl 10μM外引物PJEVB3，1.0μl 20μM环引物PJEVFLP，1.0μl 20μM环引物PJEVBLP。总体积量为7μl。

PDV1引物组成为：2μl 20μM内引物PDV1FIP，2μl 20μM内引物PDV1 BIP，0.5μl 10μM外引物PDV1F3，0.5μl 10μM外引物PDV1B3，1.0μl 20μM环引物PDV1FLP，1.0μl 20μM环引物PDV1BLP。总体积量为7μl。

PDV2引物组成为：2μl 20μM内引物PDV2FIP，2μl 20μM内引物PDV2BIP，0.5μl 10μM外引物PDV2F3，0.5μl 10μM外引物PDV2B3，1.0μl 20μM环引物PDV2FLP，1.0μl 20μM环引物PDV2BLP。总体积量为7μl。

PDV3引物组成为：2μl 20μM内引物PDV3FIP，2μl 20μM内引物PDV3BIP，0.5μl 10μM外引物PDV3F3，0.5μl 10μM外引物PDV3B3，1.0μl 20μM环引物PDV3FLP，1.0μl 20μM环引物PDV3BLP。总体积量为7μl。

PDV4引物组成为：2μl 20μM内引物PDV4FIP，2μl 20μM内引物PDV4BIP，0.5μl 10μM外引物PDV4F3，0.5μl 10μM外引物PDV4B3，1.0μl 20μM环引物PDV4FLP，1.0μl 20μM环引物PDV4BLP。总体积量为7μl。

PWNV引物组成为：2μl 20μM内引物PWNVFIP，2μl 20μM内引物PWNVBIP，0.5μl 10μM外引物PWNVF3，0.5μl 10μM外引物PWNVB3，1.0μl 20μM环引物PWNVFLP，1.0μl 20μM环引物PWNVBLP。总体积量为7μl。各引物序列分别如下：

1)PJEV：

PJEVFIP：GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTG

PJEVBIP：AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTG

PJEVF3：GGAATGGGCAATCGTGACT

PJEVB3：CGTTGTGAGCTTCTCCAGT

PJEVFLP：TCGTTTGCCATGATTGTC

PJEVBLP：GAAGTTACTGCTATCATGCT

2)PDV：包括PDV1，PDV2，PDV3，PDV4

PDV1：

PDV1FIP GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGC

PDV1BIP CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGG

PDV1FLP CTCCTCTAACCACTAGTC

PDV1BLP GGTGGTAAGGACTAGAGG

PDV1F3 GAGGCTGCAAACCATGGAA

PDV1B3 CAGCAGGATCTCTGGTCTCT

PDV2：

PDV2FIP TTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGG

PDV2BIP GGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGG

PDV2FLP GATCTGTAAGGGAGGGG

PDV2BLP GCATATTGACGCTGGGA

PDV2F3 TGGAAGCTGTACGCATGG

PDV2B3 GTGCCTGGAATGATGCTG

PDV3：

PDV3FIP TGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTG

PDV3BIP CTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGC

PDV3FLP CCTTGGACGGGGCT

PDV3BLP GGAGGCTGCAAACCGTG

PDV3F3 GCCACCTTAAGCCACAGTA

PDV3B3 GTTGTGTCATGGGAGGG

PDV3：

PDV4FIP TGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACC

PDV4BIP GGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCG

PDV4FLP GGCGGAGCTACAGGCAG

PDV4BLP TCACCAACAAAACGCAG

PDV4F3 CTATTGAAGTCAGGCCAC

PDV4B3 ACCTCTAGTCCTTCCACC

3)PWNV：

PWNVFIP TTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGT

PWNVBIP TGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG

PWNVFLP CATCGATGGTAGGCTTGTC

PWNVBLP TCTCCACCAAAGCTGCGT

PWNVF3 TGGATTTGGTTCTCGAAGG

PWNVB3 GGTCAGCACGTTTGTCATT

实施例2

用本发明试剂盒检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒

一、样品中RNA的提取

1)病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取乙型脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒RNA：

在装有250μl细胞培养上清液的1.5mlEppendorf管中加入750μlLSReagen(invitrogen)漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2-15min，4℃12000r/min离心15min；小心取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μl Nuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用

2)组织样品中提取乙型脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒RNA：取-70℃冷冻的样品组织标本室温下加入Reagen(invitrogen)，在研钵中研磨(100mg组织样品加2mlTRIzol，研钵使用前要用DEPC水处理)，匀浆加入1.5mlEppendorf管中，室温放置5min，加入200μl/mlTRIzo氯仿，用力振荡3-5min，室温静置15min，4℃12000r/min离心15min；小心取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl/mlTRIzo异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml/mlTRIzo洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μlNuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用。

二、环介导等温扩增：

成分用量终浓度

特异性引物P：FIP(20μM)2μl 40pmol

BIP(20μM)2μl 40pmol

F3(10μM) 0.5μl 5pmol

B3(10μM) 0.5μl 5pmol

FLP(20μM) 1μl 20pmol

BLP(20μM) 1μl 20pmol

主反应液A： 10×Buffer 2.5μl 1×

dNTP(10mM) 3.5μl 1.4mM

MgSO4(100mM) 1.5μl 6mM

Betaine(5M) 4.0μl 0.8mM

AMV(5U/μl) 1.0μl 5U

Bst DNA聚合酶(8U/μl) 2.0μl 16U

Rnasin(40U/μl) 0.25μl 10U

H2O 1.25μl

检测RNA： 2μl

25μl

三、扩增产物的检测：

1)开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm，

四、结果判定：

实验结果表明RNA阴性对照管吸光度OD值为0.2.通常以OD值超过阴性对照OD值2倍以上的者为判定阳性。即测定管吸光度(OD)＞0.4为结果判定阳性。

Claims

1、一种联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒试剂盒，其特征在于所述试剂盒由主反应液和特异性引物组成：

所述主反应液的组成：10×等温反应缓冲液、浓度为5U/μl的禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶、浓度为40U/μl的核酸酶抑制剂、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶、浓度为10mM的dNTP、浓度为100mM的硫酸镁、和浓度为5M的酣菜碱和1.25μl焦碳酸二乙脂处理水，总体积量为16μl；

所述特异性引物：包括特异性引物1，特异性引物2，特异性引物3；每组特异性引物都共有3对引物，它们分别为内引物1FIP和内引物2BIP；外引物1F3和外引物2B3；环引物1FLP和环引物2BLP。

2、根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述主反应液的组成为：2.5μl 10×等温反应缓冲液、1.0μl禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶5U/μl，0.25μl核酸酶抑制剂40U/μl，2.0μl Bst DNA聚合酶8U/μl，3.5μl 10mM dNTP，1.5μl 100mM的硫酸镁，4.0μl 5M的酣菜碱和1.25μl焦碳酸二乙脂处理水；总体积量为16μl。

3、根据权利要求2的试剂盒，其特征在于所述主反应液的10×等温反应缓冲液为：浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、浓度为100mM的氯化钾、浓度为100mM硫酸按、浓度为20mM的硫酸镁和浓度为1％的曲拉通X-100。

4、根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述特异性引物1为特异性扩增乙脑病毒引物；特异性引物2为特异性扩增登革病毒引物；特异性引物3为特异性扩增西尼罗病毒引物；所述特异性引物2包括特异性扩增I型登革病毒引物、II型登革病毒引物、III型登革病毒引物，IV型登革病毒引物。

5、根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述特异性引物浓度分别如下：

所述乙脑病毒特异引物PJEV包括20μM内引物1PJEVFIP、20μM内引物2PJEVBIP、10μM外引物1PJEVF3、10μM外引物2PJEVB3，、20μM环引物1PJEVFLP和20μM环引物2PJEVBLP；

所述I型登革病毒引物PDV1包括20μM内引物1PDV1FIP、20μM内引物2PDV1BIP、10μM外引物1PDV1F3、10μM外引物2PDV1B3、20μM环引物1PDV1FLP、20μM环引物2PDV1BLP，总体积量为7μl；

所述II型登革病毒引物PDV2包括20μM内引物1PDV2FIP、20μM内引物2PDV2BIP、10μM外引物1PDV2F3、10μM外引物2PDV2B3、20μM环引物1PDV2FLP、20μM环引物2PDV2BLP，总体积量为7μl；

所述III型登革病毒引物PDV3包括20μM内引物1PDV3FIP、20μM内引物2PDV3BIP、10μM外引物1PDV3F3、10μM外引物2PDV3B3、20μM环引物1PDV3FLP、20μM环引物2PDV3BLP，总体积量为7μl；

所述IV型登革病毒引物PDV4包括20μM内引物1PDV4FIP、20μM内引物2PDV4BIP、10μM外引物1PDV4F3、10μM外引物2PDV4B3、20μM环引物1PDV4FLP、20μM环引物2PDV4BLP，总体积量为7μl；

所述西尼罗病毒特异引物PWNV包括20μM内引物1PWNVFIP、20μM内引物2PWNVBIP、10μM外引物1PWNV F3、10μM外引物2PWNVB3、20μM环引物1PWNVFLP、20μM环引物2PWNVBLP，总体积量为7μl。

6、根据权利要求1的试剂盒，其特征在于所述特异性引物的组成为：

所述乙脑病毒特异引物PJEV组成为：2μl 20μM内引物PJEVFIP、2μl20μM内引物PJEVBIP、0.5μl 10μM外引物PJEVF3、0.5μl 10μM外引物PJEVB3、1.0μl 20μM环引物PJEVFLP和1.0μl 20μM环引物PJEVBLP，总体积量为7μl；

登革病毒I型引物PDV1组成为：2μl 20μM内引物PDV1FIP、2μl 20μM内引物PDV1BIP、0.5μl 10μM外引物PDV1F3、0.5μl 10μM外引物PDV1B3、1.0μl 20μM环引物PDV1FLP和1.0μl 20μM环引物PDV1BLP，总体积量为7μl；

登革病毒II型引物PDV2组成为：2μl 20μM内引物PDV2FIP、2μl 20μM内引物PDV2BIP、0.5μl 10μM外引物PDV2F3、0.5μl 10μM外引物PDV2B3、1.0μl 20μM环引物PDV2FLP和1.0μl 20μM环引物PDV2BLP，总体积量为7μl；

登革病毒III型引物PDV3组成为：2μl 20μM内引物PDV3FIP、2μl 20μM内引物PDV3BIP、0.5μl 10μM外引物PDV3F3、0.5μl 10μM外引物PDV3B3、1.0μl 20μM环引物PDV3FLP和1.0μl 20μM环引物PDV3BLP，总体积量为7μl；

登革病毒IV型引物PDV4组成为：2μl 20μM内引物PDV4FIP、2μl 20μM内引物PDV4BIP、0.5μl 10μM外引物PDV4F3、0.5μl 10μM外引物PDV4B3、1.0μl 20μM环引物PDV4FLP和1.0μl 20μM环引物PDV4BLP，总体积量为7μl；

西尼罗病毒特异引物PWNV组成为：2μl 20μM内引物PWNVFIP、2μl20μM内引物PWNVBIP、0.5μl 10μM外引物PWNVF3、0.5μl 10μM外引物PWNVB3、1.0μl 20μM环引物PWNVFLP和1.0μl 20μM环引物PWNVBLP，总体积量为7μl。

7、根据权利要求1、4、5或6的试剂盒，其特征在于所述特异性引物序列分别如下：

所述PJEV包括：

PJEVFIP：GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTG

PJEVBIP：AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTG

PJEVF3： GGAATGGGCAATCGTGACT

PJEVB3： CGTTGTGAGCTTCTCCAGT

PJEVFLP：TCGTTTGCCATGATTGTC

PJEVBLP：GAAGTTACTGCTATCATGCT

所述PDV1包括：

PDV1FIP GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGC

PDV1BIP CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGG

PDV1FLP CTCCTCTAACCACTAGTC

PDV1BLP GGTGGTAAGGACTAGAGG

PDV1F3 GAGGCTGCAAACCATGGAA

PDV1B3 CAGCAGGATCTCTGGTCTCT

所述PDV2包括：

PDV2FIP TTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGG

PDV2BIP GGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGG

PDV2FLP GATCTGTAAGGGAGGGG

PDV2BLP GCATATTGACGCTGGGA

PDV2F3 TGGAAGCTGTACGCATGG

PDV2B3 GTGCCTGGAATGATGCTG

所述PDV3包括：

PDV3FIP TGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTG

PDV3BIP CTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGC

PDV3FLP CCTTGGACGGGGCT

PDV3BLP GGAGGCTGCAAACCGTG

PDV3F3 GCCACCTTAAGCCACAGTA

PDV3B3 GTTGTGTCATGGGAGGG

所述PDV4包括：

PDV4FIP TGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACC

PDV4BIP GGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCG

PDV4FLP GGCGGAGCTACAGGCAG

PDV4BLP TCACCAACAAAACGCAG

PDV4F3 CTATTGAAGTCAGGCCAC

PDV4B3 ACCTCTAGTCCTTCCACC

所述PWNV包括：

PWNVFIP TTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGT

PWNVBIP TGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG

PWNVFLP CATCGATGGTAGGCTTGTC

PWNVBLP TCTCCACCAAAGCTGCGT

PWNVF3 TGGATTTGGTTCTCGAAGG

PWNVB3 GGTCAGCACGTTTGTCATT。

8.一种如权利要求1所述联合快速检测流行性乙型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

一、样品中RNA的提取

1)病人血清样本及细胞培养上清和鼠脑脊液中提取RNA：在装有250μl细胞培养上清液的1.5mlEppendorf管中加入750μl

LS Reagen漩涡混合器混匀；在该Eppendorf管中加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2-15min，4℃12000r/min离心15min；小心取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μl Nuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用；

2)组织样品中提取RNA：取-70℃冷冻的样品组织标本室温下加入

Reagen，在研钵中研磨100mg组织样品加2mlTRIzol，研钵使用前用DEPC水处理，匀浆加入1.5mlEppendorf管中，室温放置5min，加入200μl/mlTRIzo氯仿，用力振荡3-5min，室温静置15min，4℃12000r/min离心15min；小心取上层无色水相转移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500μl/mlTRIzo异丙醇，漩涡混合器混匀，室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC处理的去离子水配置的75％乙醇1ml/mlTRIzo洗涤所得RNA沉淀，4℃7500r/min离心5min，弃上清，室温静置5-10min，使乙醇挥发；用20μl Nuclease-Free Water溶解RNA沉淀，保存备用；

二、环介导等温扩增：

在装有16μl主反应液A和7μl特异性引物P的反应管中，加入2μl待检RNA，于63℃恒温水浴箱中放置30分钟。同时设立RNA阴性对照；

总反应体系为25μl，各成分如下：

三、扩增产物的检测：

紫外-可见分光光度计400nm波长检测最终反应体系的吸光度OD值，步骤如下：

1)开机，仪器自检结束后，选择检测波长400nm，

2)用DEPC处理水调节零和调百，向比色皿中加入99μlDEPC处理水和1μl待检样品样品充分漩涡混匀，读取的吸光度值/100即为样品的检测OD值；

四、结果判定：

测定管吸光度＞0.4为结果判定阳性。